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摘要 [目的] 通过研究高压电晕电场诱变对出芽短梗霉多糖产量的影响，筛选出高产优质的出芽短梗霉菌株。[方法] 采用高压电晕电场对出芽短梗霉进行诱变，在临界放电电压下诱变不同时间，测定出芽短梗霉的性状和多糖产量的变化。[结果] 在临界放电电压4.4 kV下的最佳诱变时间是60 min； 经过2次连续诱变，多糖产量达到9.57 g/L，是原始菌株的3倍多，发酵液颜色为米白色，最终pH为4.2左右； 连续传代培养10代，其生状和产量无明显变化，传代稳定。[结论]高压电晕电场对出芽短梗霉菌的普鲁兰产量提高有显著作用。
关键词 出芽短梗霉；高压电晕电场；普鲁兰
中图分类号 S12 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）17-003-02
Abstract [Objective] The effects of corona treatment on pullulan production were studied to screen Aureobasidium pullulans with high yield and good quality. [Method] Using mutagenesis of Aureobasidium pullulans by corona， different time at the critical discharge voltage was processed，and the change of Aureobasidium pullulans traits and yield of polysaccharides were determined.[Result] The best mutation time in critical voltage 4.4 kV was 60 min. After two consecutive mutagenesises， the polysaccharide production reached 9.57 g/L， more than three times of the original strain. Fermentation liquor color was white， and the final pH was about 4.2. After continuous passage culture of 10 generation， its shape and the yield had no obvious change， and the passage was stable. [Conclusion] Corona had a significant effect on the improvement of the yield of pullulan.
Key words Aureobasidium pullulans； High voltage pulsed electric field； Pullulan
出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）属于半知菌类短梗霉属，是一种具有酵母型和菌丝型两种形态的真菌，而短梗霉多糖是一种由出芽短梗霉发酵而来的胞外水溶性多糖，也称作普鲁兰（Pullulan）。它无色无味，具有众多优秀的理化特性，在食品、环境、包装以及医药领域都具有良好的应用前景[1]，但目前生产成本偏高，导致国内大规模生产难以实现。除去生产方式的因素之外，最重要的还是没有优质而高产的菌株。笔者将通过采用高压电晕电场诱变的方式筛选出高产、优质的出芽短梗霉菌。
1 材料与方法
1.1 菌种的选择 试验采用由中国普通微生物菌种保藏管理中心培育的出芽短梗霉。
1.2 菌种的活化
采用PDA培养基，组成为：马铃薯200 g、蔗糖 20 g、去离子水 1 000 ml，不需要调整pH， 121 ℃灭菌20 min。在超净工作台进行接种，将少量菌粉接入液体的PDA培养基中，28 ℃，180 r/min摇瓶发酵36～48 h。
1.3 菌种生长曲线的测定
菌种的生长采用液体种子培养基，组成为：蔗糖30.0 g/L、酵母膏2.00 g/L、 K2HPO4 6.30 g/L、NaCl 1.00 g/L、 MgSO4·7H2O 0.20 g/L、（NH4）2SO4 0.60 g/L，去离子水1 000 ml，pH 6.4～6.8，115 ℃灭菌30 min。将活化36 h的菌种接入种子培养基中，按10%的比例接入，根据比浊法测量其生长曲线，每隔2 h测定其吸光值（OD）。该次试验选取波长为600 nm[2]。
1.4 菌种发酵周期的测定
为了测定合适且准确的普鲁兰多糖产量，需要测定出芽短梗霉菌种的发酵周期。将
活化后的菌种接入液体种子培养基中，28 ℃，180 r/min恒温摇床培养，每隔24 h取出，测定多糖和生物量。
1.5 菌种的诱变
采取高压电晕电场即单针板电极，对出芽短梗霉菌种进行诱变。将活化36～48 h的菌种接入液体种子培养基中摇床培养，一定时间后将达到对数期的菌液转入装有玻璃珠的锥形瓶内，200 r/min振荡15 min，以达到打碎孢子团块的目的，振荡结束后用脱脂棉过滤，得到孢子浓度约107个/ml的单孢子悬液[3]。
将制备好的单孢子悬液用移液枪接入已灭菌的培养皿中。由于不同的菌液厚度会影响电晕电场的放电情况，为保证除诱变时间外的其他变量相同，故取每个培养皿均承接菌悬液10 ml，分别标记为P.0、P.1、P.2、P.3、P.4、P.5、P.6，其中P.0为不进行诱变的对照组。由于在放电情况下电压激增，客观条件不易控制，故诱变电压选取为临界放电电压。在此电压下，诱变时间依次为10、20、30、40、50、60 min。诱变时针尖与液面距离定为1 cm。该试验环境的临界放电电压为4.4 kV。 诱变后用平板培养基培养，测定致死率。
致死率 =（未诱变的原始总菌株- 诱变后的存活菌数）/ 未诱变的总菌数×100%
1.6 菌种的筛选
诱变后，对菌种进行初筛，将菌液稀释，涂布平板，28 ℃恒温培养箱内培养5～7 d，观察菌落的大小、颜色以及菌落形态。挑选出菌落直径大、菌落颜色浅、周边呈稠厚胶状的菌株，这样的菌株生长与产胶性能皆为优良[4]。同时，筛选、淘汰菌落直径偏小且周围干燥、多绒毛的菌株。
在初筛完成后对菌种进行复筛。将挑选出来的优质菌株和未诱变的菌株分别接入液体种子培养基，摇床培养一个发酵周期，观察发酵液颜色，测定其生物量和多糖产量，比较诱变后菌株多糖产量是否多于未诱变的原始菌株，若超过原始菌株，则作为诱变结果良好的正突变株保存，并且进行下一步的连续培养和诱变。
1.7 生物量和多糖产量的测定
将28 ℃，180 r/min摇床培养一个发酵周期的发酵液高温灭酶20 min，8 000 r/min 离心15 min，将沉淀在95 ℃的高温烘干机中干燥脱水至恒重，即为菌种干重。
生物量（g/L）=菌种干重发酵液体积
向离心得到的上清液中加入2倍体积的浓度95%乙醇溶液，在4 ℃的冰箱中放置过夜，使得普鲁兰达到充分的沉淀，然后4 500 r/min离心20 min，弃掉上清液，将沉淀用乙醇洗涤过后，干燥至恒重，得到短梗霉多糖，称重，计算产量[5]。
产糖量（g/L）=普鲁兰含量发酵液体积
1.8 连续诱变优质菌株
为了尽可能多地提高出芽短梗霉的普鲁兰产量，选择对第1次诱变筛选出的优质、高产菌株进行第2次的连续电场诱变。将挑选出的优质菌株接入发酵培养基中，28 ℃，180 r/min摇床培养到对数期后在临界放电电压4.4 kV下进行诱变，诱变时间为第1次诱变选择出的最佳诱变时间，然后稀释涂布平板，进行初筛和复筛。
1.9 遗传稳定性 将挑选出的优质、高产菌株连续培养10代，观察其多糖产量和性状的变化。
2 结果与分析
2.1 出芽短梗霉的生长曲线
由图1可知，经过活化培养36～48 h的出芽短梗霉迟滞期较短，在液体种子培养基中可以很快速地生长和繁殖，恒温摇床培养4 h后就可以进入菌种生长最旺盛的对数期，培养18 h之后逐渐趋于平衡，进入稳定期。处于对数期的菌种十分活跃，突变率高，重现性好，适合进行诱变育种，故得出最佳诱变时间为培养4～16 h。该试验选择摇床培养14 h的出芽短梗霉进行诱变。
2.2 发酵周期的测定
随着发酵时间的变长，菌液的颜色由透明浅黄色逐渐变为黄绿色直至黑绿色。由图2可知，菌种生物量和多糖含量均逐渐增加，在第6～7天达到饱和，所以在测定出芽短梗霉的普鲁兰产量时，应将菌种的发酵周期定为6～7 d，此时多糖产量最高。
2.3 致死率的测定 由图3可知，菌种的致死率随着诱变时间的增加而逐渐增加。这说明诱变的电压大小选取是合适且正向有效的。为了提高菌种诱变的成功率，使其突变特性好，选取60 min为最佳诱变时间。
2.4 菌种的初筛 由表1可知，变异菌株普遍比原始菌株的菌落大，且菌落颜色相对P.0菌株较浅。
2.5 多糖和生物量的测定
由表2可知，编号为P.6.c的菌株产糖量较高，超出原始菌株2倍多。经初筛，挑选出的P.6.c的菌落颜色较浅，没有生成过多色素，变异特性较好。
2.6 二次诱变初筛 由表3可知，二次诱变挑选出的菌株菌落颜色都较浅，黑色素的生成较少，将变异菌株接入液体培养基中摇床培养后，发现发酵液的颜色也与菌落颜色接近，基本靠近白色。
2.7 二次诱变多糖和生物量的测定
由表4可知，编号为P.6.c.Ⅰ的菌落大小明显大于出发菌P.0，且多糖产量经过2次诱变达原始菌株的3倍多，达到了提升多糖产量的目的。
2.8 遗传稳定性测试
为了保证菌株的多糖产量稳定，将P.6.c.Ⅰ号菌株连续传代培养10代，分别测定多糖产量和pH。由表5可知，该变异菌株的多糖产量没有太大变化，发酵液最终颜色为米白色，pH为4.2～4.4。
3 结论与讨论
自从1938年Bauer发现出芽短梗霉可以产生一种黏性物质[6]，并在1959年被定义为普鲁兰后，国内外的科研工作者们对普鲁兰的研究一直没有停止过。对于普鲁兰的研究主要有几个方面：优化培养基的组成，探索最佳的发酵条件；高产低色素菌株的诱变筛选；工业化生产降低成本以及对多糖结构和应用的研究。其中，高产低色素菌株的诱变筛选一直是较根本的问题。在国内，高产低色素的出芽短梗霉菌株难以获得且发酵周期长，导致生产成本过高，无法实现工业化生产。目前，对于出芽短梗霉，常见的诱变方式有利用紫外线、亚硝酸和硫酸二乙酯（DES）等诱变剂来对菌种进行诱变[7-9]，而对于物理性方法研究得较少。该研究首先对出芽短梗霉摇床培养，确定诱变的最佳时间为4～16 h，并且通过测定多糖和生物量，确定菌种的发酵周期，然后在菌种的对数期进行高压电晕电场诱变，实现多糖的提高，由P.0号菌株的3.13 g/L提高至P.6.c.Ⅰ号菌株的9.57 g/L，变化显著。试验中，出芽短梗霉黑色素的生成降低，菌落颜色由最开始的黑灰色变成米白色。对比国内外的一些先进研究成果，还有一定差距。分析原因，可能是原始菌种的选择不同，出发菌多糖产量相对较低。但是，采用电晕电场诱变的方法的确是有效可行的，以后若采取更多方式复合诱变，则可达到更好的预期效果。研究表明，以P.0为出发菌，对P.0进行高压电晕电场诱变，在临界放电电压4.4 kV下诱变60 min。经过2次连续诱变，多糖产量达9.57 g/L，是原始菌株P.0的3倍多，发酵液颜色为米白色，最终pH为4.2左右，连续传代培养10代，其性状和产量无明显变化，传代稳定。
参考文献
[1]杨西江，徐田华，徐玲，等.普鲁兰多糖的应用及研究生产现状[J].发酵科技通讯，2010，39（4）：25-28.
[2] KACHHAWA D K，BHATTACHARJEE P，SINGHAL R S.Studies ondownstream processing of pullulan[J]. Carbohydrate Polymers，2003，52（1）：25-28.
[3] ISRAILIDES C J.Pullulan content of the ethanol precipitatefrom fermented agro.industrialwastes[J].Appl Microbiol Biotechnol，1998，49： 613-617.
[4] 贺红星.高产低色素普鲁兰生产菌株的复合筛选和发酵条件研究[D].兰州：甘肃农业大学，2008.
[5] 任永娥，江宁，谢浩旭，等.几株出芽短梗霉在不同发酵条件下产生多糖的比较[J].微生物学通报，1995，22（3）：146-149.
[6] BAUER R.Beitragezur physiologievon dematiampullulans de bary[J].Zentr Bakteriol Parastenk，Abt，1938，98：392-398.
[7] 张雯，张盛贵.复合诱变选育出芽短梗霉菌高产菌株[J].中国酿造，2008（9）：47-50.
[8] 靳建忠，王慧娟，孔维甲，等.紫外诱变选育出芽短梗霉高产普鲁兰糖白化突变菌株[J].食品科学，2011，32（11）：187-191.
[9] 万翠香，王贤卓，郭建军，等.高产无色素普鲁兰糖突变菌株P1012的选育及发酵性能研究[J].现代食品科技，2015，31（1）：101-106.
关键词 出芽短梗霉；高压电晕电场；普鲁兰
中图分类号 S12 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）17-003-02
Abstract [Objective] The effects of corona treatment on pullulan production were studied to screen Aureobasidium pullulans with high yield and good quality. [Method] Using mutagenesis of Aureobasidium pullulans by corona， different time at the critical discharge voltage was processed，and the change of Aureobasidium pullulans traits and yield of polysaccharides were determined.[Result] The best mutation time in critical voltage 4.4 kV was 60 min. After two consecutive mutagenesises， the polysaccharide production reached 9.57 g/L， more than three times of the original strain. Fermentation liquor color was white， and the final pH was about 4.2. After continuous passage culture of 10 generation， its shape and the yield had no obvious change， and the passage was stable. [Conclusion] Corona had a significant effect on the improvement of the yield of pullulan.
Key words Aureobasidium pullulans； High voltage pulsed electric field； Pullulan
出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）属于半知菌类短梗霉属，是一种具有酵母型和菌丝型两种形态的真菌，而短梗霉多糖是一种由出芽短梗霉发酵而来的胞外水溶性多糖，也称作普鲁兰（Pullulan）。它无色无味，具有众多优秀的理化特性，在食品、环境、包装以及医药领域都具有良好的应用前景[1]，但目前生产成本偏高，导致国内大规模生产难以实现。除去生产方式的因素之外，最重要的还是没有优质而高产的菌株。笔者将通过采用高压电晕电场诱变的方式筛选出高产、优质的出芽短梗霉菌。
1 材料与方法
1.1 菌种的选择 试验采用由中国普通微生物菌种保藏管理中心培育的出芽短梗霉。
1.2 菌种的活化
采用PDA培养基，组成为：马铃薯200 g、蔗糖 20 g、去离子水 1 000 ml，不需要调整pH， 121 ℃灭菌20 min。在超净工作台进行接种，将少量菌粉接入液体的PDA培养基中，28 ℃，180 r/min摇瓶发酵36～48 h。
1.3 菌种生长曲线的测定
菌种的生长采用液体种子培养基，组成为：蔗糖30.0 g/L、酵母膏2.00 g/L、 K2HPO4 6.30 g/L、NaCl 1.00 g/L、 MgSO4·7H2O 0.20 g/L、（NH4）2SO4 0.60 g/L，去离子水1 000 ml，pH 6.4～6.8，115 ℃灭菌30 min。将活化36 h的菌种接入种子培养基中，按10%的比例接入，根据比浊法测量其生长曲线，每隔2 h测定其吸光值（OD）。该次试验选取波长为600 nm[2]。
1.4 菌种发酵周期的测定
为了测定合适且准确的普鲁兰多糖产量，需要测定出芽短梗霉菌种的发酵周期。将
活化后的菌种接入液体种子培养基中，28 ℃，180 r/min恒温摇床培养，每隔24 h取出，测定多糖和生物量。
1.5 菌种的诱变
采取高压电晕电场即单针板电极，对出芽短梗霉菌种进行诱变。将活化36～48 h的菌种接入液体种子培养基中摇床培养，一定时间后将达到对数期的菌液转入装有玻璃珠的锥形瓶内，200 r/min振荡15 min，以达到打碎孢子团块的目的，振荡结束后用脱脂棉过滤，得到孢子浓度约107个/ml的单孢子悬液[3]。
将制备好的单孢子悬液用移液枪接入已灭菌的培养皿中。由于不同的菌液厚度会影响电晕电场的放电情况，为保证除诱变时间外的其他变量相同，故取每个培养皿均承接菌悬液10 ml，分别标记为P.0、P.1、P.2、P.3、P.4、P.5、P.6，其中P.0为不进行诱变的对照组。由于在放电情况下电压激增，客观条件不易控制，故诱变电压选取为临界放电电压。在此电压下，诱变时间依次为10、20、30、40、50、60 min。诱变时针尖与液面距离定为1 cm。该试验环境的临界放电电压为4.4 kV。 诱变后用平板培养基培养，测定致死率。
致死率 =（未诱变的原始总菌株- 诱变后的存活菌数）/ 未诱变的总菌数×100%
1.6 菌种的筛选
诱变后，对菌种进行初筛，将菌液稀释，涂布平板，28 ℃恒温培养箱内培养5～7 d，观察菌落的大小、颜色以及菌落形态。挑选出菌落直径大、菌落颜色浅、周边呈稠厚胶状的菌株，这样的菌株生长与产胶性能皆为优良[4]。同时，筛选、淘汰菌落直径偏小且周围干燥、多绒毛的菌株。
在初筛完成后对菌种进行复筛。将挑选出来的优质菌株和未诱变的菌株分别接入液体种子培养基，摇床培养一个发酵周期，观察发酵液颜色，测定其生物量和多糖产量，比较诱变后菌株多糖产量是否多于未诱变的原始菌株，若超过原始菌株，则作为诱变结果良好的正突变株保存，并且进行下一步的连续培养和诱变。
1.7 生物量和多糖产量的测定
将28 ℃，180 r/min摇床培养一个发酵周期的发酵液高温灭酶20 min，8 000 r/min 离心15 min，将沉淀在95 ℃的高温烘干机中干燥脱水至恒重，即为菌种干重。
生物量（g/L）=菌种干重发酵液体积
向离心得到的上清液中加入2倍体积的浓度95%乙醇溶液，在4 ℃的冰箱中放置过夜，使得普鲁兰达到充分的沉淀，然后4 500 r/min离心20 min，弃掉上清液，将沉淀用乙醇洗涤过后，干燥至恒重，得到短梗霉多糖，称重，计算产量[5]。
产糖量（g/L）=普鲁兰含量发酵液体积
1.8 连续诱变优质菌株
为了尽可能多地提高出芽短梗霉的普鲁兰产量，选择对第1次诱变筛选出的优质、高产菌株进行第2次的连续电场诱变。将挑选出的优质菌株接入发酵培养基中，28 ℃，180 r/min摇床培养到对数期后在临界放电电压4.4 kV下进行诱变，诱变时间为第1次诱变选择出的最佳诱变时间，然后稀释涂布平板，进行初筛和复筛。
1.9 遗传稳定性 将挑选出的优质、高产菌株连续培养10代，观察其多糖产量和性状的变化。
2 结果与分析
2.1 出芽短梗霉的生长曲线
由图1可知，经过活化培养36～48 h的出芽短梗霉迟滞期较短，在液体种子培养基中可以很快速地生长和繁殖，恒温摇床培养4 h后就可以进入菌种生长最旺盛的对数期，培养18 h之后逐渐趋于平衡，进入稳定期。处于对数期的菌种十分活跃，突变率高，重现性好，适合进行诱变育种，故得出最佳诱变时间为培养4～16 h。该试验选择摇床培养14 h的出芽短梗霉进行诱变。
2.2 发酵周期的测定
随着发酵时间的变长，菌液的颜色由透明浅黄色逐渐变为黄绿色直至黑绿色。由图2可知，菌种生物量和多糖含量均逐渐增加，在第6～7天达到饱和，所以在测定出芽短梗霉的普鲁兰产量时，应将菌种的发酵周期定为6～7 d，此时多糖产量最高。
2.3 致死率的测定 由图3可知，菌种的致死率随着诱变时间的增加而逐渐增加。这说明诱变的电压大小选取是合适且正向有效的。为了提高菌种诱变的成功率，使其突变特性好，选取60 min为最佳诱变时间。
2.4 菌种的初筛 由表1可知，变异菌株普遍比原始菌株的菌落大，且菌落颜色相对P.0菌株较浅。
2.5 多糖和生物量的测定
由表2可知，编号为P.6.c的菌株产糖量较高，超出原始菌株2倍多。经初筛，挑选出的P.6.c的菌落颜色较浅，没有生成过多色素，变异特性较好。
2.6 二次诱变初筛 由表3可知，二次诱变挑选出的菌株菌落颜色都较浅，黑色素的生成较少，将变异菌株接入液体培养基中摇床培养后，发现发酵液的颜色也与菌落颜色接近，基本靠近白色。
2.7 二次诱变多糖和生物量的测定
由表4可知，编号为P.6.c.Ⅰ的菌落大小明显大于出发菌P.0，且多糖产量经过2次诱变达原始菌株的3倍多，达到了提升多糖产量的目的。
2.8 遗传稳定性测试
为了保证菌株的多糖产量稳定，将P.6.c.Ⅰ号菌株连续传代培养10代，分别测定多糖产量和pH。由表5可知，该变异菌株的多糖产量没有太大变化，发酵液最终颜色为米白色，pH为4.2～4.4。
3 结论与讨论
自从1938年Bauer发现出芽短梗霉可以产生一种黏性物质[6]，并在1959年被定义为普鲁兰后，国内外的科研工作者们对普鲁兰的研究一直没有停止过。对于普鲁兰的研究主要有几个方面：优化培养基的组成，探索最佳的发酵条件；高产低色素菌株的诱变筛选；工业化生产降低成本以及对多糖结构和应用的研究。其中，高产低色素菌株的诱变筛选一直是较根本的问题。在国内，高产低色素的出芽短梗霉菌株难以获得且发酵周期长，导致生产成本过高，无法实现工业化生产。目前，对于出芽短梗霉，常见的诱变方式有利用紫外线、亚硝酸和硫酸二乙酯（DES）等诱变剂来对菌种进行诱变[7-9]，而对于物理性方法研究得较少。该研究首先对出芽短梗霉摇床培养，确定诱变的最佳时间为4～16 h，并且通过测定多糖和生物量，确定菌种的发酵周期，然后在菌种的对数期进行高压电晕电场诱变，实现多糖的提高，由P.0号菌株的3.13 g/L提高至P.6.c.Ⅰ号菌株的9.57 g/L，变化显著。试验中，出芽短梗霉黑色素的生成降低，菌落颜色由最开始的黑灰色变成米白色。对比国内外的一些先进研究成果，还有一定差距。分析原因，可能是原始菌种的选择不同，出发菌多糖产量相对较低。但是，采用电晕电场诱变的方法的确是有效可行的，以后若采取更多方式复合诱变，则可达到更好的预期效果。研究表明，以P.0为出发菌，对P.0进行高压电晕电场诱变，在临界放电电压4.4 kV下诱变60 min。经过2次连续诱变，多糖产量达9.57 g/L，是原始菌株P.0的3倍多，发酵液颜色为米白色，最终pH为4.2左右，连续传代培养10代，其性状和产量无明显变化，传代稳定。
参考文献
[1]杨西江，徐田华，徐玲，等.普鲁兰多糖的应用及研究生产现状[J].发酵科技通讯，2010，39（4）：25-28.
[2] KACHHAWA D K，BHATTACHARJEE P，SINGHAL R S.Studies ondownstream processing of pullulan[J]. Carbohydrate Polymers，2003，52（1）：25-28.
[3] ISRAILIDES C J.Pullulan content of the ethanol precipitatefrom fermented agro.industrialwastes[J].Appl Microbiol Biotechnol，1998，49： 613-617.
[4] 贺红星.高产低色素普鲁兰生产菌株的复合筛选和发酵条件研究[D].兰州：甘肃农业大学，2008.
[5] 任永娥，江宁，谢浩旭，等.几株出芽短梗霉在不同发酵条件下产生多糖的比较[J].微生物学通报，1995，22（3）：146-149.
[6] BAUER R.Beitragezur physiologievon dematiampullulans de bary[J].Zentr Bakteriol Parastenk，Abt，1938，98：392-398.
[7] 张雯，张盛贵.复合诱变选育出芽短梗霉菌高产菌株[J].中国酿造，2008（9）：47-50.
[8] 靳建忠，王慧娟，孔维甲，等.紫外诱变选育出芽短梗霉高产普鲁兰糖白化突变菌株[J].食品科学，2011，32（11）：187-191.
[9] 万翠香，王贤卓，郭建军，等.高产无色素普鲁兰糖突变菌株P1012的选育及发酵性能研究[J].现代食品科技，2015，31（1）：101-106.