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摘 要：以黑豆皮为原料、黑豆红色素提取率为指标，在单因素试验的基础上，通过正交试验确定双酶法提取黑豆红色素的最佳工艺为酶用量（果胶酶+纤维素酶）（2+1） mg、酶解pH值3.6、酶解温度55 ℃、料液比1∶25、酶解时间120 min、提取2次，提取率高达26.60%。研究结果显示，采用双酶法提取黑豆红色素简单高效、提取条件温和且无溶剂残留问题，适用于食品工业规模化生产。
关键词：黑豆红色素；提取；纤维素酶；果胶酶
中图分类号：TS209 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.018
Abstract： Taking black soybean skin as the material， and black soybean red pigment extraction rate as index， on the basis of single factor experiment， through orthogonal test the double enzymatic extraction technology was determined. It was as follow enzyme dosage of black soybean red pigment （pectinase and cellulase） 2 mg +1 mg， enzyme solution pH 3.6， enzyme solution temperature of 55 ℃， material liquid ratio 1∶25， 120 min digestion time， extracting 2 times， extraction rate as high as 26.60%.The results showed that the double enzymatic extraction of black soybean red pigment is simple and efficient， has mild extraction conditions and no solvent residue problem， and is suitable to food industry large-scale production.
Key words： black soybean red pigment； extraction； cellulase； pectinase
黑豆红色素，是一种常见的食品添加剂，其着色自然，同时具有一些生理功能如抗氧化、抗肥胖、延缓衰老、保护肝脏、降血脂[1]等。目前，黑豆红色素的提取主要采取的是一些传统的方法如溶剂提取法[2-8]、超声波辅助提取法[9-10]、微波辅助提取法等[11]，色素提取率仅18%左右。提取的过程中不仅存在着提取时间长、热敏性组分易被破坏等问题，而且还有生产的色素产品纯度差、提取率低、存在异味和溶剂残留等缺点[12]，严重制约了黑豆红色素在食品工业的综合利用。鉴于黑豆红色素有着重要的药理作用，近年来不少学者对黑豆红色素的提取方法进行了很多的研究探索，但主要还是集中在对传统方法的优化或改良上。
目前，利用酶法提取植物体内活性成分已得到广泛应用。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，植物天然色素往往被包裹在其中而不易溶出。依据此原理，本研究采用纤维素酶和果胶酶两种酶对黑豆皮进行酶解，破坏其细胞壁骨架结构使其逐级降解，促进导致细胞内色素的溶出，增加黑豆红色素的提取率[12]，从而实现食品工业规模化生产。目前，国内利用酶法提取黑豆红色素的研究报道尚少[13]，该研究有助于促进该领域的研究。
1 材料和方法
1.1 材 料
黑豆皮，市售。经清洗、晾干、粉碎后过孔径为0.25 mm筛制成黑豆皮粉，备用。
1.2 主要试剂与仪器
纤维素酶（2万U·g-1）：淮安市百麦绿色生物能源有限公司；果胶酶（10万U·g-1）：江苏锐阳生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。Neofuge 13R台式高速冷冻离心机：上海力申科学仪器有限公司；电动搅拌机：杭州仪表电机厂；高速万能粉碎机，北京化玻联医疗器械有限公司；SHB-IIIA循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司。
1.3 方 法
1.3.1 黑豆红色素的提取工艺流程 黑豆皮粉→酶解提取→抽滤→合并各次滤液→50 ℃减压浓缩→冻干→黑豆红色素→计算红色素提取率
红色素提取率=（红色素干质量/黑豆皮干质量）×100%
1.3.2 单因素试验 分别对影响黑豆红色素提取效果的单因素如酶用量、酶解pH值、酶解温度、料液比、酶解时间、提取次数等进行研究。
1.3.3 正交试验 在单因素试验的基础上，对较显著的4个单因素分别选取3个最优水平，依据L9（34）正交试验表筛选最优组合以确定双酶法提取黑豆红色素的最佳工艺。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 酶用量（果胶酶+纤维素酶）对黑豆红色素提取率的影响 称取1 g黑豆皮粉，在酶解pH值为4.6，酶解温度为45 ℃、料液比1∶20、提取120 min条件下，分别对提取液的不同酶用量（果胶酶+纤维素酶）：1+0、0+1、0.5+0.5、0.5+1、1+0.5、1+1、1+2、1+3、1+4、2+1、2+2、2+3、2+4 mg进行考察，提取1次，称重后计算红色素提取率。
由图1可知，单独使用果胶酶或纤维素酶的酶解效果均低于混合使用效果，在酶用量为果胶酶（mg）+纤维素酶（mg）为（2+1） mg时红色素提取率最高。试验结果表明，在酶用量较高时，红色素提取率均有不同程度的下降，原因可能是底物浓度不能对酶达到饱和，导致酶的作用受到抑制，导致色素提取率呈下降趋势[14-16]。 2.1.2 酶解pH值对黑豆红色素提取率的影响 称取1 g黑豆皮粉，根据2.1.1结果，选择红色素提取率最高的酶用量，在酶解温度为45 ℃、料液比1∶20、提取120 min条件下，分别对提取液pH 值分别为3.6、4、4.6、5、5.6、6的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液进行考察，提取1次，称质量后计算红色素提取率，结果如图2。
2.1.3 酶解温度对黑豆红色素提取率的影响 称取1 g黑豆皮粉，根据2.1.2结果，选择红色素提取率最高的酶用量、酶解pH值，在料液比1∶20、提取120 min条件下，分别对提取液的不同酶解温度35、40、45、50、55、60 ℃进行考察，提取1次，称重后计算红色素提取率。
由图3可知，从35～55 ℃，随着酶解温度的提高，红色素提取率随之增加，继续提高温度，提取率随之下降，说明纤维素酶和果胶酶双酶酶解提取黑豆红色素最适温度为55 ℃。
2.1.4 料液比对黑豆红色素提取率的影响 称取1 g黑豆皮粉，根据2.1.3结果，选择红色素提取率最高的酶用量、酶解pH值、酶解温度，在提取120 min条件下，分别对提取液的不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40进行考察，提取1次，称重后计算红色素提取率。
由图4可知，料液比在1∶25时红色素提取率为19.14%，达到最高。
2.1.5 酶解时间对黑豆红色素提取率的影响 称取1 g黑豆皮粉，根据2.1.4结果，选择红色素提取率最高的酶用量、酶解pH值、酶解温度、料液比，分别对提取液的不同酶解时间60、90、120、150、180、210 min进行考察，提取1次，称质量后计算红色素提取率。
由图5可知，从60～120 min，随着酶解时间的增加，红色素提取率随之提高。如继续增加酶解时间，提取率无明显变化，所以确定黑豆红色素最适酶解时间为120 min。
2.1.6 提取次数对黑豆红色素提取率的影响 称取1 g黑豆皮粉，根据2.1.5结果，选择红色素提取率最高的酶用量、酶解pH值、酶解温度、料液比、酶解时间，分别对提取液的不同提取次数1、2、3次进行考察，合并各次滤液，称质量后计算红色素提取率。
由图6可知，随着提取次数的增加，红色素提取率随之提高。但第3次的提取率无明显增加，从节约能源的角度考虑，确定黑豆红色素最佳提取次数为2次。
单因素试验结果表明，黑豆红色素最佳提取条件为：酶用量（果胶酶+纤维素酶） （2+1）mg、 酶解pH值4、酶解温度55 ℃、料液比1∶25、酶解时间120 min、提取2次。
2.2 正交试验结果
在单因素试验基础上，对较显著的因素酶用量、酶解pH值、酶解温度、料液比等4个因素分别选取3个最优水平，依据L9（34）表安排正交试验，见表1，得出黑豆红色素最佳酶解提取条件。
由表2正交试验结果极差R值大小可知，4个因素对黑豆红色素的提取率影响为：B（酶解pH值）>A（酶用量）>D（料液比）>C（酶解温度）。最优提取组合为A2B1C2D3，即酶用量（果胶酶+纤维素酶）（2+1） mg、酶解pH值3.6、酶解温度55 ℃、料液比1∶25，提取率达26.60%。方差分析表明，以因素C为误差项，因素A和B对黑豆红色素提取率的影响差异显著（P<0.05），因素C和D差异不显著（P >0.05），与极差分析结果一致。
3 结 论
以黑豆皮为原料，分别对影响黑豆红色素提取率的单因素如酶用量、酶解pH值、酶解温度、料液比、酶解时间、提取次数等进行研究。在此基础上，对较显著的4个单因素分别选取3个最优水平安排正交试验，确定双酶法提取黑豆红色素最佳条件：酶用量（果胶酶+纤维素酶）（2+1） mg、酶解pH值3.6、酶解温度55 ℃、料液比1∶25、酶解时间120 min、提取2次，提取率高达26.60%。
在各种黑豆制品如豆油、豆乳、豆粉等的生产过程中，为改善产品风味、防止非酶褐变，并赋予产品良好的色泽等，通常要将黑豆进行脱皮等预处理工序，因此在豆制品的生产过程中会得到大量的副产品，即黑豆皮。我国拥有丰富的黑豆资源，从黑豆制品加工的下脚料黑豆皮中提取天然色素，成本低廉、工艺简单且易实现工业化，因此具有良好的开发应用前景。试验结果表明，采用双酶法提取黑豆红色素简单高效、提取条件温和且无溶剂残留问题，适用于食品工业规模化生产。
参考文献：
[1] Kwon S H，Ahn I S，Kim S O，et al. Anti-obesity and hypolipidemic effects of black soybean anthocyanins[J].J Med Food，2007，10（3）：552-556.
[2] 曹春艳，赵永华，赵莹莹.黑豆衣色素提取工艺的研究[J].粮食与饲料工，2012（9）：22-24.
[3] 崔蕊静，李凤英，李春华.黑豆衣红色素提取及影响其稳定性因素分析[J].中国粮油学报，2004，19（1）：48-51.
[4] 徐亚维，赵杨，魏馨，等.黑豆衣原花青素提取工艺的优化[J].贵州农业科学，2011，39（2）：229-231.
[5] 朱宏达，张慧，张美荣，等.黑豆红色素的提取工艺及其理化性质的研究[J].中国食品添加剂，2009（1）：86-90.
[6] 王少波，杜永峰，姚秉华.pH示差法测定黑豆衣中的花青素[J].化学分析计量，2008，17（1）：46-48.
[7] 肖怀秋，李玉珍.黑豆衣中红色色素萃取工艺的响应面优化[J].氨基酸和生物资源，2010，32（2）：30-34.
[8] 黄昉，李汴生，徐志宏.黑豆种皮色素的测定和提取[J].食品工业科技，2004，25（4）：117-120.
[9] 李大婧，宋江峰，刘春泉，等.超声波辅助提取黑豆衣色素工艺优化[J].农业工程学报，2009，25（2）：273-279.
[10] 王少波.黑豆衣中花色苷的提取及纯化研究[D].西安：西安理工大学，2008.
[11] 高雪琴，王若兰，杨建平.黑豆衣红色素微波辅助提取与乙醇浸提的工艺比较研究[J].食品与药品，2006，8（05A）：39-41.
[12] 郭凤华，王慧.天然色素的提取和应用研究[J].山东食品发酵，2008（1）：27-30.
[13] 孙晓侠，马龙.纤维素酶法提取黑豆衣色素的工艺研究[J].食品工业科技，2010，31（10）：319-321.
[14] 苏东林，单杨，李高阳，等.酶法辅助提取柑桔皮总黄酮的工艺优化研究[J].农业工程学报，2008，24（4）：240-245.
[15] 张秀秀，魏学智，赵瑞芬，等. 酶液提取扁核木叶片总黄酮的工艺优化[J].山西农业科学，2015（1）：81-84.
[16] 张康逸，范运乾，康志敏，等.超声波辅助纤维素酶法提取紫玉米芯色素工艺研究[J].河南农业科学，2013（6）：152-155.
关键词：黑豆红色素；提取；纤维素酶；果胶酶
中图分类号：TS209 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.018
Abstract： Taking black soybean skin as the material， and black soybean red pigment extraction rate as index， on the basis of single factor experiment， through orthogonal test the double enzymatic extraction technology was determined. It was as follow enzyme dosage of black soybean red pigment （pectinase and cellulase） 2 mg +1 mg， enzyme solution pH 3.6， enzyme solution temperature of 55 ℃， material liquid ratio 1∶25， 120 min digestion time， extracting 2 times， extraction rate as high as 26.60%.The results showed that the double enzymatic extraction of black soybean red pigment is simple and efficient， has mild extraction conditions and no solvent residue problem， and is suitable to food industry large-scale production.
Key words： black soybean red pigment； extraction； cellulase； pectinase
黑豆红色素，是一种常见的食品添加剂，其着色自然，同时具有一些生理功能如抗氧化、抗肥胖、延缓衰老、保护肝脏、降血脂[1]等。目前，黑豆红色素的提取主要采取的是一些传统的方法如溶剂提取法[2-8]、超声波辅助提取法[9-10]、微波辅助提取法等[11]，色素提取率仅18%左右。提取的过程中不仅存在着提取时间长、热敏性组分易被破坏等问题，而且还有生产的色素产品纯度差、提取率低、存在异味和溶剂残留等缺点[12]，严重制约了黑豆红色素在食品工业的综合利用。鉴于黑豆红色素有着重要的药理作用，近年来不少学者对黑豆红色素的提取方法进行了很多的研究探索，但主要还是集中在对传统方法的优化或改良上。
目前，利用酶法提取植物体内活性成分已得到广泛应用。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，植物天然色素往往被包裹在其中而不易溶出。依据此原理，本研究采用纤维素酶和果胶酶两种酶对黑豆皮进行酶解，破坏其细胞壁骨架结构使其逐级降解，促进导致细胞内色素的溶出，增加黑豆红色素的提取率[12]，从而实现食品工业规模化生产。目前，国内利用酶法提取黑豆红色素的研究报道尚少[13]，该研究有助于促进该领域的研究。
1 材料和方法
1.1 材 料
黑豆皮，市售。经清洗、晾干、粉碎后过孔径为0.25 mm筛制成黑豆皮粉，备用。
1.2 主要试剂与仪器
纤维素酶（2万U·g-1）：淮安市百麦绿色生物能源有限公司；果胶酶（10万U·g-1）：江苏锐阳生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。Neofuge 13R台式高速冷冻离心机：上海力申科学仪器有限公司；电动搅拌机：杭州仪表电机厂；高速万能粉碎机，北京化玻联医疗器械有限公司；SHB-IIIA循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司。
1.3 方 法
1.3.1 黑豆红色素的提取工艺流程 黑豆皮粉→酶解提取→抽滤→合并各次滤液→50 ℃减压浓缩→冻干→黑豆红色素→计算红色素提取率
红色素提取率=（红色素干质量/黑豆皮干质量）×100%
1.3.2 单因素试验 分别对影响黑豆红色素提取效果的单因素如酶用量、酶解pH值、酶解温度、料液比、酶解时间、提取次数等进行研究。
1.3.3 正交试验 在单因素试验的基础上，对较显著的4个单因素分别选取3个最优水平，依据L9（34）正交试验表筛选最优组合以确定双酶法提取黑豆红色素的最佳工艺。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 酶用量（果胶酶+纤维素酶）对黑豆红色素提取率的影响 称取1 g黑豆皮粉，在酶解pH值为4.6，酶解温度为45 ℃、料液比1∶20、提取120 min条件下，分别对提取液的不同酶用量（果胶酶+纤维素酶）：1+0、0+1、0.5+0.5、0.5+1、1+0.5、1+1、1+2、1+3、1+4、2+1、2+2、2+3、2+4 mg进行考察，提取1次，称重后计算红色素提取率。
由图1可知，单独使用果胶酶或纤维素酶的酶解效果均低于混合使用效果，在酶用量为果胶酶（mg）+纤维素酶（mg）为（2+1） mg时红色素提取率最高。试验结果表明，在酶用量较高时，红色素提取率均有不同程度的下降，原因可能是底物浓度不能对酶达到饱和，导致酶的作用受到抑制，导致色素提取率呈下降趋势[14-16]。 2.1.2 酶解pH值对黑豆红色素提取率的影响 称取1 g黑豆皮粉，根据2.1.1结果，选择红色素提取率最高的酶用量，在酶解温度为45 ℃、料液比1∶20、提取120 min条件下，分别对提取液pH 值分别为3.6、4、4.6、5、5.6、6的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液进行考察，提取1次，称质量后计算红色素提取率，结果如图2。
2.1.3 酶解温度对黑豆红色素提取率的影响 称取1 g黑豆皮粉，根据2.1.2结果，选择红色素提取率最高的酶用量、酶解pH值，在料液比1∶20、提取120 min条件下，分别对提取液的不同酶解温度35、40、45、50、55、60 ℃进行考察，提取1次，称重后计算红色素提取率。
由图3可知，从35～55 ℃，随着酶解温度的提高，红色素提取率随之增加，继续提高温度，提取率随之下降，说明纤维素酶和果胶酶双酶酶解提取黑豆红色素最适温度为55 ℃。
2.1.4 料液比对黑豆红色素提取率的影响 称取1 g黑豆皮粉，根据2.1.3结果，选择红色素提取率最高的酶用量、酶解pH值、酶解温度，在提取120 min条件下，分别对提取液的不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40进行考察，提取1次，称重后计算红色素提取率。
由图4可知，料液比在1∶25时红色素提取率为19.14%，达到最高。
2.1.5 酶解时间对黑豆红色素提取率的影响 称取1 g黑豆皮粉，根据2.1.4结果，选择红色素提取率最高的酶用量、酶解pH值、酶解温度、料液比，分别对提取液的不同酶解时间60、90、120、150、180、210 min进行考察，提取1次，称质量后计算红色素提取率。
由图5可知，从60～120 min，随着酶解时间的增加，红色素提取率随之提高。如继续增加酶解时间，提取率无明显变化，所以确定黑豆红色素最适酶解时间为120 min。
2.1.6 提取次数对黑豆红色素提取率的影响 称取1 g黑豆皮粉，根据2.1.5结果，选择红色素提取率最高的酶用量、酶解pH值、酶解温度、料液比、酶解时间，分别对提取液的不同提取次数1、2、3次进行考察，合并各次滤液，称质量后计算红色素提取率。
由图6可知，随着提取次数的增加，红色素提取率随之提高。但第3次的提取率无明显增加，从节约能源的角度考虑，确定黑豆红色素最佳提取次数为2次。
单因素试验结果表明，黑豆红色素最佳提取条件为：酶用量（果胶酶+纤维素酶） （2+1）mg、 酶解pH值4、酶解温度55 ℃、料液比1∶25、酶解时间120 min、提取2次。
2.2 正交试验结果
在单因素试验基础上，对较显著的因素酶用量、酶解pH值、酶解温度、料液比等4个因素分别选取3个最优水平，依据L9（34）表安排正交试验，见表1，得出黑豆红色素最佳酶解提取条件。
由表2正交试验结果极差R值大小可知，4个因素对黑豆红色素的提取率影响为：B（酶解pH值）>A（酶用量）>D（料液比）>C（酶解温度）。最优提取组合为A2B1C2D3，即酶用量（果胶酶+纤维素酶）（2+1） mg、酶解pH值3.6、酶解温度55 ℃、料液比1∶25，提取率达26.60%。方差分析表明，以因素C为误差项，因素A和B对黑豆红色素提取率的影响差异显著（P<0.05），因素C和D差异不显著（P >0.05），与极差分析结果一致。
3 结 论
以黑豆皮为原料，分别对影响黑豆红色素提取率的单因素如酶用量、酶解pH值、酶解温度、料液比、酶解时间、提取次数等进行研究。在此基础上，对较显著的4个单因素分别选取3个最优水平安排正交试验，确定双酶法提取黑豆红色素最佳条件：酶用量（果胶酶+纤维素酶）（2+1） mg、酶解pH值3.6、酶解温度55 ℃、料液比1∶25、酶解时间120 min、提取2次，提取率高达26.60%。
在各种黑豆制品如豆油、豆乳、豆粉等的生产过程中，为改善产品风味、防止非酶褐变，并赋予产品良好的色泽等，通常要将黑豆进行脱皮等预处理工序，因此在豆制品的生产过程中会得到大量的副产品，即黑豆皮。我国拥有丰富的黑豆资源，从黑豆制品加工的下脚料黑豆皮中提取天然色素，成本低廉、工艺简单且易实现工业化，因此具有良好的开发应用前景。试验结果表明，采用双酶法提取黑豆红色素简单高效、提取条件温和且无溶剂残留问题，适用于食品工业规模化生产。
参考文献：
[1] Kwon S H，Ahn I S，Kim S O，et al. Anti-obesity and hypolipidemic effects of black soybean anthocyanins[J].J Med Food，2007，10（3）：552-556.
[2] 曹春艳，赵永华，赵莹莹.黑豆衣色素提取工艺的研究[J].粮食与饲料工，2012（9）：22-24.
[3] 崔蕊静，李凤英，李春华.黑豆衣红色素提取及影响其稳定性因素分析[J].中国粮油学报，2004，19（1）：48-51.
[4] 徐亚维，赵杨，魏馨，等.黑豆衣原花青素提取工艺的优化[J].贵州农业科学，2011，39（2）：229-231.
[5] 朱宏达，张慧，张美荣，等.黑豆红色素的提取工艺及其理化性质的研究[J].中国食品添加剂，2009（1）：86-90.
[6] 王少波，杜永峰，姚秉华.pH示差法测定黑豆衣中的花青素[J].化学分析计量，2008，17（1）：46-48.
[7] 肖怀秋，李玉珍.黑豆衣中红色色素萃取工艺的响应面优化[J].氨基酸和生物资源，2010，32（2）：30-34.
[8] 黄昉，李汴生，徐志宏.黑豆种皮色素的测定和提取[J].食品工业科技，2004，25（4）：117-120.
[9] 李大婧，宋江峰，刘春泉，等.超声波辅助提取黑豆衣色素工艺优化[J].农业工程学报，2009，25（2）：273-279.
[10] 王少波.黑豆衣中花色苷的提取及纯化研究[D].西安：西安理工大学，2008.
[11] 高雪琴，王若兰，杨建平.黑豆衣红色素微波辅助提取与乙醇浸提的工艺比较研究[J].食品与药品，2006，8（05A）：39-41.
[12] 郭凤华，王慧.天然色素的提取和应用研究[J].山东食品发酵，2008（1）：27-30.
[13] 孙晓侠，马龙.纤维素酶法提取黑豆衣色素的工艺研究[J].食品工业科技，2010，31（10）：319-321.
[14] 苏东林，单杨，李高阳，等.酶法辅助提取柑桔皮总黄酮的工艺优化研究[J].农业工程学报，2008，24（4）：240-245.
[15] 张秀秀，魏学智，赵瑞芬，等. 酶液提取扁核木叶片总黄酮的工艺优化[J].山西农业科学，2015（1）：81-84.
[16] 张康逸，范运乾，康志敏，等.超声波辅助纤维素酶法提取紫玉米芯色素工艺研究[J].河南农业科学，2013（6）：152-155.