佤药日不润卜歪抑制大鼠肝纤维化实验作用研究

来源 :云南中医中药杂志 | 被引量 : 0次 | 上传用户:rr2009
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  摘要:目的 观察佤药日不润卜歪抑制肝纤维化实验大鼠的作用,以期进确定其靶点,为日后进一步研究提供实验数据。方法 85只雄性SD大鼠,随机均分为空白组、模型组、阳性组、日不润卜歪高、中、低剂量组,除空白组10只外,其余每组15只。除空白组外,模型组、阳性组、日不润卜歪高、中、低劑量组采用复合造模方法建立肝纤维化模型,空白组、模型组灌胃饮用水,阳性组灌胃复方鳖甲胶囊(0.027 g/mL),日不润卜歪高剂量组(0.3 g/mL)、中剂量组(0.15 g/mL)和低剂量组(0.075 g/mL)灌胃日不润卜歪提取液。以上各组均按20mL/Kg灌胃,持续灌胃4周。于建模后4周,取血清测生化指标,取肝脏测脏器系数、肝纤四项,观察肝纤维化大鼠模型组及阳性组、各治疗组大鼠血清生化、肝纤四项等情况。结果 与模型组比较,阳性组、给药高、中、低剂量组丙氨酸氨基酸转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、胆红素、甘油三酯等均有下降(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,阳性组、给药高、中、低剂量组IV型胶原的表达均有有非常显著性差异(P<0.01),其中给药组中剂量组还透明质酸差异有显著性意义(P<0.05);与阳性组比较,给药高、中、低剂量组IV型胶原的表达均有有非常显著性差异(P<0.01)。 结论 佤族肝病用药日不润卜歪可能是通过干预脂代谢异常等来阻止肝纤维化的,其对复合造模大鼠肝纤维化进程有一定抑制作用。
  关键词:佤药;日不润卜歪;肝纤维化;大鼠
  中图分类号:R29 文献标志码:A 文章编号:1007-2349(2020)03-0083-03
  肝纤维化是一种病理学概念,以肝组织的细胞外基质异常增生与分布为特征,导致肝脏的结构和功能改变。肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理特点和病理发生机制,病毒性肝炎、酒精、药物、脂肪肝、自身免疫性肝病、胆汁淤积和遗传代谢性疾病等原因引起的慢性肝病均存在肝纤维化的病理特点。肝纤维化是一个动态发展过程。随着纤维化程度的加重,慢性肝炎可进一步演变为肝硬化,甚至肝癌。因此,积极防治肝纤维化对于慢性肝病具有重要意义[1]。
  目前肝纤维化动物模型也较成熟,如四氯化碳、异种血清、胆总管结扎、乙醇、复合因素及二甲基硝胺(DMN)等,均可致大鼠肝纤维化[2]。
  本实验在项目组前期佤族肝病用药细胞筛选实验研究基础上,选择对肝星状细胞作用较好的佤药日不润卜歪进行抗大鼠肝纤维化作用研究。佤药日不润卜歪为龙胆科獐牙菜属植物青叶胆Swertia mileensis T N Ho et W L Shih(QYD)干燥全草[3],是佤族最常用的肝病用药之一。
  1  材料与仪器
  1.1 实验动物 选取雄性SD大鼠,体重160g~200g,购自昆明医科大学实验动物学部,生产许可证号:SCXK(滇)k2015-0002。
  1.2 药物与试剂 复方鳖甲软肝片,内蒙古福瑞医疗科技股份有限公司,批号:20190802。四氯化碳(分析纯),天津市风船化学试剂科技有限公司,批号20141215。辐照鼠用灭菌饲料,苏州双狮实验动物饲料科技有限公司,苏饲审(2009)05032。试剂盒购自江苏卡尔文生物有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司饮用水(珍茗纯净水符合GB2762-2012、GB19298-2003的要求),昆明珍茗食品有限责任公司。
  1.3 主要仪器 日立7100全自动生化分析仪,日本日立公司。Epoch连续波长酶标仪,美国Bio-Tek公司。
  1.4 实验环境 云南省中医中药研究院IVC独立送风系统。实验动物使用许可证号:SYXK(滇)2017-0003,温度20℃-26℃,湿度40-60%。
  2 实验方法
  2.1 药材提取 QYD粉碎至粗粉,加水浸泡1 h,分别加8倍量、6倍量、4倍量纯净水,每次加热至微沸计时30分钟,合并三次滤液,浓缩备用。
  2.2 动物分组、造模及给药 SD雄性大鼠85只,给予普通辐照繁殖饲料适应性喂养5天,随机分为6组,依次为空白对照组、模型对照组、复方鳖甲软肝片阳性对照组、日不润卜歪高剂量组、中剂量组、低剂量组。空白对照组10只大鼠,其余各组每组15只大鼠。
  除空白对照组外,其余各组采用复合因素诱导建立肝纤维化动物模型。具体方法为[4]:每只动物皮下注射40%油剂CCl4,首次按照5.0 mL/kg注射,以后每隔3天,按照3.0 mL/kg皮下注射40%油剂CCl4,连续注射4周。空白对照组给予普通辐照繁殖饲料喂养,其余各组采用高脂饲料(2%胆固醇、10%猪油、0.2%甲基硫氧嘧啶、0.2%猪胆盐、87.6%普通饲料)喂养,喂养周期4周。同时,除空白组外,其余各组用10%乙醇按照2 mL/kg剂量灌胃,每隔1天1次。
  造模开始后,阳性组(0.027 g/mL),给药高剂量组(0.3 g/mL)、中剂量组(0.15 g/mL)和低剂量组(0.075 g/mL)大鼠均按20 mL/kg剂量每天以经口灌胃方式给药,空白对照组、模型对照组灌胃等体积纯水,每日1次,连续灌胃4周。
  动物每周称量体重1次,根据体重变化,调整给药量。
  2.3 日常观察 实验过程中,每日观察大鼠的一般情况,包括饮食、毛色、二便等。每周称量体重1次,对大鼠体重、进食和饮水量进行记录。观察造模过程中,注射CCl4后的情况。   2.4 指标检测 末次给药后,各组大鼠禁食8h,大鼠股动脉取血,36℃水浴恒温静置1 h,3000 rpm离心5 min,分离血清,取上清液。
  摘取大鼠肝脏,观察其大小、色泽等并记录,称取肝脏质量,根据大鼠的体重和肝脏的质量计算大鼠的肝脏系数。
  取大鼠肝脏左叶做肝纤维化关键指标检测,右叶做病理检测。
  一般检查:观察大鼠一般症状和体征包括生长发育状况、死亡情况、精神状况、活动状况、饮水有无异常、食欲、毛色、体重变化、大便等。
  肝脏情况:肝脏大小、外形、质地、色泽,肝脏脏器系数。
  肝纤四项指标:透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原蛋白(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)。
  生化指标:总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、AST/ALT、谷氨酰转肽酶(GGT)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)。
  病理检测:肝脏纤维化情况,病理形态学的改变。
  3 结果
  3.1 各组一般情况 除空白组外,其余各组一般情况稍差,精神状况不好、活动偏少,体重有减轻,见表1。
  3.2 各组大鼠肝脏形态比较 除空白组外,模型组肝脏质地变硬、色泽灰白,阳性组和给药组肝脏质地柔软、色泽淡红,所有组别肝脏重量无差异(P>0.05)(见表2)。从肝脏系数(见表3)可以看出,模型组与空白组比较,差异有非常显著性意义(P<0.01),与模型组比较,阳性组与给药高、中、低剂量组无差异,均P>0.05。
  2.3 各组大鼠生化指标比较 从生化检测(见表4)可以看出,模型组与空白组相比较,所有生化检测指标升高明显,差异有非常显著性意义(P<0.01);与模型组比较,阳性组、给药高、中、低剂量组丙氨酸氨基酸转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、胆红素、甘油三酯等均有下降(P<0.01,P<0.05),给药组与模型组比较无差异(P>0.05)。
  2.4 各组大鼠肝纤四项比较 模型组与空白组比较,肝纤四项(见表5)中透明质酸差异有显著性意义(P<0.05),与模型组比较,阳性组、给药高、中、低剂量组IV型胶原的表达均有有非常显著性差异(P<0.01),其中给药组中剂量组还透明质酸差异有显著性意义(P<0.05);与阳性组比较,给药高、中、低剂量组IV型胶原的表达均有有非常显著性差异(P<0.01)。
  3 结论
  佤族肝病用药日不润卜歪可能是通过干预脂代谢异常等来阻止肝纤维化的,其对复合造模大鼠肝纤维化进程有一定抑制作用。
  4 讨论
  从血清生化指标、肝纤四项、病理检测等可以看出,本实验造模成功。各给药组大鼠肝脏大小适中,质地偏软,颜色稍紫红,较模型组肝脏颜色灰白、质地稍硬有明显改善。肝脏脏器系数的差异应该是与复合造模造成造模大鼠体重下降有关。和阳性药一样,给药组能不同程度降低甘油三酯等指標,疑似其可通过改善脂代谢等路径达到抑制肝纤维化的目的。肝纤四项因模型组与空白组比较数据无明显变化,某种程度上不具可比性。病理组织检测显示,给药组肝脏纤维化程度与模型组比较有明显改善。一定程度上显示日不润卜歪有一定的抑制肝纤维化形成的作用。实验中模型组出现大鼠死亡,经解剖观察,系操作不慎灌胃死亡。
  参考文献:
  [1]赵志敏,刘成海.中医药治疗肝纤维化研究进展[J].实用肝脏病杂志,2016(1):12-15.
  [2]魏伟,吴希美,李元建.药理实验方法学[M].4版.2010:1137.
  [3]王国强.全国中草药汇编卷三[M].北京:人民卫生出版社,2014:342.
  [4]陈奇,张伯礼.中药药效研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,2016:341.
  (收稿日期:2020-02-17)
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