论文部分内容阅读
摘要：目的 评价基于bmp基因的套式PCR（nested-PCR）在梅毒诊断中的应用价值。方法 设计两对针对bmp的套式PCR引物，对300份棉拭子临床标本进行基因扩增，并与暗视野镜检和血清学试验做比较，分析其特异性和敏感性。结果 300份临床标本中共检测出阳性标本276例，其灵敏度和特异性分别为92%和99.3%，与暗视野镜检和ELISA法相比，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 套式PCR法在梅毒诊断中具有较好的灵敏度和特异性，可以作为暗视野镜检和血清学检测的有益补充。
关键词：梅毒螺旋体；套式PCR；bmp基因
[Abstarct]Objective To assess the application value of bmp-based nested-PCR in the detection of Treponema pallidum.Methods Two specific primers of bmp gene were designed，and Treponema pallidum were detected from 300 swabs.Dark-field microscopy and serology test were used as controls，and the sensitivity and specificity were evaluated.Results 276 swabs were positive by nested-PCR detection，and the sensitivity and specificity were 92% and 100%，respectively.There were statistically significant differences between nested-PCR，dark-field microscopy and ELISA.Conclusions bmp gene-based nested-PCR has higher sensitivity and specificity.It is a useful addition to dark-field microscopy and serology test for the detection of Treponema pallidum.
[Key words]Treponema pallidum，nested PCR，bmp gene
梅毒螺旋體（Treponema pallidum）是一种危害性大、传染性强的性传播病原体。在我国，梅毒的感染率和发病率在法定传染病中位居第3位[1]。因此，寻求快速、敏感且特异的检测方法对梅毒的防控具有重要的临床意义。迄今为止，梅毒螺旋体无法在体外培养，暗视野显微镜观察虽然是诊断的“金标准”，但操作繁琐且易产生假阳性结果，不利于临床大规模检测。随着梅毒螺旋体全基因组测序的完成[2]，目前已经建立了多种基于梅毒螺旋体特异性基因序列的PCR检测方法用于梅毒的诊断[3]。本研究通过建立以bmp为目的基因的套式PCR法，对梅毒患者硬下疳分泌物棉拭子标本进行检测，旨在评价其在梅毒诊断中的应用价值。
1 材料与方法
1.1 标本来源
以2008年1月至2012年10月张家界疾病预防控制中心获取的可疑梅毒患者临床标本为研究对象。其中男性210例，女90例，年龄21～54岁，平均（32.5±8.5岁）。采取患者硬下疳分泌物用于套式PCR分析和暗视野显微镜观察，同时采取血液标本用于ELISA分析。并选取同期健康体检的140例非梅毒患者为对照。
1.2 主要试剂
梅毒螺旋体ELISA试剂盒购自珠海丽珠试剂股份有限公司，TRUST试剂盒购自上海荣盛生物药业公司，DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，PCR试剂购自大连宝生物工程有限公司，PCR引物由上海Invitrogen公司合成。
1.3 套式PCR分析
根据梅毒螺旋体bmp基因设计2对引物。其中外套引物为5’- CAGGTAACGGATGCTGAAGT-3’和5’-CGTGGCAGTAACCGCAGTCT-3’，内套引物为5’-AGTTCGCCAATTACGTCAAG-3’和5’- ACGTAGCGCTGCTGGCT CAC-3’。最终产物为126bp。第一轮反应扩增条件：预变性94°C 10 min，20个循环（94°C 1 min，68°C 30 s，72°C 2 min）最后72°C 延伸10 min。第二轮反应条件：预变性94°C 10 min，30个循环（94°C 1 min，68°C 30 s，72°C 2 min）最后72°C 延伸10 min。反应结束后获取10μl产物用于琼脂糖凝胶电泳并在紫外线下观察，126bp处出现可视条带判断为阳性。
1.4 统计学分析
所有数据采用SPSS18.0统计学软件，不同方法比较采用χ2检验，p <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 套式PCR与暗视野镜检测结果比较
套式PCR检测结果以及与暗视野镜检检出率比较见图1和表1所示，其中套式PCR阳性率为92%，暗室野镜检阳性率为20.67%，套式PCR敏感性高于暗视野镜检（χ2=212.01，p<0.01）。
3 讨论
暗视野显微镜观察是检测梅毒螺旋体的一种主要方法，但其对技术员的要求和实验操作有较高的要求，还会受到病程和其他病原体等多种因素的影响，因此，该方法具有较高的假阴性率[4]。目前，实验室诊断一般结合暗视野镜检和血清学检测[5，6]。血清学检测是目前应用最广泛的方法，主要用于检测梅毒螺旋体的特异性抗体，但是在梅毒感染早期血清中抗体的产生量不足，容易产生假阴性结果。本研究结果也显示，ELISA法虽然具有较高的灵敏度（81.33%）和特异性（88.57%），但两者依然低于套式PCR的92%和99.29%。 PCR技术自从开始应用于临床诊断以来，因其灵敏度高、特异性好，且不受机体免疫状态的影响，已经成为早期快速诊断多种病原体的方法[7，8]。但随后的研究发现部分起始模板量较低的PCR实验不易成功。因此有人在第一对引物（外套引物，outer primers）扩增区域内另行设计第二对引物（内套引物，inner primers）并进行扩增。结果发现不仅提高了反应的灵敏度，特异性也随之增强[9，10]。这种应用外套、内套引物分别作二轮PCR扩增的方法称套式PCR，又名巢式PCR、套叠式PCR、嵌套式PCR 等。bmp基因（碱性膜蛋白）为梅毒螺旋體所特有，且与其他螺旋体同源性不高，因此被本研究所采用。通过对其进行两轮扩增，大大提高了检测结果的灵敏度和特异性。通过实验结果发现，套式PCR法的特异性为99.29%，且灵敏度也高达92%。
综上所述，套式PCR法具有较高灵敏度和特异性，是一种有效梅毒快速诊断方法。在早期梅毒临床诊断中，可以结合暗视野镜检和血清学检测，提高对梅毒的检出率，降低假阳性率和假阴性率，以避免误诊和漏诊。另外，对于一些梅毒检测结果阴性的患者，应同时结合多种检测方法和患者生活史，既往病史，临床表现等综合分析，作出正确的诊断。
参考文献：
[1]Stamm LV.Global challenge of antibiotic-resistant Treponema pallidum[J].Antimicrob Agents Chemother，2010，54（2）：583-589.
[2]Fraser CM，Norris SJ，Weinstock GM，et al.Complete genome sequence of Treponema pallidum，the syphilis spirochete[J].Science，1998，281（5375）：375-388.
[3]Muller H，Eisendle K，Brauninger W，et al.Comparative analysis of immunohistochemistry，polymerase chain reaction and focus-floating microscopy for the detection of Treponema pallidum in mucocutaneous lesions of primary，secondary and tertiary syphilis[J].Br J Dermatol，2011，165（1）：50-60.
[4]龚匡隆，邵长庚.早期梅毒暗视野检查梅毒螺旋体和梅毒血清试验的结果分析[J].中华皮肤科杂志，1999，（03）：31-32.
[5]Castro R，Prieto ES，Santo I，et al.Evaluation of an enzyme immunoassay technique for detection of antibodies against Treponema pallidum[J].J Clin Microbiol，2003，41（1）：250-253.
[6]Aktas G，Young H，Moyes A，et al.Evaluation of the fluorescent treponemal antibody absorption test for detection of antibodies（immunoglobulins G and M）to Treponema pallidum in serologic diagnosis of syphilis[J].Int J STD AIDS，2007，18（4）：255-260.
[7]Bruisten SM.Protocols for detection and typing of Treponema pallidum using PCR methods[J].Methods Mol Biol，2012，903：141-167.
[8]Grange PA，Gressier L，Dion PL，et al.Evaluation of a PCR test for detection of treponema pallidum in swabs and blood[J].J Clin Microbiol，2012，50（3）：546-552.
[9]Grange PA，Gressier L，Dion PL，et al.Evaluation of a PCR test for detection of treponema pallidum in swabs and blood[J].J Clin Microbiol，2012，50（3）：546-552.
[10]Wenhai L，Jianzhong Z，Cao Y.Detection of Treponema pallidum in skin lesions of secondary syphilis and characterization of the inflammatory infiltrate[J].Dermatology，2004，208（2）：94-97.
作者简介：胡俊忠（70-），男，副主任检验师，从事质量控制与微生物检验工作。
关键词：梅毒螺旋体；套式PCR；bmp基因
[Abstarct]Objective To assess the application value of bmp-based nested-PCR in the detection of Treponema pallidum.Methods Two specific primers of bmp gene were designed，and Treponema pallidum were detected from 300 swabs.Dark-field microscopy and serology test were used as controls，and the sensitivity and specificity were evaluated.Results 276 swabs were positive by nested-PCR detection，and the sensitivity and specificity were 92% and 100%，respectively.There were statistically significant differences between nested-PCR，dark-field microscopy and ELISA.Conclusions bmp gene-based nested-PCR has higher sensitivity and specificity.It is a useful addition to dark-field microscopy and serology test for the detection of Treponema pallidum.
[Key words]Treponema pallidum，nested PCR，bmp gene
梅毒螺旋體（Treponema pallidum）是一种危害性大、传染性强的性传播病原体。在我国，梅毒的感染率和发病率在法定传染病中位居第3位[1]。因此，寻求快速、敏感且特异的检测方法对梅毒的防控具有重要的临床意义。迄今为止，梅毒螺旋体无法在体外培养，暗视野显微镜观察虽然是诊断的“金标准”，但操作繁琐且易产生假阳性结果，不利于临床大规模检测。随着梅毒螺旋体全基因组测序的完成[2]，目前已经建立了多种基于梅毒螺旋体特异性基因序列的PCR检测方法用于梅毒的诊断[3]。本研究通过建立以bmp为目的基因的套式PCR法，对梅毒患者硬下疳分泌物棉拭子标本进行检测，旨在评价其在梅毒诊断中的应用价值。
1 材料与方法
1.1 标本来源
以2008年1月至2012年10月张家界疾病预防控制中心获取的可疑梅毒患者临床标本为研究对象。其中男性210例，女90例，年龄21～54岁，平均（32.5±8.5岁）。采取患者硬下疳分泌物用于套式PCR分析和暗视野显微镜观察，同时采取血液标本用于ELISA分析。并选取同期健康体检的140例非梅毒患者为对照。
1.2 主要试剂
梅毒螺旋体ELISA试剂盒购自珠海丽珠试剂股份有限公司，TRUST试剂盒购自上海荣盛生物药业公司，DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，PCR试剂购自大连宝生物工程有限公司，PCR引物由上海Invitrogen公司合成。
1.3 套式PCR分析
根据梅毒螺旋体bmp基因设计2对引物。其中外套引物为5’- CAGGTAACGGATGCTGAAGT-3’和5’-CGTGGCAGTAACCGCAGTCT-3’，内套引物为5’-AGTTCGCCAATTACGTCAAG-3’和5’- ACGTAGCGCTGCTGGCT CAC-3’。最终产物为126bp。第一轮反应扩增条件：预变性94°C 10 min，20个循环（94°C 1 min，68°C 30 s，72°C 2 min）最后72°C 延伸10 min。第二轮反应条件：预变性94°C 10 min，30个循环（94°C 1 min，68°C 30 s，72°C 2 min）最后72°C 延伸10 min。反应结束后获取10μl产物用于琼脂糖凝胶电泳并在紫外线下观察，126bp处出现可视条带判断为阳性。
1.4 统计学分析
所有数据采用SPSS18.0统计学软件，不同方法比较采用χ2检验，p <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 套式PCR与暗视野镜检测结果比较
套式PCR检测结果以及与暗视野镜检检出率比较见图1和表1所示，其中套式PCR阳性率为92%，暗室野镜检阳性率为20.67%，套式PCR敏感性高于暗视野镜检（χ2=212.01，p<0.01）。
3 讨论
暗视野显微镜观察是检测梅毒螺旋体的一种主要方法，但其对技术员的要求和实验操作有较高的要求，还会受到病程和其他病原体等多种因素的影响，因此，该方法具有较高的假阴性率[4]。目前，实验室诊断一般结合暗视野镜检和血清学检测[5，6]。血清学检测是目前应用最广泛的方法，主要用于检测梅毒螺旋体的特异性抗体，但是在梅毒感染早期血清中抗体的产生量不足，容易产生假阴性结果。本研究结果也显示，ELISA法虽然具有较高的灵敏度（81.33%）和特异性（88.57%），但两者依然低于套式PCR的92%和99.29%。 PCR技术自从开始应用于临床诊断以来，因其灵敏度高、特异性好，且不受机体免疫状态的影响，已经成为早期快速诊断多种病原体的方法[7，8]。但随后的研究发现部分起始模板量较低的PCR实验不易成功。因此有人在第一对引物（外套引物，outer primers）扩增区域内另行设计第二对引物（内套引物，inner primers）并进行扩增。结果发现不仅提高了反应的灵敏度，特异性也随之增强[9，10]。这种应用外套、内套引物分别作二轮PCR扩增的方法称套式PCR，又名巢式PCR、套叠式PCR、嵌套式PCR 等。bmp基因（碱性膜蛋白）为梅毒螺旋體所特有，且与其他螺旋体同源性不高，因此被本研究所采用。通过对其进行两轮扩增，大大提高了检测结果的灵敏度和特异性。通过实验结果发现，套式PCR法的特异性为99.29%，且灵敏度也高达92%。
综上所述，套式PCR法具有较高灵敏度和特异性，是一种有效梅毒快速诊断方法。在早期梅毒临床诊断中，可以结合暗视野镜检和血清学检测，提高对梅毒的检出率，降低假阳性率和假阴性率，以避免误诊和漏诊。另外，对于一些梅毒检测结果阴性的患者，应同时结合多种检测方法和患者生活史，既往病史，临床表现等综合分析，作出正确的诊断。
参考文献：
[1]Stamm LV.Global challenge of antibiotic-resistant Treponema pallidum[J].Antimicrob Agents Chemother，2010，54（2）：583-589.
[2]Fraser CM，Norris SJ，Weinstock GM，et al.Complete genome sequence of Treponema pallidum，the syphilis spirochete[J].Science，1998，281（5375）：375-388.
[3]Muller H，Eisendle K，Brauninger W，et al.Comparative analysis of immunohistochemistry，polymerase chain reaction and focus-floating microscopy for the detection of Treponema pallidum in mucocutaneous lesions of primary，secondary and tertiary syphilis[J].Br J Dermatol，2011，165（1）：50-60.
[4]龚匡隆，邵长庚.早期梅毒暗视野检查梅毒螺旋体和梅毒血清试验的结果分析[J].中华皮肤科杂志，1999，（03）：31-32.
[5]Castro R，Prieto ES，Santo I，et al.Evaluation of an enzyme immunoassay technique for detection of antibodies against Treponema pallidum[J].J Clin Microbiol，2003，41（1）：250-253.
[6]Aktas G，Young H，Moyes A，et al.Evaluation of the fluorescent treponemal antibody absorption test for detection of antibodies（immunoglobulins G and M）to Treponema pallidum in serologic diagnosis of syphilis[J].Int J STD AIDS，2007，18（4）：255-260.
[7]Bruisten SM.Protocols for detection and typing of Treponema pallidum using PCR methods[J].Methods Mol Biol，2012，903：141-167.
[8]Grange PA，Gressier L，Dion PL，et al.Evaluation of a PCR test for detection of treponema pallidum in swabs and blood[J].J Clin Microbiol，2012，50（3）：546-552.
[9]Grange PA，Gressier L，Dion PL，et al.Evaluation of a PCR test for detection of treponema pallidum in swabs and blood[J].J Clin Microbiol，2012，50（3）：546-552.
[10]Wenhai L，Jianzhong Z，Cao Y.Detection of Treponema pallidum in skin lesions of secondary syphilis and characterization of the inflammatory infiltrate[J].Dermatology，2004，208（2）：94-97.
作者简介：胡俊忠（70-），男，副主任检验师，从事质量控制与微生物检验工作。