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目的
探究棕色脂肪细胞分化过程中关键基因以及参照基因随分化进程的表达变化趋势。
方法根据随机数字表法随机选取20只4周龄雄性C57BL/6J小鼠，提取肩胛间区棕色脂肪组织。以高糖DMEM培养原代棕色前体脂肪细胞，以"鸡尾酒法"诱导培养基(含0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、5 mmol/L地塞米松、320 nmol/L胰岛素、1 nmol/L三碘甲状腺原氨酸和0.125 mmol/L吲哚美辛)诱导分化。Trizol裂解法提取分化过程中(0、2、4、6 d)棕色脂肪细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳验证总RNA质量。油红O染色，检测棕色脂肪细胞成熟情况，免疫荧光鉴定棕色脂肪细胞成熟标志物UCP1表达水平。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法比较在棕色脂肪细胞中参照基因(GAPDH、β-actin、18S和PPIA)表达水平的恒定性，并检测棕色脂肪分化关键基因(UCP1、PRDM16、PGC-1α、EBF2、PPARγ和Cidea)的表达水平。
结果1.诱导第6天可见棕色脂肪细胞内密布细小脂滴，UCP1表达水平较高。2.琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，可见3条明亮带，提示RNA质量合格。3.在小鼠棕色脂肪分化过程中PPIA的表达水平相对恒定，可作为小鼠棕色脂肪分化合适的内参。4.棕色脂肪能量代谢相关基因UCP1、PRDM16、PGC-1α、EBF2、PPARγ和Cidea随着分化天数(0、2、4、6 d)的增加表达量显著增加，差异有统计学意义(P均<0.05)。
结论原代棕色脂肪细胞分化过程中，内参基因PPIA表达恒定，是合适的内参基因。原代棕色分化关键基因UCP1、PRDM16、PGC-1α、EBF2、PPARγ和Cidea可作为合适的棕色脂肪细胞成熟标志基因。