【摘 要】
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为初步探究鸡TLR4在抗病毒感染天然免疫中发挥的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术针对鸡TLR4基因的功能域,设计、构建了CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染鸡DF1细胞;经
【机 构】
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新疆农业大学动物医学学院,新疆乌鲁木齐830000中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室,黑龙江哈尔滨150069;中国农业科学院哈尔滨兽医研究
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为初步探究鸡TLR4在抗病毒感染天然免疫中发挥的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术针对鸡TLR4基因的功能域,设计、构建了CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染鸡DF1细胞;经流式细胞仪分选、测序及western blot鉴定筛选得到TLR4-/-DF1细胞系;利用新城疫病毒(NDV)感染TLR4-/-DF1细胞系,采用绝对荧光定量PCR检测NDV拷贝数,相对荧光定量PCR检测TLR4下游接头蛋白、细胞因子及干扰素基因的转录水平.结果 显示:与野生型DF1细胞相比,NDV感染6h、16h和36 h的TLR4-/-DF1细胞中病毒基因拷贝数显著升高(p＜0.05),16 h升高了2.95倍,感染6h、16h和24 h下游接头蛋白MyD88基因转录水平下降,感染16h促炎因子IL-1β下降了48.5％(p＜0.01),IL-8下降了62.5％(p＜0.01),Ⅰ型干扰素转录水平下降.以上结果表明:NDV感染诱导的天然免疫应答可能是通过MyD88途径诱导高水平促炎性因子和Ⅰ型干扰素(IFN-α、IFN-β)的表达,从而抑制NDV的增殖,TLR4在NDV感染引起的天然免疫应答和疾病防控研究中具有重要意义.同时,本研究TLR4-/-DF1细胞系的建立可用于病毒引起的炎性因子风暴及天然免疫抗病毒作用的探究.
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