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原发性肝细胞癌(HCC)是世界十大恶性肿瘤之一，我国每年死于肝癌的人数约为11万，占世界死亡总数的40%左右。为了早期发现早期诊断达到早期治疗原发性肝癌，我们采用荧光PCR定量检测外周血中AFPmRNA,报告如下。
材料与方法
材料：收集住院确诊的原发性肝癌患者标本40例(肝外转移20例，无肝外转移20例)，慢性肝炎患者标本20例，肝硬化患者标本17例，健康人26例。
仪器：自动荧光PCR分析仪，免疫分析仪。
试剂：AFP试剂盒。
荧光定量PCR检测AFPmRNA方法的建立：①引物、探针的设计、合成从GenBank中调出AFP的DNA和RNA序列，根据引物设计原则，上游引物位于外显子1和2之间，序列为5′-TGGAATAGCTTCCATATTGGATTC-3′。下游引物位于外显子3上，序列为5′-CCAGTTTGTTCAAGAAGCCACTT-3′。②MGB探针的设计、合成：根据PE公司提供的引物探针设计软件，设计的MGB探针的序列如下：5′-TACTGCAGAGATAAGTTT-3′。
荧光定量PCR检测外周血中AFPmRNA的检测：①荧光PCR检测外周血中AFPmRNA：标本收集和总RNA的提取：各组于晨起空腹抽外周静脉血5ml，枸橼酸钠抗凝，以淋巴细胞分离液密度离心法分离外周血单个核细胞(PMNC)。标本冻于-80℃用TRInol试剂提取PMNC总RNA，逆转录成cDNA。②荧光定量PCR检测外周血中AFPmRNA反应体系：5×PCR buffer 10μl，上下游引物各0.3μmol/L，10mmol dNTPs 1μl，探针0.06μmol/L，Taq DNA聚合酶3U，cDNA或阳性模板5μl，加无菌去离子水至50μl。加5μl于不同的反应管中，在PE7700扩增仪上进行扩增。反应条件为：93℃ 2分钟，93℃ 30秒，60℃ 1分钟，共40个循环，所有反应信息资料被PE7700扩增仪收集并储存于其附件Macintosh电脑(含相应的分析软件)中，反应结束后该电脑根据阳性定量标准模板的扩增情况自动绘制标准曲线。根据阳性定量模板和待测样本的扩增情况，算出反应体系中待测样本中cDNA的拷贝数。
结 果
26例健康人AFPmRNA均阴性
肝病患者AFPmRNA的检测结果，见表1。
21例原发性肝癌AFPmRNA阳性标本血清中AFP阴性7例。
AFPmRNA早期肝癌Ⅰ期6例，Ⅱ期11例阳性，进行24～50个月的追踪观察发现患者外周血AFPmRNA与肝癌复发呈正相关。
讨 论
荧光定量PCR是近两年发展起来的一项新技术［1~3］。荧光定量PCR技术既巧妙地利用了PCR技术核酸扩增的高效性，探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性及计量高准确性等优点，同时又克服了普通PCR技术易污染，不能定量，探针杂交灵敏度不高，分离洗脱条件不易控制等不足，在疾病的基因诊断中有广阔的应用前景。
采用荧光定量PCR技术检测外周血中AFPmRNA在40例肝癌患者中72.5%(29/40)阳性，期中肝外转移阳性率100%(20/20)，无肝外转移阳性率45%(9/20)，慢性肝炎10%(2/20)，肝硬化23.5%(4/17)。表明外周血中AFPmRNA检测出率与肝肿瘤大小、临床分期及有无肝外转移密切相关［4］。
原发性肝癌(肝外转移、无肝外转移)、肝硬化AFPMRNA拷贝在1.42E4～7.69E8之间，而慢性肝炎AFPmRNA拷贝仅在1.08E3～5.21E5之间，提示AFPmRNA在外周血中的数量与病情有密切关系。
AFPmRNA早期肝癌Ⅰ期6例阳性，Ⅱ期11例阳性，进行24～50个月追踪观察发现患者外周血AFPmRNA与肝癌复发呈正相关。提示AFPmRNA的表达可以促进肿瘤的生长［6］，推测外周血中AFPmRNA也许是肝癌在早期复发的一个指标，并且连续检测外周血AFPmRNA可以作为一个预后因子。
在21例原发性肝癌AFPmRNA阳性标本血清中AFP有7例阴性，说明AFPmRNA比血清AFP更敏感，联合检测外周血中AFPmRNA可能有助于提高血清AFP阴性或低阳性肝癌的诊断灵敏度，在慢性活动性肝炎和肝硬化的恶变的检测和肝癌的早期诊断上也可能有一定的意义。
参考文献
1 Lee LG,Connel CR,Bloch W.Alleli,et al.Discrimination by nicktranslation PCR with fluogenic probes.Nuckeic Acids Res,1993,21(16):3761-3766.
2 Livak KJ,Flood SJA,Marmaro J,et al.Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization.PCR Methods Appl,1995,4(6):357-362.
3 Haid CA,Stevens J,Livak KJ,et al.Real time quantitative PCR.Genome Research,1996,6(10):986-994.
4 Matsumura M,Niwa Y,Kato N,et al.Hepatology,1994,20:1418-14.
5 Niwa Y,Matsumura M,Shiratori Y,et al.Quantitation of alpha-fetoprotein and albumin messenger RNAs in human hepatocellular carcinoma.Hepatology,1996,23(6):1384-1392.
6 Shian-yang Peng,Po-lin Lai,Juan-shiu Chu,et al.Expression and hypomethylation of α-fetoprotein gene in unicenter and multicentric human hepatocellular carcinoma.Hepatology,1993,17(1):35-41.
7 刘杨,张柏和,陈汉,等.巢式RT-PCR定量检测肝癌、癌旁组织及正常肝组织内AFPmRNA.肝胆胰外科杂志,2001,13(1):6-7.
材料与方法
材料：收集住院确诊的原发性肝癌患者标本40例(肝外转移20例，无肝外转移20例)，慢性肝炎患者标本20例，肝硬化患者标本17例，健康人26例。
仪器：自动荧光PCR分析仪，免疫分析仪。
试剂：AFP试剂盒。
荧光定量PCR检测AFPmRNA方法的建立：①引物、探针的设计、合成从GenBank中调出AFP的DNA和RNA序列，根据引物设计原则，上游引物位于外显子1和2之间，序列为5′-TGGAATAGCTTCCATATTGGATTC-3′。下游引物位于外显子3上，序列为5′-CCAGTTTGTTCAAGAAGCCACTT-3′。②MGB探针的设计、合成：根据PE公司提供的引物探针设计软件，设计的MGB探针的序列如下：5′-TACTGCAGAGATAAGTTT-3′。
荧光定量PCR检测外周血中AFPmRNA的检测：①荧光PCR检测外周血中AFPmRNA：标本收集和总RNA的提取：各组于晨起空腹抽外周静脉血5ml，枸橼酸钠抗凝，以淋巴细胞分离液密度离心法分离外周血单个核细胞(PMNC)。标本冻于-80℃用TRInol试剂提取PMNC总RNA，逆转录成cDNA。②荧光定量PCR检测外周血中AFPmRNA反应体系：5×PCR buffer 10μl，上下游引物各0.3μmol/L，10mmol dNTPs 1μl，探针0.06μmol/L，Taq DNA聚合酶3U，cDNA或阳性模板5μl，加无菌去离子水至50μl。加5μl于不同的反应管中，在PE7700扩增仪上进行扩增。反应条件为：93℃ 2分钟，93℃ 30秒，60℃ 1分钟，共40个循环，所有反应信息资料被PE7700扩增仪收集并储存于其附件Macintosh电脑(含相应的分析软件)中，反应结束后该电脑根据阳性定量标准模板的扩增情况自动绘制标准曲线。根据阳性定量模板和待测样本的扩增情况，算出反应体系中待测样本中cDNA的拷贝数。
结 果
26例健康人AFPmRNA均阴性
肝病患者AFPmRNA的检测结果，见表1。
21例原发性肝癌AFPmRNA阳性标本血清中AFP阴性7例。
AFPmRNA早期肝癌Ⅰ期6例，Ⅱ期11例阳性，进行24～50个月的追踪观察发现患者外周血AFPmRNA与肝癌复发呈正相关。
讨 论
荧光定量PCR是近两年发展起来的一项新技术［1~3］。荧光定量PCR技术既巧妙地利用了PCR技术核酸扩增的高效性，探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性及计量高准确性等优点，同时又克服了普通PCR技术易污染，不能定量，探针杂交灵敏度不高，分离洗脱条件不易控制等不足，在疾病的基因诊断中有广阔的应用前景。
采用荧光定量PCR技术检测外周血中AFPmRNA在40例肝癌患者中72.5%(29/40)阳性，期中肝外转移阳性率100%(20/20)，无肝外转移阳性率45%(9/20)，慢性肝炎10%(2/20)，肝硬化23.5%(4/17)。表明外周血中AFPmRNA检测出率与肝肿瘤大小、临床分期及有无肝外转移密切相关［4］。
原发性肝癌(肝外转移、无肝外转移)、肝硬化AFPMRNA拷贝在1.42E4～7.69E8之间，而慢性肝炎AFPmRNA拷贝仅在1.08E3～5.21E5之间，提示AFPmRNA在外周血中的数量与病情有密切关系。
AFPmRNA早期肝癌Ⅰ期6例阳性，Ⅱ期11例阳性，进行24～50个月追踪观察发现患者外周血AFPmRNA与肝癌复发呈正相关。提示AFPmRNA的表达可以促进肿瘤的生长［6］，推测外周血中AFPmRNA也许是肝癌在早期复发的一个指标，并且连续检测外周血AFPmRNA可以作为一个预后因子。
在21例原发性肝癌AFPmRNA阳性标本血清中AFP有7例阴性，说明AFPmRNA比血清AFP更敏感，联合检测外周血中AFPmRNA可能有助于提高血清AFP阴性或低阳性肝癌的诊断灵敏度，在慢性活动性肝炎和肝硬化的恶变的检测和肝癌的早期诊断上也可能有一定的意义。
参考文献
1 Lee LG,Connel CR,Bloch W.Alleli,et al.Discrimination by nicktranslation PCR with fluogenic probes.Nuckeic Acids Res,1993,21(16):3761-3766.
2 Livak KJ,Flood SJA,Marmaro J,et al.Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization.PCR Methods Appl,1995,4(6):357-362.
3 Haid CA,Stevens J,Livak KJ,et al.Real time quantitative PCR.Genome Research,1996,6(10):986-994.
4 Matsumura M,Niwa Y,Kato N,et al.Hepatology,1994,20:1418-14.
5 Niwa Y,Matsumura M,Shiratori Y,et al.Quantitation of alpha-fetoprotein and albumin messenger RNAs in human hepatocellular carcinoma.Hepatology,1996,23(6):1384-1392.
6 Shian-yang Peng,Po-lin Lai,Juan-shiu Chu,et al.Expression and hypomethylation of α-fetoprotein gene in unicenter and multicentric human hepatocellular carcinoma.Hepatology,1993,17(1):35-41.
7 刘杨,张柏和,陈汉,等.巢式RT-PCR定量检测肝癌、癌旁组织及正常肝组织内AFPmRNA.肝胆胰外科杂志,2001,13(1):6-7.