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摘 要：生物电化学连接生物技术和电化学科学，纳米技术打开了这个领域科学研究新境界。由于许多生物活性分子，例如细胞色素C的氧化还原中心通常位于生物分子内部，所以其氧化还原中心与电极之间的直接电子传递很难实现。本文首先通过在金电极上分别修饰己二硫醇和苯二硫醇的自组装单层SAMs，然后再将修饰了金纳米颗粒（AuNPs）的多壁碳纳米管（MWCNTs）固定于SAMs上，然后再修饰上细胞色素C，利用金纳米颗粒和碳纳米管良好的导电性和宏观隧道效应，实现了对细胞色素C的直接电化学。并将该修饰电极用于对H2O2的催化研究。
关键词：金纳米颗粒 碳纳米管 生物传感界面 过氧化氢
纳米材料常用于制备各种生物界面功能化的纳米结构。金纳米颗粒是稳定的金属纳米材料[1]，金纳米颗粒和生物分子的结合日益引起了人们的兴趣[2]。生物大分子可以通过静电吸附或通过生物素-抗生物素蛋白[3-5]连接附在金纳米颗粒表面，最常用的方法是通过金-硫醇键[6-8]，金-硫醇的反应牢固、有效[9-12]。
自组装体系应用广泛，如纳米结构生物界面构建[13]。虽然大多数生物分子因水溶性不能用LB方法直接沉积，但可以作为带电分子溶解在次相中[14]。正电荷的两亲分子层铺在水表面并形成LB膜，生物分子将会被纳入LB膜，获得纳米生物界面。已被报道和不同的两亲分子共沉淀来形成LB生物耦合纳米膜并用于电化学检测或生物传感[15]。此外，通过Au-S键得到的单层可以通过吸附，静电引力或共价结合来固定生物分子[16-18]。
本文利用二硫醇与金电板通Au-S共价键结合，得到己二硫醇和苯二硫醇的SAMs，将二硫醇的另一个巯基与修饰于碳纳米管上的金纳米颗粒通过Au-S共价键结合，得到纳米结构生物传感界面，用于实现对细胞色素C的直接电化学，同时修饰电极可望用于H2O2传感器研究。
一、实验
1.实验仪器及试剂
实验仪器AUTO Lab电化学工作站，采用三电极系统，工作电极为金电极，对电极为铂电极，参比电极为饱和甘汞电极；AS3120超声振荡机；85-2型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司。
2.实验试剂
无水乙醇，丙酮，柠檬酸钠，HAuCl4（质量分数1%），硫酸钠，铁氰化钾，稀硫酸，对苯二硫醇，己二硫醇，过氧化氢质量分数30%，以上试剂均为分析纯，由成都科龙化工试剂厂提供；细胞色素C，北京经科宏达生物技术有限公司。
3.实验制备
3.1CNTs酸化
称取1 g CNTs于250 ml圆底烧瓶中，加入150 ml浓硝酸在磁力搅拌下加热7小时后自然冷却至室温。离心洗涤至中性，将得到的产品在80摄氏度下烘干收集产品。
3.2 酸化的CNT上修饰金纳米颗粒
9mg酸化碳纳米管超声30min和15%的柠檬酸钠12ml加入到250ml圆底烧瓶中，加入二次水至总体积为100ml。磁力搅拌下加热至沸腾后，加入1 % HAuCl43ml至颜色不再变化，自然冷却至室温。洗涤离心，烘箱中50℃烘干得金纳米颗粒修饰的CNTs（AuNPs/CNTs）。
3.3 金电极预处理
金电极（直径为2mm）分别用1.0μm，0.3μm，0.05μm的Al2O3乳浊液打磨镜面后于丙酮溶液中超声5min，在二次水中超声5min。在稀王水中浸泡2-3min。洗涤后放入0.5M稀H2SO4溶液（已通N2）中扫描，电位区间为-0.2-1.6V，扫速为0.5V/s，扫描至稳定。
3.4 金电极上己二硫醇的SAMs的制备
将金电极放入10 mM己二硫醇和苯二硫醇溶液中，室温组装24h，组装完毕后，SAMs修饰电极依次用无水乙醇和二次水淋洗，立即进行循环伏安表征。
3.5 修饰Au-NPs/CNTs
将1 mg Au-NPs/CNTs溶解于1 mL DMF中，将20 mL 溶液滴于己二硫醇和苯二硫醇SAMs修饰的金电板上，放置过夜，待溶液蒸发完后，立即进行循环伏安法表征。在空白PBS7.0溶液中采用三电极系统测定循环伏安（CV）。
3.6 电化学吸附细胞色素C
在电解池中加入质量分数为1% 细胞色素C，采用三电极系统扫循环伏安（CV），电位区间为0.3～-0.8V，扫描速率为0.05V/S，扫描至稳定。电极扫描30分钟，使修饰电极吸附细胞色素C。
3.7 修饰金电极对过氧化氢的响应
在电解池中加入5 ml pH 7.0 PBS，采用三电极系统测定金电极循环伏安（CV）。再向电解池中加入不同量的0.1 M H2O2溶液，分别滴加0.5 μL、0.5μL、0.5μL、1.0μL、1.5μL、1.0μL、10μL、10μL的0.1 M过氧化氢溶液，采用三电极系统测定修饰电极在不同浓度过氧化氢下的循环伏安（CV）曲线。
二、结果与讨论
1.扫描隧道显微镜（STM）研究
用STM对所得金纳米颗粒修饰的CNTs进行了表征，结果如图2所示。由图可知，在CNTs上出现了较多的黑色斑块的金纳米颗粒，表明金纳米颗粒成功修饰于CNTs上。
2.金电极上己二硫醇和苯二硫醇SAMs修饰前后循环伏安表征
图3为预处理好的裸金电极在2mM K3Fe（CN）6的0.1 M Na2SO4溶液中的CV图，图中出现了一对可逆的氧化还原峰，表明电子传递反应是由扩散控制的。当金电极被二硫醇和苯二硫醇SAMs修饰后，可逆峰完全消失（图4，图5），表明己二硫醇和苯二硫醇SAMs致密有序，Fe（CN）63-离子的氧化还原反应完全被硫醇SAMs阻碍。
3.AuNPs/CNTs滴涂后硫醇修饰金电极循环伏安图表征 图6、图7所示为Au-己二硫醇-AuNPs/CNTs和Au-苯二硫醇-AuNPs/CNTs在含有2mM K3Fe（CN）6的.1 M Na2SO4溶液中的循环伏安谱图。由图可知，二者均出现了一对可逆的氧化还原峰。表明氧化还原探针与金电极表面的电子传递得到了完全的恢复，该现象是因为AuNPs/CNT的作用。当AuNPs/CNT滴涂于己二硫醇和苯二硫醇的SAMs修饰的金电极上后，电子首先快速地通过隧穿到达AuNPs/CNT，然后传递给氧化还原探针，使得K3Fe（CN）6发生氧化还原反应，即出现氧化还原峰。由图3，图6，图7可知，Au-苯二硫醇-AuNPs/CNTs氧化还原电流大于Au-己二硫醇-AuNPs/CNTs，这是苯环具有共轭效应造成的，能更快地传递电子。
4.Au-己二硫醇-AuNPs/CNTs和Au-苯二硫醇-AuNPs/CNTs吸附细胞色素C后循环伏安图图8、图9分别为Au-己二硫醇-AuNPs/CNTs和Au-苯二硫醇-AuNPs/CNTs吸附细胞色素C前后在空白PBS溶液中的循环伏安图。由图可知，两只修饰电极吸附细胞色素C后，均在-0.3V和-0.4V附近分别出现新的氧化还原峰。表明Au-己二硫醇-AuNPs/CNTs和Au-苯二硫醇-AuNPs/CNTs可实现细胞色素C的直接电化学。这是由金纳米颗粒和碳纳米管良好的导电性和宏观隧道效应所致。
5.修饰电极对H2O2的催化研究
为了考察Au-己二硫醇-AuNPs/CNTs和Au-苯二硫醇-AuNPs/CNTs吸附细胞色素C后的电催化行为，研究了它们对H2O2还原响应。图10和图11分别是Au-己二硫醇-AuNPs/CNTs和Au-苯二硫醇-AuNPs/CNTs吸附细胞色素C后对H2O2还原响应的循环伏安图。由图可知，随着H2O2浓度的增加，还原峰电流逐渐增大，氧化电流逐渐减小，显示出细胞色素C对H2O2明显的电催化特征。这个结果表明细胞色素C修饰电极对H2O2还原表现出了优良的电催化行为。因此它们可用于H2O2传感器研究。
三、结论
本文用二硫醇在金电极上利用Au-S共价键构建了一类新型的纳米结构生物传感界面，实现了对细胞色素C的直接电化学，同时该修饰电板对H2O2的还原具有明显的催化作用。
参考文献
[1]Chen， D.； Wang， G. and Li， J. H. JPCC， 2007， 111， 2351
[2]Niemeyer， C. M. Angew. Chem.， Int. Ed. 2001， 40， 4128-4158.
[3]Chow， G. M.； Markowitz， M. A.； Rayne， R.； Dunn， D. N.； Singh， A. J. Colloid Interface Sci. 1996， 183， 135-142.
[4]Gonzalez-Garcia， M. B.； Fernandez-Sanchez， C.； Costa-Garcia， A. Biosens. Bioelectron. 2000， 15， 315-321.
[5]Xiao， Y.； Patolsky， F.； Katz， E.； Hainfeld， J. F.； Willner， I. Science，2003， 299， 1877- 1881.[6]Zhuo， Y.； Yuan， R.； Chai， Y. Q.； Tang， D. P.； Zhang， Y.； Wang， N.； Li， X. L.； Zhu， Q. Electrochem. Commun. 2005， 7， 355-360.
[7]Wang， M. J.； Wang， L. Y.； Wang， G.； Ji， X. H.； Bai， Y. B.； Li， T. J.； Gong， S. Y.； Li， J. eH. Biosns. Bioelectron. 2004， 19， 575-582.
[8]Delvaux， M.； Champagne， S. D. Biosens. Bioelectron. 2003， 18， 943-951.
[9]Delvaux， M.； Champagne， S. D.； Walcarius， A. Electroanalysis 2004， 16， 190-198.
[10]Mbindyo， J. K.； Reiss， B. D.； Martin， B. R.； Keating， C. D.； Natan， M. J.； Mallouk， T. E. AdV. Mater. 2002， 13， 249-254.
[11]Wang， J.； Rincon， O.； Polsky， R.； Dominguez， E. Electrochem. Commun. 2003， 5， 83-86.
[12]Fu， Y. Z.； Yuan， R.； Xu， L.； Chai， Y. Q.； Liu， Y.； Tang， D. P.； Zhang， Y. J. Biochem. Biophys. Methods 2005， 62， 163-174.
[13]Ji， X. H.； Xu， S. P.； Wang， L. Y.； Liu， M.； Pan， K.； Yuan， H.； Ma， L.； Xu， W. Q.； Li， J. H.； Bai， Y. B.； Li， T. J. Colloid Surf. A-Physicochem.Eng. Asp. 2005， 257- 258， 171- 175 .
[14]Cai， H.； Zhu， N. N.； Jiang， Y.； He， P. G.； Fang， Y. Z. Biosens. Bioelectron. 2003， 18， 1311-1319.
[15]Wang， S. Q.； Lu， L. P.； Lin， X. Q. Electroanalysis 2004， 16， 1734-1738.
[16]Liu， M. C.； Shi， G. Y.； Zhang， L.； Cheng， Y. X.； Jin， L. T.Electrochem. Commun. 2006， 8， 305-310.
[17]Azamian， B. R.； Davis， J. J.； Coleman， K. S.； Bagshaw， C. B.； Green， M. L. H. J. Am. Chem. Soc. 2002， 124， 12664-12665.
[18]Gavalas， V. G.； Chaniotakis， N. A. Anal. Chim. Acta ，2000， 409，131-135.
关键词：金纳米颗粒 碳纳米管 生物传感界面 过氧化氢
纳米材料常用于制备各种生物界面功能化的纳米结构。金纳米颗粒是稳定的金属纳米材料[1]，金纳米颗粒和生物分子的结合日益引起了人们的兴趣[2]。生物大分子可以通过静电吸附或通过生物素-抗生物素蛋白[3-5]连接附在金纳米颗粒表面，最常用的方法是通过金-硫醇键[6-8]，金-硫醇的反应牢固、有效[9-12]。
自组装体系应用广泛，如纳米结构生物界面构建[13]。虽然大多数生物分子因水溶性不能用LB方法直接沉积，但可以作为带电分子溶解在次相中[14]。正电荷的两亲分子层铺在水表面并形成LB膜，生物分子将会被纳入LB膜，获得纳米生物界面。已被报道和不同的两亲分子共沉淀来形成LB生物耦合纳米膜并用于电化学检测或生物传感[15]。此外，通过Au-S键得到的单层可以通过吸附，静电引力或共价结合来固定生物分子[16-18]。
本文利用二硫醇与金电板通Au-S共价键结合，得到己二硫醇和苯二硫醇的SAMs，将二硫醇的另一个巯基与修饰于碳纳米管上的金纳米颗粒通过Au-S共价键结合，得到纳米结构生物传感界面，用于实现对细胞色素C的直接电化学，同时修饰电极可望用于H2O2传感器研究。
一、实验
1.实验仪器及试剂
实验仪器AUTO Lab电化学工作站，采用三电极系统，工作电极为金电极，对电极为铂电极，参比电极为饱和甘汞电极；AS3120超声振荡机；85-2型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司。
2.实验试剂
无水乙醇，丙酮，柠檬酸钠，HAuCl4（质量分数1%），硫酸钠，铁氰化钾，稀硫酸，对苯二硫醇，己二硫醇，过氧化氢质量分数30%，以上试剂均为分析纯，由成都科龙化工试剂厂提供；细胞色素C，北京经科宏达生物技术有限公司。
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3.1CNTs酸化
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3.2 酸化的CNT上修饰金纳米颗粒
9mg酸化碳纳米管超声30min和15%的柠檬酸钠12ml加入到250ml圆底烧瓶中，加入二次水至总体积为100ml。磁力搅拌下加热至沸腾后，加入1 % HAuCl43ml至颜色不再变化，自然冷却至室温。洗涤离心，烘箱中50℃烘干得金纳米颗粒修饰的CNTs（AuNPs/CNTs）。
3.3 金电极预处理
金电极（直径为2mm）分别用1.0μm，0.3μm，0.05μm的Al2O3乳浊液打磨镜面后于丙酮溶液中超声5min，在二次水中超声5min。在稀王水中浸泡2-3min。洗涤后放入0.5M稀H2SO4溶液（已通N2）中扫描，电位区间为-0.2-1.6V，扫速为0.5V/s，扫描至稳定。
3.4 金电极上己二硫醇的SAMs的制备
将金电极放入10 mM己二硫醇和苯二硫醇溶液中，室温组装24h，组装完毕后，SAMs修饰电极依次用无水乙醇和二次水淋洗，立即进行循环伏安表征。
3.5 修饰Au-NPs/CNTs
将1 mg Au-NPs/CNTs溶解于1 mL DMF中，将20 mL 溶液滴于己二硫醇和苯二硫醇SAMs修饰的金电板上，放置过夜，待溶液蒸发完后，立即进行循环伏安法表征。在空白PBS7.0溶液中采用三电极系统测定循环伏安（CV）。
3.6 电化学吸附细胞色素C
在电解池中加入质量分数为1% 细胞色素C，采用三电极系统扫循环伏安（CV），电位区间为0.3～-0.8V，扫描速率为0.05V/S，扫描至稳定。电极扫描30分钟，使修饰电极吸附细胞色素C。
3.7 修饰金电极对过氧化氢的响应
在电解池中加入5 ml pH 7.0 PBS，采用三电极系统测定金电极循环伏安（CV）。再向电解池中加入不同量的0.1 M H2O2溶液，分别滴加0.5 μL、0.5μL、0.5μL、1.0μL、1.5μL、1.0μL、10μL、10μL的0.1 M过氧化氢溶液，采用三电极系统测定修饰电极在不同浓度过氧化氢下的循环伏安（CV）曲线。
二、结果与讨论
1.扫描隧道显微镜（STM）研究
用STM对所得金纳米颗粒修饰的CNTs进行了表征，结果如图2所示。由图可知，在CNTs上出现了较多的黑色斑块的金纳米颗粒，表明金纳米颗粒成功修饰于CNTs上。
2.金电极上己二硫醇和苯二硫醇SAMs修饰前后循环伏安表征
图3为预处理好的裸金电极在2mM K3Fe（CN）6的0.1 M Na2SO4溶液中的CV图，图中出现了一对可逆的氧化还原峰，表明电子传递反应是由扩散控制的。当金电极被二硫醇和苯二硫醇SAMs修饰后，可逆峰完全消失（图4，图5），表明己二硫醇和苯二硫醇SAMs致密有序，Fe（CN）63-离子的氧化还原反应完全被硫醇SAMs阻碍。
3.AuNPs/CNTs滴涂后硫醇修饰金电极循环伏安图表征 图6、图7所示为Au-己二硫醇-AuNPs/CNTs和Au-苯二硫醇-AuNPs/CNTs在含有2mM K3Fe（CN）6的.1 M Na2SO4溶液中的循环伏安谱图。由图可知，二者均出现了一对可逆的氧化还原峰。表明氧化还原探针与金电极表面的电子传递得到了完全的恢复，该现象是因为AuNPs/CNT的作用。当AuNPs/CNT滴涂于己二硫醇和苯二硫醇的SAMs修饰的金电极上后，电子首先快速地通过隧穿到达AuNPs/CNT，然后传递给氧化还原探针，使得K3Fe（CN）6发生氧化还原反应，即出现氧化还原峰。由图3，图6，图7可知，Au-苯二硫醇-AuNPs/CNTs氧化还原电流大于Au-己二硫醇-AuNPs/CNTs，这是苯环具有共轭效应造成的，能更快地传递电子。
4.Au-己二硫醇-AuNPs/CNTs和Au-苯二硫醇-AuNPs/CNTs吸附细胞色素C后循环伏安图图8、图9分别为Au-己二硫醇-AuNPs/CNTs和Au-苯二硫醇-AuNPs/CNTs吸附细胞色素C前后在空白PBS溶液中的循环伏安图。由图可知，两只修饰电极吸附细胞色素C后，均在-0.3V和-0.4V附近分别出现新的氧化还原峰。表明Au-己二硫醇-AuNPs/CNTs和Au-苯二硫醇-AuNPs/CNTs可实现细胞色素C的直接电化学。这是由金纳米颗粒和碳纳米管良好的导电性和宏观隧道效应所致。
5.修饰电极对H2O2的催化研究
为了考察Au-己二硫醇-AuNPs/CNTs和Au-苯二硫醇-AuNPs/CNTs吸附细胞色素C后的电催化行为，研究了它们对H2O2还原响应。图10和图11分别是Au-己二硫醇-AuNPs/CNTs和Au-苯二硫醇-AuNPs/CNTs吸附细胞色素C后对H2O2还原响应的循环伏安图。由图可知，随着H2O2浓度的增加，还原峰电流逐渐增大，氧化电流逐渐减小，显示出细胞色素C对H2O2明显的电催化特征。这个结果表明细胞色素C修饰电极对H2O2还原表现出了优良的电催化行为。因此它们可用于H2O2传感器研究。
三、结论
本文用二硫醇在金电极上利用Au-S共价键构建了一类新型的纳米结构生物传感界面，实现了对细胞色素C的直接电化学，同时该修饰电板对H2O2的还原具有明显的催化作用。
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