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摘要 本研究为明确吉林和黑龙江省毛葱病毒病发生率，从两省5个地区共采集255份毛葱样品。根据毛葱4种主要病毒基因组序列设计特异性引物，对胡葱黄条病毒Shallot yellow stripe virus（SYSV）和青蔥X病毒Shallot virus X （SVX）、洋葱黄矮病毒Onion yellow dwarf virus （OYDV）和葱潜隐病毒Shallot latent virus （SLV）进行双重RT-PCR检测。结果表明，229份样品检出病毒，带毒率为89.8%，SLV的检出率最高，达87.06%，OYDV次之，为36.86%，SYSV检出率偏低，为0.78%;同时存在病毒复合侵染，其中双病毒复合侵染为SLV和OYDV，检出率为33.3%;三病毒复合侵染为SYSV、OYDV和SLV，检出率为0.78%，未发现4种病毒复合侵染。本研究为吉林和黑龙江种植区毛葱病毒病防治提供了参考依据。
关键词 毛葱; 病毒病; 双重RT-PCR
中图分类号： S 436.33
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.
2020617
Investigation of virus disease on shallot in Jilin and Heilongjiang provinces
LIU Jianqing1，2， WANG Yongzhi2， ZHOU Qi3， HUANG Shumin3， LIANG Yuxin2，
ZHANG Chunyu2， WEI Jian1*， CHENG Zhaowei4*， LI Xiaoyu2*
（1. School of Life Science， Changchun Normal University， Changchun 130032， China; 2. Jilin Academy of Agricultural Sciences， Gongzhuling 136100， China; 3. Jingyu County Agro-Tech Extension Center， Jilin
Province， Baishan 135200， China; 4. Jilin Provincial Agro-Tech Extension Center， Changchun 130033， China）
Abstract
To investigate the incidence of shallot virus diseases in Jilin and Heilongjiang provinces， 255 samples were collected. Four viruses specific primers were designed according to viral genomic sequences， Shallot yellow stripe virus （SYSV） and Shallot virus X （SVX）， Onion yellow dwarf virus （OYDV） and Shallot latent virus （SLV） were detected by duplex RT-PCR. The results showed that 229 samples were positive， and the incidence of virus disease was 89.8%， of which 87.06% were infected with SLV， 36.86% with OYDV and 0.78% with SYSV. Coinfection of SLV and OYDV was the main type of multiple infections with the infection rate of 33.3%， and the mixed-infection of SYSV， OYDV and SLV was the main type of infection containing three kinds of viruses with an incidence of 078%. However， no four virus coinfection was detected. The results provide basis for the prevention and control of virus diseases in shallot planting areas of Jilin and Heilongjiang provinces.
Key words
Allium cepa var. aggregatum; virus disease; duplex RT-PCR
分蘖洋葱Allium cepa var. aggregatum，俗称毛葱，为百合科Liliaceae葱属Allium两年生草本葱蒜类蔬菜[1]，具有较高的食用价值和药用价值，深受消费者青睐，大量出口创汇。毛葱一般以分蘖小鳞茎进行无性繁殖[2]，长期的无性繁殖使毛葱所感染的病毒逐代传递和积累，造成35%以上的减产，严重制约着毛葱产业绿色健康发展[3]。
本课题组前期研究发现，侵染毛葱的病毒主要包括胡葱黄条病毒Shallot yellow stripe virus （SYSV）、洋葱黄矮病毒Onion yellow dwarf virus （OYDV）[4-5]、青葱X病毒Shallot virus X （SVX）和葱潜隐病毒Shallot latent virus （SLV）[6]，往往呈复合感染。SYSV和OYDV隶属于马铃薯Y病毒属Potyvirus，植株感染SYSV后叶片主要表现为纵向黄色条纹，严重时导致植株矮化[7];植株感染OYDV后主要表现为叶片局部不规则发黄，向下卷曲，萎缩等症状[8];二者通过蚜虫、汁液摩擦或带毒种苗传播[7， 9]。SVX隶属于青葱X病毒属Allexivirus，植株感染SVX后没有明显病变[10]。SLV隶属于香石竹潜隐病毒属Carlavirus，植株感染SLV后症状不明显，在全世界毛葱种植区普遍存在[11]。 植物病毒检测通常采用分子生物学和血清学等手段[12]，多重RT-PCR可应用于多种植物病毒的同时检测;与常规RT-PCR法相比，检测效率更高、检测时间更短、成本更低[13]。本研究通过應用实验室所建立的双重RT-PCR检测体系，对吉林、黑龙江毛葱种植区病毒感染情况进行调查，以期为毛葱病毒病防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试植物
2019年5月中旬到6月初，在吉林柴岗镇、三清山镇、露水河镇、大安镇和黑龙江阿城县5个地区采用五点取样法分别随机采集32、79、81、27、36份样品，经液氮速冻后立即置于-80℃冰箱保存。
1.1.2 主要试剂仪器
主要试剂：TRIzol购自Invitrogen公司，Premix Ex TaqTM、1st Strand cDNA Synthesis Kit购自TaKaRa公司，其余生化试剂均为国产分析纯。主要仪器：高速冷冻台式离心机（CT15RE型）购自日本日立公司，基因扩增仪（ETC-811型）购自东胜创新生物技术有限公司，电泳仪（DYY-11型）购自北京市六一仪器厂，凝胶成像仪购自美国WEALTET公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成
根据GenBank中已提交的SYSV、OYDV、SVX和SLV等4种病毒基因序列保守区分别设计相关引物，如表1所示， 均由吉林省库美生物科技有限公司合成。
1.2.2 双重RT-PCR检测
采用TRIzol法提取疑似感病和健康毛葱叶片总RNA，-80℃冰箱中保存，备用。根据1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书合成cDNA，并以其为模板进行双重RT-PCR扩增。10 μL PCR反应体系：SYSV/SVX或OYDV/SLV上下游引物（10 μmol/L）各0.1 μL，Premix Ex TaqTM 5 μL，模板cDNA 0.5 μL，加ddH2O补足至10 μL;扩增程序：94℃预变性3 min; 94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸50 s，30个循环; 72℃延伸10 min， 4℃冰箱中保存。将PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，根据条带大小确定毛葱病原种类，并送往吉林省库美生物科技有限公司进行测序验证。
2 结果与分析
2.1 双重RT-PCR检测体系的建立
在单重RT-PCR的基础上，建立双重RT-PCR检测体系，可同时检测出SYSV和SVX、OYDV和SLV。结果显示：双重RT-PCR同时扩增SYSV和SVX、OYDV和SLV时，在同一泳道可清晰地看到SYSV和SVX、OYDV和SLV的特异性条带，达到了预期效果（图1）。
2.2 田间样品病毒感染情况调查
对所采集的255份样品进行双重RT-PCR检
测，病毒检出率为89.80%;如表2所示，SLV阳性检出率最高，达到87.06%，表明SLV在吉林、黑龙江毛葱种植区普遍存在;SYSV的阳性检出率相对偏低，为0.78%;本次调查的样品未检测出SVX。
病毒侵染包括单独侵染和复合侵染。SLV单独侵染率为52.94%，OYDV单独侵染率为2.75%。在本次调查中未发现SYSV和SVX单独侵染毛葱。复合侵染主要包括双病毒复合侵染和三病毒复合侵染，未发现四病毒复合侵染。双病毒复合侵染为SLV和OYDV，检出率为33.3%;三病毒复合侵染为SYSV、OYDV和SLV，检出率为0.78%，由此可见，在毛葱病毒复合侵染中，SLV和OYDV双病毒复合侵染现象普遍。
2.3 不同地区毛葱主要病毒感染情况调查
对不同毛葱种植区病毒感染情况的调查分析表明（表3），阿城县阳性检出率最高，达到97.22%，露水河镇阳性检出率相对较低，为83.95%，可见在各个调查区病毒感染率普遍偏高。综合分析各病毒的感染情况，发现SLV普遍侵染各个产区，OYDV侵染仅存在于三清山镇和露水河镇，此次调查的5个毛葱产区均未检测出SYSV和SVX单独侵染。此外，毛葱病
毒还存在复合侵染现象，OYDV和SLV复合侵染普遍存在于不同毛葱产区，其中在柴岗镇复合侵染率
最高，为56.25%;SYSV、OYDV和SLV复合侵染仅存在于柴岗镇和大安镇，分别为313%和3.70%。
3 讨论
近几年，随着东北地区毛葱种植面积的不断扩大，以及无性繁殖种植模式的长期应用，导致东北毛葱病毒病普遍发生，造成严重的经济损失。本研究对吉林和黑龙江5个毛葱种植区病毒病害发生情况进行调查，发现各个种植区样品感染率普遍偏高，平均病毒检出率超过80%，其中阿城县、三清山镇和柴岗镇病毒检出率均超过90%。三清山镇和柴岗镇是吉林省主要的毛葱生产地和集散地，种植户通常自己留种或从黑龙江省买种，由于缺乏有效的病毒检测方法，使得病毒病泛滥，造成严重减产。
对田间毛葱样品进行病毒检测分析发现，SLV阳性样品最多，这可能与生产过程中种植户主要依据表观留种有关[14]，由于SLV单独侵染植株后，造成的表观症状并不明显，很难筛选出不含SLV的鳞
茎。复合侵染是病毒感染植物的一种常见现象，本研究发现吉林、黑龙江毛葱主产区OYDV和SLV复
合侵染现象最常见，这可能是因为OYDV属于马
铃薯Y病毒属Potyvirus，SLV属于香石竹潜隐病毒属Carlavirus，两种不同科属病毒在侵染植物时容易发生协生效应[15-16]，而这种互作机制对病毒侵染具有促进作用，因此在检测结果中发现了大量的OYDV和SLV复合侵染。目前，没有防治毛葱病毒病的有效药剂，现阶段除了采用脱毒种苗生产和抗病毒品种选育的方法外，还应加强对蚜虫等传毒媒介的监测和防治，从而阻止病毒在毛葱主产区的进一步蔓延。 本研究通过采用SYSV和SVX、OYDV和SLV双重RT-PCR检测体系，对255份田间样品进行病毒检测，明确了吉林、黑龙江两省毛葱主产区主要病毒病害的发生现状，对毛葱病毒病的检测及综合防治具有重要意义。目前关于毛葱病毒的研究大部分都集中于病毒检测方法，而对于病毒积累量和病害发生的相关关系等方面的研究有待进一步深入。
参考文献
[1] 李曙轩. 栽培学各论[M]. 北京： 中国农业出版社， 1980： 12.
[2] 刘玮， 宁淑香， 崔成日， 等. 赤霉素对毛葱生长发育影响研究[J]. 东北农业大学学报， 2011， 42（7）： 83-86.
[3] 王勇， 梁誉， 陈典， 等. 分蘖洋葱再生体系的建立与优化[J]. 东北农业大学学报， 2013， 44（7）：96-100.
[4] SU Ying， WANG Yongzhi， LI Xiaoyu， et al. First report of Onion yellow dwarf virus on shallot （Allium cepa var. aggregatum） in China [J]. Plant Disease， 2018， 103（4）： 778.
[5] 郭炎， 李小宇， 苏颖， 等. 洋葱黄矮病毒RT-PCR和ELISA检测方法的建立[J]. 植物保护学报， 2019， 46（2）： 495-496.
[6] WANG Yongzhi， SU Ying， LI Xiaoyu， et al. First report of Shallot virus X and Shallot latent virus on shallot （Allium cepa var. aggregatum） in China [J]. Plant Disease， 2019， 103（11）： 2972.
[7] 馬俊丰， 张宸， 张春雨， 等. 胡葱黄条病毒吉林毛葱分离物全基因组序列测定与分析[J]. 中国蔬菜， 2020（6）：44-48.
[8] VAN DIJK P. Carlavirus isolates from cultivated Allium species represent three viruses [J]. Netherlands Journal of Plant Pathology， 1993， 99（5）： 233-257.
[9] 王永志， 万千， 李小宇， 等. OYDV衣壳蛋白表达及其单克隆抗体分析[J]. 东北农业科学， 2018， 43（2）：26-29.
[10]陈辉麟. 大蒜病毒Real Time PCR定量检测方法的建立及其应用[D]. 兰州： 甘肃农业大学， 2014.
[11]李甜甜. 温度和水分对大蒜生理生化特性及叶片OYDV和LYSV病毒积累的影响[D]. 兰州： 甘肃农业大学， 2015.
[12]张静雅， 何衍彪. 植物病毒病检测及防治技术研究进展[J]. 安徽农学通报， 2019， 25（12）： 79- 81.
[13]杜真真， 刘艳， 王锡锋. 双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒[J]. 植物保护， 2020， 46（3）：175- 179.
[14]李小宇， 郭炎， 张春雨， 等. 吉林、黑龙江部分地区毛葱OYDV感染情况调查[J]. 东北农业科学， 2019， 44（6）： 53-56.
[15]李舒. 南方水稻黑条矮缩病毒与水稻齿叶矮缩病毒协生作用研究[D]. 广州： 华南农业大学， 2016.
[16]常飞， 邹文超， 高芳銮， 等. 不同寄主来源的马铃薯Y病毒群体遗传结构的比较分析[J]. 遗传， 2015， 37（3）： 292-301.
（责任编辑：田 喆）
关键词 毛葱; 病毒病; 双重RT-PCR
中图分类号： S 436.33
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.
2020617
Investigation of virus disease on shallot in Jilin and Heilongjiang provinces
LIU Jianqing1，2， WANG Yongzhi2， ZHOU Qi3， HUANG Shumin3， LIANG Yuxin2，
ZHANG Chunyu2， WEI Jian1*， CHENG Zhaowei4*， LI Xiaoyu2*
（1. School of Life Science， Changchun Normal University， Changchun 130032， China; 2. Jilin Academy of Agricultural Sciences， Gongzhuling 136100， China; 3. Jingyu County Agro-Tech Extension Center， Jilin
Province， Baishan 135200， China; 4. Jilin Provincial Agro-Tech Extension Center， Changchun 130033， China）
Abstract
To investigate the incidence of shallot virus diseases in Jilin and Heilongjiang provinces， 255 samples were collected. Four viruses specific primers were designed according to viral genomic sequences， Shallot yellow stripe virus （SYSV） and Shallot virus X （SVX）， Onion yellow dwarf virus （OYDV） and Shallot latent virus （SLV） were detected by duplex RT-PCR. The results showed that 229 samples were positive， and the incidence of virus disease was 89.8%， of which 87.06% were infected with SLV， 36.86% with OYDV and 0.78% with SYSV. Coinfection of SLV and OYDV was the main type of multiple infections with the infection rate of 33.3%， and the mixed-infection of SYSV， OYDV and SLV was the main type of infection containing three kinds of viruses with an incidence of 078%. However， no four virus coinfection was detected. The results provide basis for the prevention and control of virus diseases in shallot planting areas of Jilin and Heilongjiang provinces.
Key words
Allium cepa var. aggregatum; virus disease; duplex RT-PCR
分蘖洋葱Allium cepa var. aggregatum，俗称毛葱，为百合科Liliaceae葱属Allium两年生草本葱蒜类蔬菜[1]，具有较高的食用价值和药用价值，深受消费者青睐，大量出口创汇。毛葱一般以分蘖小鳞茎进行无性繁殖[2]，长期的无性繁殖使毛葱所感染的病毒逐代传递和积累，造成35%以上的减产，严重制约着毛葱产业绿色健康发展[3]。
本课题组前期研究发现，侵染毛葱的病毒主要包括胡葱黄条病毒Shallot yellow stripe virus （SYSV）、洋葱黄矮病毒Onion yellow dwarf virus （OYDV）[4-5]、青葱X病毒Shallot virus X （SVX）和葱潜隐病毒Shallot latent virus （SLV）[6]，往往呈复合感染。SYSV和OYDV隶属于马铃薯Y病毒属Potyvirus，植株感染SYSV后叶片主要表现为纵向黄色条纹，严重时导致植株矮化[7];植株感染OYDV后主要表现为叶片局部不规则发黄，向下卷曲，萎缩等症状[8];二者通过蚜虫、汁液摩擦或带毒种苗传播[7， 9]。SVX隶属于青葱X病毒属Allexivirus，植株感染SVX后没有明显病变[10]。SLV隶属于香石竹潜隐病毒属Carlavirus，植株感染SLV后症状不明显，在全世界毛葱种植区普遍存在[11]。 植物病毒检测通常采用分子生物学和血清学等手段[12]，多重RT-PCR可应用于多种植物病毒的同时检测;与常规RT-PCR法相比，检测效率更高、检测时间更短、成本更低[13]。本研究通过應用实验室所建立的双重RT-PCR检测体系，对吉林、黑龙江毛葱种植区病毒感染情况进行调查，以期为毛葱病毒病防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试植物
2019年5月中旬到6月初，在吉林柴岗镇、三清山镇、露水河镇、大安镇和黑龙江阿城县5个地区采用五点取样法分别随机采集32、79、81、27、36份样品，经液氮速冻后立即置于-80℃冰箱保存。
1.1.2 主要试剂仪器
主要试剂：TRIzol购自Invitrogen公司，Premix Ex TaqTM、1st Strand cDNA Synthesis Kit购自TaKaRa公司，其余生化试剂均为国产分析纯。主要仪器：高速冷冻台式离心机（CT15RE型）购自日本日立公司，基因扩增仪（ETC-811型）购自东胜创新生物技术有限公司，电泳仪（DYY-11型）购自北京市六一仪器厂，凝胶成像仪购自美国WEALTET公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成
根据GenBank中已提交的SYSV、OYDV、SVX和SLV等4种病毒基因序列保守区分别设计相关引物，如表1所示， 均由吉林省库美生物科技有限公司合成。
1.2.2 双重RT-PCR检测
采用TRIzol法提取疑似感病和健康毛葱叶片总RNA，-80℃冰箱中保存，备用。根据1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书合成cDNA，并以其为模板进行双重RT-PCR扩增。10 μL PCR反应体系：SYSV/SVX或OYDV/SLV上下游引物（10 μmol/L）各0.1 μL，Premix Ex TaqTM 5 μL，模板cDNA 0.5 μL，加ddH2O补足至10 μL;扩增程序：94℃预变性3 min; 94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸50 s，30个循环; 72℃延伸10 min， 4℃冰箱中保存。将PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，根据条带大小确定毛葱病原种类，并送往吉林省库美生物科技有限公司进行测序验证。
2 结果与分析
2.1 双重RT-PCR检测体系的建立
在单重RT-PCR的基础上，建立双重RT-PCR检测体系，可同时检测出SYSV和SVX、OYDV和SLV。结果显示：双重RT-PCR同时扩增SYSV和SVX、OYDV和SLV时，在同一泳道可清晰地看到SYSV和SVX、OYDV和SLV的特异性条带，达到了预期效果（图1）。
2.2 田间样品病毒感染情况调查
对所采集的255份样品进行双重RT-PCR检
测，病毒检出率为89.80%;如表2所示，SLV阳性检出率最高，达到87.06%，表明SLV在吉林、黑龙江毛葱种植区普遍存在;SYSV的阳性检出率相对偏低，为0.78%;本次调查的样品未检测出SVX。
病毒侵染包括单独侵染和复合侵染。SLV单独侵染率为52.94%，OYDV单独侵染率为2.75%。在本次调查中未发现SYSV和SVX单独侵染毛葱。复合侵染主要包括双病毒复合侵染和三病毒复合侵染，未发现四病毒复合侵染。双病毒复合侵染为SLV和OYDV，检出率为33.3%;三病毒复合侵染为SYSV、OYDV和SLV，检出率为0.78%，由此可见，在毛葱病毒复合侵染中，SLV和OYDV双病毒复合侵染现象普遍。
2.3 不同地区毛葱主要病毒感染情况调查
对不同毛葱种植区病毒感染情况的调查分析表明（表3），阿城县阳性检出率最高，达到97.22%，露水河镇阳性检出率相对较低，为83.95%，可见在各个调查区病毒感染率普遍偏高。综合分析各病毒的感染情况，发现SLV普遍侵染各个产区，OYDV侵染仅存在于三清山镇和露水河镇，此次调查的5个毛葱产区均未检测出SYSV和SVX单独侵染。此外，毛葱病
毒还存在复合侵染现象，OYDV和SLV复合侵染普遍存在于不同毛葱产区，其中在柴岗镇复合侵染率
最高，为56.25%;SYSV、OYDV和SLV复合侵染仅存在于柴岗镇和大安镇，分别为313%和3.70%。
3 讨论
近几年，随着东北地区毛葱种植面积的不断扩大，以及无性繁殖种植模式的长期应用，导致东北毛葱病毒病普遍发生，造成严重的经济损失。本研究对吉林和黑龙江5个毛葱种植区病毒病害发生情况进行调查，发现各个种植区样品感染率普遍偏高，平均病毒检出率超过80%，其中阿城县、三清山镇和柴岗镇病毒检出率均超过90%。三清山镇和柴岗镇是吉林省主要的毛葱生产地和集散地，种植户通常自己留种或从黑龙江省买种，由于缺乏有效的病毒检测方法，使得病毒病泛滥，造成严重减产。
对田间毛葱样品进行病毒检测分析发现，SLV阳性样品最多，这可能与生产过程中种植户主要依据表观留种有关[14]，由于SLV单独侵染植株后，造成的表观症状并不明显，很难筛选出不含SLV的鳞
茎。复合侵染是病毒感染植物的一种常见现象，本研究发现吉林、黑龙江毛葱主产区OYDV和SLV复
合侵染现象最常见，这可能是因为OYDV属于马
铃薯Y病毒属Potyvirus，SLV属于香石竹潜隐病毒属Carlavirus，两种不同科属病毒在侵染植物时容易发生协生效应[15-16]，而这种互作机制对病毒侵染具有促进作用，因此在检测结果中发现了大量的OYDV和SLV复合侵染。目前，没有防治毛葱病毒病的有效药剂，现阶段除了采用脱毒种苗生产和抗病毒品种选育的方法外，还应加强对蚜虫等传毒媒介的监测和防治，从而阻止病毒在毛葱主产区的进一步蔓延。 本研究通过采用SYSV和SVX、OYDV和SLV双重RT-PCR检测体系，对255份田间样品进行病毒检测，明确了吉林、黑龙江两省毛葱主产区主要病毒病害的发生现状，对毛葱病毒病的检测及综合防治具有重要意义。目前关于毛葱病毒的研究大部分都集中于病毒检测方法，而对于病毒积累量和病害发生的相关关系等方面的研究有待进一步深入。
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[10]陈辉麟. 大蒜病毒Real Time PCR定量检测方法的建立及其应用[D]. 兰州： 甘肃农业大学， 2014.
[11]李甜甜. 温度和水分对大蒜生理生化特性及叶片OYDV和LYSV病毒积累的影响[D]. 兰州： 甘肃农业大学， 2015.
[12]张静雅， 何衍彪. 植物病毒病检测及防治技术研究进展[J]. 安徽农学通报， 2019， 25（12）： 79- 81.
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[14]李小宇， 郭炎， 张春雨， 等. 吉林、黑龙江部分地区毛葱OYDV感染情况调查[J]. 东北农业科学， 2019， 44（6）： 53-56.
[15]李舒. 南方水稻黑条矮缩病毒与水稻齿叶矮缩病毒协生作用研究[D]. 广州： 华南农业大学， 2016.
[16]常飞， 邹文超， 高芳銮， 等. 不同寄主来源的马铃薯Y病毒群体遗传结构的比较分析[J]. 遗传， 2015， 37（3）： 292-301.
（责任编辑：田 喆）