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摘要：目的： 构建RP-HPLC法同时对血清镇静药物阿普唑仑和艾司唑仑含量进行快速检测。方法： 采用Techsphere-ODS色谱柱作为分析柱，甲醇：水（65：35）作为流动相，流速1.0mL/min，内标为硝西泮，检测波长为254nm，柱温室温。结果：艾司唑仑和阿普唑仑血浓线性范围0.25-3.0μg/mL，其中，最小检测浓度分别为12.5μg/L、12.5μg/L。日内、日间精密度良好，回收率较高，分别为100.49%、95.08%。结论： 该方法操作简便、结果可靠，可用于临床血清镇静药物阿普唑仑、艾司唑仑浓度测定。
关键词：血清；镇静药物；阿普唑仑；艾司唑仑；RP-HPLC；快速检验
Abstract： Objective To construct simultaneous rapid detection of serum sedative drugs Alprazolam and Estazolam in RP-HPLC method. Methods the Techsphere-ODS chromatographic column as the analytical column， methanol： water （65：35） as mobile phase， flow rate of 1.0ml/min， internal standard for nitrazepam， the detection wavelength was 254nm column greenhouse temperature. Results AI division of Estazolam and alprazolam blood concentration was linear in the range of 0.25-3.0 u g / ml. Among them， the minimum detectable concentration respectively was 12.5 g / L and 12.5 g / L respectively. Day and day precision， recovery rate is higher， respectively， 100.49%， 95.08%. Conclusion This method is simple， the result is reliable and can be used in clinical serum sedative drugs alprazolam， Estazolam concentration determination.
Keywords： Serum； sedative drugs； alprazolam； Estazolam； RP-HPLC； rapid detection
作為临床上常见的镇静类药物，阿普唑仑和艾司唑仑均属于BAD类药物，具有抗焦虑、镇静、催眠、松弛骨骼肌等作用。有关这两种药物血清浓度检测，多数报道均采用的是外标峰面积进行定量，因而对于实验条件具有较高的要求，且难以进行有效控制。再加上这两种药物容易引发依赖性、成瘾性等不良反应，因而，加强血清中此类药物含量的快速检测具有十分重要的意义。本文采用RP-HPLC法对人体血清中阿普唑仑、艾司唑仑药物浓度进行快速检测，旨在为临床血药检测提供快速、可靠的定性定量方法。
1资料与方法
1.1仪器
LC-1500型号高效液相色谱仪，CHROM TECH色谱工作站，TGL-16B离心机（上海安亭科学仪器厂），XW-80A漩涡混合器（上海医科大学仪器厂），BS210S电子天平（Sartorius）。
1.2试药
阿普唑仑、艾司唑仑、硝西泮（中国生物药品技术检定所），甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，乙醚、乙醇为分析纯（长沙试剂厂）。
1.3方法
标准溶液、内标的配置。准确称取对照品硝西泮适量，采用无水乙醇进行配制，配制为0.1mg/mL的标准混合液与内标液。置于冰箱中保存，使用前进行相应的稀释。
色谱条件。分析柱采用的是Techsphere-ODS（250mm×4.6mmID，5μm），保护柱ODS（10mm×4.6mmID，5μm），流动相为甲醇：水（65：35），流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，柱温室温，AUFS为0.08。
血清样品的处理。取0.25mL的人体血清样品置于10μg/mL的内标液50μL内混匀，采用50μL的NaOH（0.1mol/L）进行碱化，加入2mL的乙醚，采用漩涡混合器提取2min后，采用3000rpm的转速进行离心，离心10min，将所得上清液吸入另一无菌试管中，于60℃水浴下蒸干，残留物采用100μL流动相进行振荡溶解，进样20μL。
2结果
2.1色谱图
取空白血清与含药血清，提取后采用色谱柱进行分离，结果如图1所示：
2.2标准曲线制备
采取0.25mL血清加入标准液中，使血清中药物浓度分别为0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、3.00μg/mL，依据上文方法操作，制备标准曲线，其中，浓度C为横坐标，药物峰高值与内标峰高值之比Y为纵坐标。
阿普唑仑标准曲线：Y=0.1266C-0.00415，（R=0.9989，n=5）
艾司唑仑标准曲线：Y=0.2199C-0.00825，（R=0.9979，n=5）
结果显示：艾司唑仑、阿普唑仑血清药物浓度在0.25-3.0μg/mL之间，同峰高比具有较好的线性关系。
2.3回收率实验 結合方法操作分别配制0.25、1.0、3.0μg/mL的样品各5份进行测定，将峰高比代入方程中，对两种药物回收率进行计算，所得结果：艾司唑仑、阿普唑仑回收率分别为100.49%、95.08%。
2.4精密度实验
分别取高、中、低浓度质控样品，结合样本方法进行3次平行操作，所获得日内、日间精密度结果如下：艾司唑仑高、中、低日内精密度为4.48、2.90、5.31，日间精密度分别为6.87、2.35、6.64；阿普唑仑高、中、低日内精密度为4.76、4.75、4.94，日间精密度分别为6.52、4.75、4.42，均不超过7%。
2.5最小检测浓度
最低检测限为待测物峰高为3倍基线噪音时的浓度，本法最小检测浓度艾司唑仑、阿普唑仑均为12.5ng/mL。
2.6稳定性实验
取艾司唑仑、阿普唑仑中、高、低三种浓度九个样品置于冰箱中保存，分别于1、2、3天取出，于37.5℃水浴中融化，依据样品方法进行测定，结果RSD均不超过10%。
2.7临床应用
采用本法对我院两位脑梗患者进行测定，结果显示，男性患者血清中艾司唑仑浓度0.34μg/mL，女性患者血清阿普唑仑浓度0.4μg/mL。两患者均未表现出显著的中毒症状。
3讨论
本文采用甲醇：水（65：35）作为流动相，避免缓冲液对色谱柱所带来的损伤，且所检测药物分离效果良好。相同条件下，萃取溶剂二氯甲烷、氯仿、乙醚中，乙醚萃取药物具有较高的色谱峰，且杂质较少，操作过程简单方便。本文采用的是内标定量法，因而所得结果准确、快速，即可用于血药中毒定性与定量，也可用于常规血药浓度测试，具有较好的临床推广和应用价值。
参考文献：
[1] Lambert WE， Meyer E， Xue Ping Y， et al. Screening，indenti-fication，and quantitation of benzodiazepines in postmortemsamples by HPLC with photodiode array detection.J AnalToxicol. 2005， 19（1）： 35.
[2] Guan F， Seno H， Ishii A， et al. Solid-phase microextractionand GC-ECD of benzophenones for benzodiazepines in urine[J]. J Anal Toxicol， 2009， 23（01）： 54-57.
关键词：血清；镇静药物；阿普唑仑；艾司唑仑；RP-HPLC；快速检验
Abstract： Objective To construct simultaneous rapid detection of serum sedative drugs Alprazolam and Estazolam in RP-HPLC method. Methods the Techsphere-ODS chromatographic column as the analytical column， methanol： water （65：35） as mobile phase， flow rate of 1.0ml/min， internal standard for nitrazepam， the detection wavelength was 254nm column greenhouse temperature. Results AI division of Estazolam and alprazolam blood concentration was linear in the range of 0.25-3.0 u g / ml. Among them， the minimum detectable concentration respectively was 12.5 g / L and 12.5 g / L respectively. Day and day precision， recovery rate is higher， respectively， 100.49%， 95.08%. Conclusion This method is simple， the result is reliable and can be used in clinical serum sedative drugs alprazolam， Estazolam concentration determination.
Keywords： Serum； sedative drugs； alprazolam； Estazolam； RP-HPLC； rapid detection
作為临床上常见的镇静类药物，阿普唑仑和艾司唑仑均属于BAD类药物，具有抗焦虑、镇静、催眠、松弛骨骼肌等作用。有关这两种药物血清浓度检测，多数报道均采用的是外标峰面积进行定量，因而对于实验条件具有较高的要求，且难以进行有效控制。再加上这两种药物容易引发依赖性、成瘾性等不良反应，因而，加强血清中此类药物含量的快速检测具有十分重要的意义。本文采用RP-HPLC法对人体血清中阿普唑仑、艾司唑仑药物浓度进行快速检测，旨在为临床血药检测提供快速、可靠的定性定量方法。
1资料与方法
1.1仪器
LC-1500型号高效液相色谱仪，CHROM TECH色谱工作站，TGL-16B离心机（上海安亭科学仪器厂），XW-80A漩涡混合器（上海医科大学仪器厂），BS210S电子天平（Sartorius）。
1.2试药
阿普唑仑、艾司唑仑、硝西泮（中国生物药品技术检定所），甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，乙醚、乙醇为分析纯（长沙试剂厂）。
1.3方法
标准溶液、内标的配置。准确称取对照品硝西泮适量，采用无水乙醇进行配制，配制为0.1mg/mL的标准混合液与内标液。置于冰箱中保存，使用前进行相应的稀释。
色谱条件。分析柱采用的是Techsphere-ODS（250mm×4.6mmID，5μm），保护柱ODS（10mm×4.6mmID，5μm），流动相为甲醇：水（65：35），流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，柱温室温，AUFS为0.08。
血清样品的处理。取0.25mL的人体血清样品置于10μg/mL的内标液50μL内混匀，采用50μL的NaOH（0.1mol/L）进行碱化，加入2mL的乙醚，采用漩涡混合器提取2min后，采用3000rpm的转速进行离心，离心10min，将所得上清液吸入另一无菌试管中，于60℃水浴下蒸干，残留物采用100μL流动相进行振荡溶解，进样20μL。
2结果
2.1色谱图
取空白血清与含药血清，提取后采用色谱柱进行分离，结果如图1所示：
2.2标准曲线制备
采取0.25mL血清加入标准液中，使血清中药物浓度分别为0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、3.00μg/mL，依据上文方法操作，制备标准曲线，其中，浓度C为横坐标，药物峰高值与内标峰高值之比Y为纵坐标。
阿普唑仑标准曲线：Y=0.1266C-0.00415，（R=0.9989，n=5）
艾司唑仑标准曲线：Y=0.2199C-0.00825，（R=0.9979，n=5）
结果显示：艾司唑仑、阿普唑仑血清药物浓度在0.25-3.0μg/mL之间，同峰高比具有较好的线性关系。
2.3回收率实验 結合方法操作分别配制0.25、1.0、3.0μg/mL的样品各5份进行测定，将峰高比代入方程中，对两种药物回收率进行计算，所得结果：艾司唑仑、阿普唑仑回收率分别为100.49%、95.08%。
2.4精密度实验
分别取高、中、低浓度质控样品，结合样本方法进行3次平行操作，所获得日内、日间精密度结果如下：艾司唑仑高、中、低日内精密度为4.48、2.90、5.31，日间精密度分别为6.87、2.35、6.64；阿普唑仑高、中、低日内精密度为4.76、4.75、4.94，日间精密度分别为6.52、4.75、4.42，均不超过7%。
2.5最小检测浓度
最低检测限为待测物峰高为3倍基线噪音时的浓度，本法最小检测浓度艾司唑仑、阿普唑仑均为12.5ng/mL。
2.6稳定性实验
取艾司唑仑、阿普唑仑中、高、低三种浓度九个样品置于冰箱中保存，分别于1、2、3天取出，于37.5℃水浴中融化，依据样品方法进行测定，结果RSD均不超过10%。
2.7临床应用
采用本法对我院两位脑梗患者进行测定，结果显示，男性患者血清中艾司唑仑浓度0.34μg/mL，女性患者血清阿普唑仑浓度0.4μg/mL。两患者均未表现出显著的中毒症状。
3讨论
本文采用甲醇：水（65：35）作为流动相，避免缓冲液对色谱柱所带来的损伤，且所检测药物分离效果良好。相同条件下，萃取溶剂二氯甲烷、氯仿、乙醚中，乙醚萃取药物具有较高的色谱峰，且杂质较少，操作过程简单方便。本文采用的是内标定量法，因而所得结果准确、快速，即可用于血药中毒定性与定量，也可用于常规血药浓度测试，具有较好的临床推广和应用价值。
参考文献：
[1] Lambert WE， Meyer E， Xue Ping Y， et al. Screening，indenti-fication，and quantitation of benzodiazepines in postmortemsamples by HPLC with photodiode array detection.J AnalToxicol. 2005， 19（1）： 35.
[2] Guan F， Seno H， Ishii A， et al. Solid-phase microextractionand GC-ECD of benzophenones for benzodiazepines in urine[J]. J Anal Toxicol， 2009， 23（01）： 54-57.