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摘要：本实验采用单层牛津杯叠法，对酸菜汁中的防腐乳杆菌进行检测及筛选，得到一株优势抑菌乳酸菌，该菌具有良好的抑菌特性，对改良发酵酸菜品质、延长酸菜产品保质期具有重大意义。
关键词：酸菜加工;防腐;乳杆菌;检测
1前言
发酵果蔬是日常饮食的一部分，具有很高的经济重要性。然而微生物的生长繁殖造成这类产品的腐败也是发酵果蔬行业上的一个主要问题。通常认为乳酸菌是安全的，乳酸菌被广泛应用在各类食品中，其生理功能和特点在食品加工中发挥了重要作用它们在食品工业中的使用有助于减少添加化学防腐剂和强化热处理，迄今为止，只有乳酸链球菌素是食品级细菌素。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一类形态、代谢性能和生理学特征不完全相同，可发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌的统称，乳酸菌代谢产生有机酸，如乳酸，乙酸和丙酸作为碳水化合物代谢的发酵终产物。据Ross等报道称，这些弱有机物产酸导致酸性环境，抑制细菌和真菌，包括许多致病微生物和腐败微生物的生长，而Batish等【1】研究发现这些弱有机酸的抗菌作用归因于将pH降低至低于未分解有机物生长和代谢抑制范围的水平。研究报告表明乳酸菌有益人体健康，同时这些有益乳酸菌在食物中有很长的使用历史，它们产生一些拮抗性化合物，特别是能够控制病原菌和有害的腐败菌群，使用乳酸菌来控制霉菌生长是物理和化学方法的替代，因为这些细菌已经被报道具有强的抗微生物性质。研究发现一些复配防腐剂易引起致癌、致畸、致突变和引起食物中毒等问题，其使用量越来越受到众多国家的限制。同时从多地区多厂家的酸菜质量抽查报告中显示，不合格样品屡屡增多，为防止微生物超标而滥用或超剂量使用防腐剂是其主要原因。因此，在保证酸菜品质的同时，如何安全、规范的使用防腐剂来延长其保质期成为了酸菜行业中函待解决的问题，同时也是成为国内外食品安全领域的研究热点。
近几年来，为防止食品及农产品产前、产后的腐败变质，主要的解决方法是添加化学防腐剂，用于防止食品在储存【2】、流通过程中主要由微生物繁殖引起的变质而使用的食品添加剂，李佰秋等【3】，研究Nisin与植酸复配对腌制蔬菜中G+腐败菌的抑制效果。通过检查与筛选酸菜发酵中的防腐乳杆菌，不仅能改良食品的品质、延长食品的保质期，还可以抑制腐败菌的生长，降低食品安全风险，同时也是未来防腐领域研究的重点【4】。具有高抑霉潜力的菌株可用于新食品的开发，同时也有助于最终产品的质量和安全性。
2材料与方法
2.1 试验材料
大白菜、土豆，食盐。抑菌试验的指示菌株：引起酸菜在发酵过程中霉变的白地霉（GeotrichumCandidum）;引起酸菜在发酵过程中产醭的假丝酵母（Candida xestobii），复配菌株：前期实验筛选得到的亚硝酸盐降解率高达94.2%的植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum），由吉林农业大学食品安全实验室提供
2.2主要试剂与培养基
（1）试剂：铁氰化钾，乳酸，三氯乙酸，吡啶、邻苯二酚紫、1.10-菲罗一水合物，胰蛋白酶、胃蛋白酶，L-半胱氨酸盐酸盐分析纯级化学试剂;胰蛋白胨、酵母浸粉OXOID.LTD;（2）培养基：MRS肉汤培养基、YPD培养基、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、NA培养基、驯化培养基：酸菜汁与MRS液体培养基的比例依次为1：9、1：4、3：7、2：3、1：1、3：2、7：3、4：1、9：1、1，通过榨取市售酸菜而获得酸菜汁，驯化培养基经121℃、15min灭菌备用（3）仪器：UV-1800型紫外分光光度计;离心机、YXQ-LS-75G型高压蒸汽灭菌锅;SHP-250型恒温培养箱等。
2.3防腐乳杆菌的筛选
（1）防腐乳杆菌的初筛：菌株的分离培养：取不同发酵时期的自然发酵的酸菜为分离样，压榨成汁，过滤取10mL滤液，用无菌生理盐水分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，取0.1mL涂布于NA培养基中，37℃下培养48h，每个梯度做三组平行，挑取单菌落于NA培养基中进行画线纯化2-3次，4℃保藏备用;菌株发酵上清液的制备：在37℃下，将菌株接种到10mLMRS肉汤中活化2次，然后取200μL活化好的发酵液，接种到20mL新鲜无菌的MRS培养液中，37℃下生长72h而不摇动，最后，在7200 r/min，离心10min弃去菌体，即获得菌株发酵上清液;牛津杯抑菌试验：指示菌活化3代后，以1%（v/v）的接种量接种到MRS液体培养基中于37℃下培养36h后，将菌株的发酵液在4000 r/min离心10min后，收集发酵液，吸取0.2mL发酵上清液，利用牛津杯琼脂扩散法测定供试菌株发酵液的抑菌活性。
（2）防腐乳杆菌的复筛：排除有机酸对菌株抑菌的影响：测定方法参考张旭等[77]的研究。取两个小烧杯，倒入适量的蒸馏水，测定抑菌菌株发酵液的pH值，分别用36%乳酸和80%乙酸去调节蒸馏水的pH值，使其与抑菌发酵液的pH值相同，然后将抑菌发酵液在4000r/min，离心10min，取200μL发酵上清液做对照，做牛津杯抑菌试验，做3组重复。排除过氧化氢对菌株抑菌的影响：将过氧化氢酶添加到发酵上清液中，使过氧化氢酶的终浓度为5μg/mL，在30℃孵育2h，以未经过氧化氢酶处理的发酵上清液为对照组，用牛津杯琼脂扩散法测定抑菌活性，并用直尺测量抑菌圈直径。蛋白酶敏感性试验：将胰蛋白酶、胃蛋白酶分别溶解在经过氧化氢酶处理后的发酵上清液中，使酶终浓度为5mg/L，在30℃孵浴2h，以稀释相同倍数的发酵上清液做对照，做3个重复，采用牛津杯法测定抑菌活性，记录抑菌圈直径。
3结果与分析
通过检测发现乳酸菌在发酵过中可能会产生有机酸、过氧化氢、细菌素等抑菌物质，如：乙酸、苯丙酸等，细菌素（Bacteriocin）【5】是细菌在代谢过程中由核糖体合成，基因编码的一类具有抑菌生物活性的多肽或蛋白质类物质。因其高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性及良好的生物多肽或蛋白类物质要筛选产细菌素的菌株【6】，首先要排除干扰，再验证抑菌物质是否为蛋白类抑菌物质。本试验结果表明：初筛选出6株抑菌菌株，经排除干扰后，筛选出1株菌株SC21乳酸菌，通过温度、pH对菌株发酵上清液的影响以及发酵上清液对酶的敏感性的研究表明，发酵上清液中的抑菌物质对细菌有抑制作用。
参考文献
[1]于红，李佰秋. 食品防腐剂的使用[J]. 企业标准化，2007（3）：33-33.
[2].韩德权，王艺，孙庆申，等. 纳他霉素提高酸菜感官品质的研究[J]. 食品科學，2010，31（23）：314-316.
[3].何鹏晖，厍晓，钱杨，等. 发酵蔬菜中腐败微生物及其防控的研究进展[J]. 食品工业科技，2017，38（11）：374-378.
[4]沈娟，于中玉，仇建飞. 乳酸菌在食品发酵中的应用[J]. 食品安全导刊，2017（33）：125-125.
[5]冬天水果热着吃-中国保健营养-2013年第1期（2）
[6]陈德昭等.中国植物志（第三十六卷）.北京：北京科学出版社，1988.
（作者单位：和光食品（烟台）有限公司）
关键词：酸菜加工;防腐;乳杆菌;检测
1前言
发酵果蔬是日常饮食的一部分，具有很高的经济重要性。然而微生物的生长繁殖造成这类产品的腐败也是发酵果蔬行业上的一个主要问题。通常认为乳酸菌是安全的，乳酸菌被广泛应用在各类食品中，其生理功能和特点在食品加工中发挥了重要作用它们在食品工业中的使用有助于减少添加化学防腐剂和强化热处理，迄今为止，只有乳酸链球菌素是食品级细菌素。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一类形态、代谢性能和生理学特征不完全相同，可发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌的统称，乳酸菌代谢产生有机酸，如乳酸，乙酸和丙酸作为碳水化合物代谢的发酵终产物。据Ross等报道称，这些弱有机物产酸导致酸性环境，抑制细菌和真菌，包括许多致病微生物和腐败微生物的生长，而Batish等【1】研究发现这些弱有机酸的抗菌作用归因于将pH降低至低于未分解有机物生长和代谢抑制范围的水平。研究报告表明乳酸菌有益人体健康，同时这些有益乳酸菌在食物中有很长的使用历史，它们产生一些拮抗性化合物，特别是能够控制病原菌和有害的腐败菌群，使用乳酸菌来控制霉菌生长是物理和化学方法的替代，因为这些细菌已经被报道具有强的抗微生物性质。研究发现一些复配防腐剂易引起致癌、致畸、致突变和引起食物中毒等问题，其使用量越来越受到众多国家的限制。同时从多地区多厂家的酸菜质量抽查报告中显示，不合格样品屡屡增多，为防止微生物超标而滥用或超剂量使用防腐剂是其主要原因。因此，在保证酸菜品质的同时，如何安全、规范的使用防腐剂来延长其保质期成为了酸菜行业中函待解决的问题，同时也是成为国内外食品安全领域的研究热点。
近几年来，为防止食品及农产品产前、产后的腐败变质，主要的解决方法是添加化学防腐剂，用于防止食品在储存【2】、流通过程中主要由微生物繁殖引起的变质而使用的食品添加剂，李佰秋等【3】，研究Nisin与植酸复配对腌制蔬菜中G+腐败菌的抑制效果。通过检查与筛选酸菜发酵中的防腐乳杆菌，不仅能改良食品的品质、延长食品的保质期，还可以抑制腐败菌的生长，降低食品安全风险，同时也是未来防腐领域研究的重点【4】。具有高抑霉潜力的菌株可用于新食品的开发，同时也有助于最终产品的质量和安全性。
2材料与方法
2.1 试验材料
大白菜、土豆，食盐。抑菌试验的指示菌株：引起酸菜在发酵过程中霉变的白地霉（GeotrichumCandidum）;引起酸菜在发酵过程中产醭的假丝酵母（Candida xestobii），复配菌株：前期实验筛选得到的亚硝酸盐降解率高达94.2%的植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum），由吉林农业大学食品安全实验室提供
2.2主要试剂与培养基
（1）试剂：铁氰化钾，乳酸，三氯乙酸，吡啶、邻苯二酚紫、1.10-菲罗一水合物，胰蛋白酶、胃蛋白酶，L-半胱氨酸盐酸盐分析纯级化学试剂;胰蛋白胨、酵母浸粉OXOID.LTD;（2）培养基：MRS肉汤培养基、YPD培养基、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、NA培养基、驯化培养基：酸菜汁与MRS液体培养基的比例依次为1：9、1：4、3：7、2：3、1：1、3：2、7：3、4：1、9：1、1，通过榨取市售酸菜而获得酸菜汁，驯化培养基经121℃、15min灭菌备用（3）仪器：UV-1800型紫外分光光度计;离心机、YXQ-LS-75G型高压蒸汽灭菌锅;SHP-250型恒温培养箱等。
2.3防腐乳杆菌的筛选
（1）防腐乳杆菌的初筛：菌株的分离培养：取不同发酵时期的自然发酵的酸菜为分离样，压榨成汁，过滤取10mL滤液，用无菌生理盐水分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，取0.1mL涂布于NA培养基中，37℃下培养48h，每个梯度做三组平行，挑取单菌落于NA培养基中进行画线纯化2-3次，4℃保藏备用;菌株发酵上清液的制备：在37℃下，将菌株接种到10mLMRS肉汤中活化2次，然后取200μL活化好的发酵液，接种到20mL新鲜无菌的MRS培养液中，37℃下生长72h而不摇动，最后，在7200 r/min，离心10min弃去菌体，即获得菌株发酵上清液;牛津杯抑菌试验：指示菌活化3代后，以1%（v/v）的接种量接种到MRS液体培养基中于37℃下培养36h后，将菌株的发酵液在4000 r/min离心10min后，收集发酵液，吸取0.2mL发酵上清液，利用牛津杯琼脂扩散法测定供试菌株发酵液的抑菌活性。
（2）防腐乳杆菌的复筛：排除有机酸对菌株抑菌的影响：测定方法参考张旭等[77]的研究。取两个小烧杯，倒入适量的蒸馏水，测定抑菌菌株发酵液的pH值，分别用36%乳酸和80%乙酸去调节蒸馏水的pH值，使其与抑菌发酵液的pH值相同，然后将抑菌发酵液在4000r/min，离心10min，取200μL发酵上清液做对照，做牛津杯抑菌试验，做3组重复。排除过氧化氢对菌株抑菌的影响：将过氧化氢酶添加到发酵上清液中，使过氧化氢酶的终浓度为5μg/mL，在30℃孵育2h，以未经过氧化氢酶处理的发酵上清液为对照组，用牛津杯琼脂扩散法测定抑菌活性，并用直尺测量抑菌圈直径。蛋白酶敏感性试验：将胰蛋白酶、胃蛋白酶分别溶解在经过氧化氢酶处理后的发酵上清液中，使酶终浓度为5mg/L，在30℃孵浴2h，以稀释相同倍数的发酵上清液做对照，做3个重复，采用牛津杯法测定抑菌活性，记录抑菌圈直径。
3结果与分析
通过检测发现乳酸菌在发酵过中可能会产生有机酸、过氧化氢、细菌素等抑菌物质，如：乙酸、苯丙酸等，细菌素（Bacteriocin）【5】是细菌在代谢过程中由核糖体合成，基因编码的一类具有抑菌生物活性的多肽或蛋白质类物质。因其高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性及良好的生物多肽或蛋白类物质要筛选产细菌素的菌株【6】，首先要排除干扰，再验证抑菌物质是否为蛋白类抑菌物质。本试验结果表明：初筛选出6株抑菌菌株，经排除干扰后，筛选出1株菌株SC21乳酸菌，通过温度、pH对菌株发酵上清液的影响以及发酵上清液对酶的敏感性的研究表明，发酵上清液中的抑菌物质对细菌有抑制作用。
参考文献
[1]于红，李佰秋. 食品防腐剂的使用[J]. 企业标准化，2007（3）：33-33.
[2].韩德权，王艺，孙庆申，等. 纳他霉素提高酸菜感官品质的研究[J]. 食品科學，2010，31（23）：314-316.
[3].何鹏晖，厍晓，钱杨，等. 发酵蔬菜中腐败微生物及其防控的研究进展[J]. 食品工业科技，2017，38（11）：374-378.
[4]沈娟，于中玉，仇建飞. 乳酸菌在食品发酵中的应用[J]. 食品安全导刊，2017（33）：125-125.
[5]冬天水果热着吃-中国保健营养-2013年第1期（2）
[6]陈德昭等.中国植物志（第三十六卷）.北京：北京科学出版社，1988.
（作者单位：和光食品（烟台）有限公司）