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摘要：以荒漠野生白刺作为试验材料，研究不同消毒方式对白刺茎段无菌外植体建立的影响及不同激素、不同浓度组合对野生白刺试管苗增殖和生根的影响。结果表明：选取室内种子萌发的实生苗茎段为外植体，用10% NaClO 消毒15～18 min可以获得理想的成活率；适宜的增殖培养基是MS 0.2 mg/L 6-BA 0.5 mg/L IBA或MS 0.5 mg/L IBA；比较适宜的生根培养基是1/2 MS 0.5 mg/L IBA。不添加激素的简化培养基MS0对白刺也有较为理想的增殖和生根效果。
关键词：甘肃；荒漠地区；野生白刺；增殖；生根；组织培养
中图分类号： S580.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0080-03
收稿日期：2014-09-12
基金项目：国家农村领域科技计划 （编号：2012BAD16B0303）。
作者简介：张艳萍（1978—），女，甘肃武威人，助理研究员，主要从事分子生物学、病毒检测以及中药材组培研究。E-mail：[email protected]。
通信作者：董治宝。E-mail：[email protected]。当前，全球盐碱地面积已达9.5亿hm2 [1]，其中我国盐碱土地资源约为0.99亿 hm2，其中现代盐碱土面积为0.37亿hm2，残余盐碱土约0.45亿hm2，并且尚存在有约0.173亿hm2的潜在盐碱土[2]。大面积盐碱地、荒漠地的开发利用对环境的改善具有重要的现实意义。白刺（Nitraria L.），灌木，蒺藜科，全世界有12个种，我国有 8个种，甘肃有5种 [3]，其根系发达，具有很强的防风固沙、抗旱、抗盐碱、耐热、耐土壤瘠薄和耐沙埋能力，可明显改良土壤物理性状，提高土壤肥力[4]。此外，白刺根寄生的锁阳（Cynomorium songaricum Rupr）为传统名贵的温补药材[5]，白刺果含多种营养成分和丰富的微量元素，具有极高的营养和药用价值[6]。近年来，从野生植物资源中寻找新的、潜在的药食同源植物，已成为国内外学者研究的热点，而沙生植物白刺则是经过长期的自然筛选而保留下来的优胜者之一，白刺因其顽强的生命力和优良的遗传基因而受到沙区人们的喜爱[7]。然而据调查，白刺种间杂交混乱，分化严重[8]，同时随着自然环境的严重恶化和人为的大幅度破坏，白刺出现了不同程度的退化，大面积死亡或生长不良，结实率下降或不结实，使得这一特殊野生资源的种群繁衍面临着严重的威胁[9]。因此，为可持续利用这一野生资源，保持其优良性状的稳定性，采用离体繁育技术就成为重要途径之一。
目前，较多学者对白刺进行过多方面的研究[10-14]，其中关于白刺组培再生方面的研究已有不少[15-18]，发现不同品种的白刺分化增殖所需的激素种类差异很大。西伯利亚白刺和唐古特白刺需要6-BA和IBA的浓度与配比存在很大差异[16，19]，添加一定量的IAA和GA更有利于天津野生白刺的增殖。可见，不同区域品种的基因型不同，所需激素不同，这是组培研究工作中普遍存在的问题[20-21]。本试验以甘肃荒漠野生白刺为材料，对其组培快繁进行研究，以期建立一套甘肃地区野生白刺较为简易的组培方法，为白刺的离体繁育提供参考。
1材料与方法
1.1试验材料
试验材料为荒漠野生白刺，采自甘肃省酒泉市巴丹吉林沙漠边缘，地理坐标为39°44′N、98°31′E，海拔1 000～1 500 m。于2012年7月和2013年4月先后2次采样，第1次于2012年7月下旬采摘的带果实枝条，冰盒内带回实验室，剪取顶端幼嫩枝条备用，同时采摘果实收集种子备用；第2次于2013年4月下旬，剪取当年旺盛新枝，冰盒内带回实验室备用。2次采样均为同株野生白刺枝条。
实生苗获得：2013年2月，将收集的野生白刺种子种于温室花盆内，即可获得实生苗。
1.2试验方法
1.2.1取材和消毒处理取7月和4月野外白刺单株茎段，流动自来水冲洗30 min，放于超净工作台，用75%乙醇消毒30 s，0.1%氯化汞处理4、6、8、10 min；取4月野外采集的茎段和种子发芽得到实生苗的茎段，流动自来水冲洗30 min，放于超净工作台，用75%乙醇消毒30 s，10%次氯酸钠处理7、10、12、15、18 min。消毒剂处理完之后，用无菌水冲洗4～5次，接于MS培养基上，在温度（25±2） ℃、光照强度2 000 lx、光照周期16 h/d下培养1周，统计消毒率和无菌苗成活率。
1.2.2增殖培养基筛选取启动培养获得的无菌苗茎段，接种于添加不同激素浓度配比的MS培养基中，激素浓度水平和组合见表1。以简化MS培养基为对照，简化培养基以自来水配置，市售白糖代替蔗糖，简写为MS0。60 d后调查增殖系数。
1.2.3生根诱导将切取的单芽茎段，接种于添加不同浓度IBA和IAA的1/2MS培养基中，进行生根诱导，浓度水平和组合见表2，以简化培养基MS0作对照。记录生根时间，40 d
1.3数据处理
数据用Excel 2003进行整理，用DPS 7.0进行数据分析。
2结果与分析
2.1不同取材与消毒方法对启动培养的影响
7月和4月在荒漠取的枝条，采用第1种消毒方案，随着消毒时间的增加消毒率呈逐渐上升趋势，成活率呈先微升后降趋势（表3）。2个时期采摘的枝条活性均较弱（表3），消毒时间在8～10 min时，外植体基本褐化死亡，消毒时间在4～6 min 时，消毒不彻底，外植体污染严重。0.1%氯化汞处理10 min时，消毒率最高，7月下旬和4月上旬采取的枝条，消毒率分别高达91.67%和96.67%，可相对应的成活率却都为0；消毒6 min时，2个时期的枝条成活率达到了各自的最高值，分别仅为5%和8.33%，相对应的消毒率分别为1833%和21.67%。 4月采摘的荒漠枝条和种子发芽所得的实生苗采用10%次氯酸钠进行消毒，随着消毒时间的增加，消毒率和成活率都呈逐渐上升趋势（表3）。种子发芽实生苗茎段灭菌效果和成活率远高于野外茎段，消毒18 min种子萌芽实生苗茎段的消毒率和成活率最高，分别达到96.67%和76.67%，而4月野外茎段虽然也达到最高，但仅有8.33%的消毒率和5%的成活率。从试管苗生长状态看，种子萌发实生苗选取茎段灭菌获得的试管苗比荒漠枝条萌动快，生长的状态健康。表3不同取材与消毒方案的结果
消毒剂消毒时间
（min）消毒率（%）成活率（%）外植体状态7月4月实生苗 7月 4月 实生苗 7月枝条4月枝条实生苗0.1%HgCl240.001.670.001.67有生长迹象有生长迹象，缓慢有生长迹象，缓慢618.3321.675.008.33慢慢黄化，不生长慢慢黄化，不生长853.3353.333.331.67部分逐渐褐化、死亡部分逐渐褐化、死亡1091.6796.670.000.00快速褐化、死亡快速褐化、死亡10%NaClO70.000.000.000.00消毒不彻底消毒不彻底100.0020.000.0010消毒不彻底带有茎尖的拔节长高120.0050.000.0033.33消毒不彻底带有茎尖的拔节长高156.6788.333.3370.00保持绿色，腋芽萌动带有茎尖的拔节长高188.3396.675.0076.67保持绿色，腋芽萌动带有茎尖的拔节长高
2.2不同激素配比对白刺增殖的影响
从表4可以看出，6号培养基（MS 6-BA 0.2 mg/L IBA 0.5 mg/L）增殖系数最高，达4.08；其次是MS IBA 0.5 mg/L的11号培养基，增殖系数达3.94，二者差异不显著；简化培养基MS0的增殖系数达2.36，显著低于6号和11号培养基，却显著高于其他激素组合。其余激素组合的增殖系数在105～1.45之间，增殖率均较低。从试管苗生长状态看，6号、11号和12号这3种培养基中茎段芽苗的增殖生长状态是健康的。
2.3不同激素对白刺生根的影响
不同激素对白刺苗的生根效果见表5。加入激素0.25、0.5 mg/L IBA的1号、2号培养基生根率相对较高，分别达到9167%和96.67%，二者差异不显著，但显著高于加入0.25、0.5 mg/L IAA的3号、4号培养基和简化培养基对白刺茎段的生根率。生根时间来看，加入0.5 mg/L IBA的2号培养基生根仅需10～12 d，1号、3号、4号培养基多在18～25 d生根。从生根数来看，茎段在加有激素的培养基上基本都是基部微膨大处长出1条粗根，只有在简化培养基MS0中培养的茎段是从基部直接长出2～3条又细又长的根。
表4不同激素对白刺增殖的影响
培养基增殖系数增殖状态11.45c偶丛生，生长慢，叶绿21.20efg偶丛生，生长慢，叶微黄31.05g少丛生，叶小，发黄41.26def偶丛生，叶小，发黄51.42cd偶丛生，有生长，叶绿64.08a丛生，拔节生长快，茎壮，叶绿71.33cde偶丛生，生长慢，叶黄白81.07g少丛生，生长慢，叶黄白91.16fg偶丛生，生长慢，叶黄白101.19efg偶丛生，生长慢，叶黄白113.94a生根，拔节生长快，茎壮，叶绿122.36b生根，拔节生长，茎细，叶绿注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。
3结论与讨论
无菌外植体的获得是组织培养的关键一步，其生长状态直接影响到后续工作的开展。由于试验中采用的枝条来源于表5不同激素对白刺生根影响的结果
培养基生根时间
荒漠自然环境中，其表面和内生菌多而复杂，使得无菌外植体的获得比较困难。本试验结果表明，0.1% HgCl2作为消毒剂，对复杂的菌群有很好的抑制作用，但同时也对外植体自身极易造成伤害，使得外植体褐化死亡，所以不是白刺野外茎段灭菌理想的消毒剂。10% NaClO作为消毒剂，因其性质温和，对处理的外植体没有致死现象；也正是这个原因，其对于外界环境采摘的外植体灭菌效果不理想，但对于室内种子萌发获得的幼嫩实生苗茎段，灭菌处理15 min以上，就能达到理想效果，外界采摘的枝条比新生实生苗茎段木质化程度高，萌芽所需时间也长，生长相对较弱。因此本试验以种子室内发芽所得实生苗茎段为外植体，采用10% NaClO消毒15～18 min灭菌效率最佳。
从增殖诱导的结果看，在加有激素0.2 mg/L 6-BA 05 mg/L IBA和0.5 mg/L IBA的培养基增殖效果较好，简化MS0培养基也有较好的增殖效果。这一结论与何正伦等结果[19，22]不同，可能与所采用的外植体来源不同有关，虽然都是茎段，但是取自于室内种子萌发实生苗的茎段较外界生长的枝条茎段幼嫩，分生能力强，在MS0培养基上能够直接生根，再以拔节长高的方式生长，成为一种可取的简化增殖方式。而且由于简化MS0培养基采取的是自来水代替蒸馏水配制的培养基，市售白糖代替试验用蔗糖等措施，使得成本降低，同时培养基配制的操作上也有所简化，这对规模化生产具有十分积极的意义。
从生根诱导的处理结果看，在1/2MS 0.5 mg/L IBA培养基中生根效果最好，不但生根快，而且根粗壮，这与孙雪新等的结果[13]相同。在本试验中，简化MS0培养基中也能够直接生根，只是带顶芽的茎段生根更容易。
本试验认为比较适宜的消毒方案是10% NaClO对室内种子萌发获得的实生苗茎段消毒15～18 min；比较适宜的增殖培养基是MS 0.2 mg/L 6-BA 0.5 mg/L IBA或MS 05 mg/L IBA；比较适宜的生根培养基是1/2MS 0.5 mg/L IBA。
在本试验中，白刺的茎段在简易培养基MS0中也能健康增殖生长，这使得组培中不同品种所需激素种类不同的这一局限性有所缓和，这也为今后对不同品种的白刺进行初步再生体系的建立提供参考。 参考文献：
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关键词：甘肃；荒漠地区；野生白刺；增殖；生根；组织培养
中图分类号： S580.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0080-03
收稿日期：2014-09-12
基金项目：国家农村领域科技计划 （编号：2012BAD16B0303）。
作者简介：张艳萍（1978—），女，甘肃武威人，助理研究员，主要从事分子生物学、病毒检测以及中药材组培研究。E-mail：[email protected]。
通信作者：董治宝。E-mail：[email protected]。当前，全球盐碱地面积已达9.5亿hm2 [1]，其中我国盐碱土地资源约为0.99亿 hm2，其中现代盐碱土面积为0.37亿hm2，残余盐碱土约0.45亿hm2，并且尚存在有约0.173亿hm2的潜在盐碱土[2]。大面积盐碱地、荒漠地的开发利用对环境的改善具有重要的现实意义。白刺（Nitraria L.），灌木，蒺藜科，全世界有12个种，我国有 8个种，甘肃有5种 [3]，其根系发达，具有很强的防风固沙、抗旱、抗盐碱、耐热、耐土壤瘠薄和耐沙埋能力，可明显改良土壤物理性状，提高土壤肥力[4]。此外，白刺根寄生的锁阳（Cynomorium songaricum Rupr）为传统名贵的温补药材[5]，白刺果含多种营养成分和丰富的微量元素，具有极高的营养和药用价值[6]。近年来，从野生植物资源中寻找新的、潜在的药食同源植物，已成为国内外学者研究的热点，而沙生植物白刺则是经过长期的自然筛选而保留下来的优胜者之一，白刺因其顽强的生命力和优良的遗传基因而受到沙区人们的喜爱[7]。然而据调查，白刺种间杂交混乱，分化严重[8]，同时随着自然环境的严重恶化和人为的大幅度破坏，白刺出现了不同程度的退化，大面积死亡或生长不良，结实率下降或不结实，使得这一特殊野生资源的种群繁衍面临着严重的威胁[9]。因此，为可持续利用这一野生资源，保持其优良性状的稳定性，采用离体繁育技术就成为重要途径之一。
目前，较多学者对白刺进行过多方面的研究[10-14]，其中关于白刺组培再生方面的研究已有不少[15-18]，发现不同品种的白刺分化增殖所需的激素种类差异很大。西伯利亚白刺和唐古特白刺需要6-BA和IBA的浓度与配比存在很大差异[16，19]，添加一定量的IAA和GA更有利于天津野生白刺的增殖。可见，不同区域品种的基因型不同，所需激素不同，这是组培研究工作中普遍存在的问题[20-21]。本试验以甘肃荒漠野生白刺为材料，对其组培快繁进行研究，以期建立一套甘肃地区野生白刺较为简易的组培方法，为白刺的离体繁育提供参考。
1材料与方法
1.1试验材料
试验材料为荒漠野生白刺，采自甘肃省酒泉市巴丹吉林沙漠边缘，地理坐标为39°44′N、98°31′E，海拔1 000～1 500 m。于2012年7月和2013年4月先后2次采样，第1次于2012年7月下旬采摘的带果实枝条，冰盒内带回实验室，剪取顶端幼嫩枝条备用，同时采摘果实收集种子备用；第2次于2013年4月下旬，剪取当年旺盛新枝，冰盒内带回实验室备用。2次采样均为同株野生白刺枝条。
实生苗获得：2013年2月，将收集的野生白刺种子种于温室花盆内，即可获得实生苗。
1.2试验方法
1.2.1取材和消毒处理取7月和4月野外白刺单株茎段，流动自来水冲洗30 min，放于超净工作台，用75%乙醇消毒30 s，0.1%氯化汞处理4、6、8、10 min；取4月野外采集的茎段和种子发芽得到实生苗的茎段，流动自来水冲洗30 min，放于超净工作台，用75%乙醇消毒30 s，10%次氯酸钠处理7、10、12、15、18 min。消毒剂处理完之后，用无菌水冲洗4～5次，接于MS培养基上，在温度（25±2） ℃、光照强度2 000 lx、光照周期16 h/d下培养1周，统计消毒率和无菌苗成活率。
1.2.2增殖培养基筛选取启动培养获得的无菌苗茎段，接种于添加不同激素浓度配比的MS培养基中，激素浓度水平和组合见表1。以简化MS培养基为对照，简化培养基以自来水配置，市售白糖代替蔗糖，简写为MS0。60 d后调查增殖系数。
1.2.3生根诱导将切取的单芽茎段，接种于添加不同浓度IBA和IAA的1/2MS培养基中，进行生根诱导，浓度水平和组合见表2，以简化培养基MS0作对照。记录生根时间，40 d
1.3数据处理
数据用Excel 2003进行整理，用DPS 7.0进行数据分析。
2结果与分析
2.1不同取材与消毒方法对启动培养的影响
7月和4月在荒漠取的枝条，采用第1种消毒方案，随着消毒时间的增加消毒率呈逐渐上升趋势，成活率呈先微升后降趋势（表3）。2个时期采摘的枝条活性均较弱（表3），消毒时间在8～10 min时，外植体基本褐化死亡，消毒时间在4～6 min 时，消毒不彻底，外植体污染严重。0.1%氯化汞处理10 min时，消毒率最高，7月下旬和4月上旬采取的枝条，消毒率分别高达91.67%和96.67%，可相对应的成活率却都为0；消毒6 min时，2个时期的枝条成活率达到了各自的最高值，分别仅为5%和8.33%，相对应的消毒率分别为1833%和21.67%。 4月采摘的荒漠枝条和种子发芽所得的实生苗采用10%次氯酸钠进行消毒，随着消毒时间的增加，消毒率和成活率都呈逐渐上升趋势（表3）。种子发芽实生苗茎段灭菌效果和成活率远高于野外茎段，消毒18 min种子萌芽实生苗茎段的消毒率和成活率最高，分别达到96.67%和76.67%，而4月野外茎段虽然也达到最高，但仅有8.33%的消毒率和5%的成活率。从试管苗生长状态看，种子萌发实生苗选取茎段灭菌获得的试管苗比荒漠枝条萌动快，生长的状态健康。表3不同取材与消毒方案的结果
消毒剂消毒时间
（min）消毒率（%）成活率（%）外植体状态7月4月实生苗 7月 4月 实生苗 7月枝条4月枝条实生苗0.1%HgCl240.001.670.001.67有生长迹象有生长迹象，缓慢有生长迹象，缓慢618.3321.675.008.33慢慢黄化，不生长慢慢黄化，不生长853.3353.333.331.67部分逐渐褐化、死亡部分逐渐褐化、死亡1091.6796.670.000.00快速褐化、死亡快速褐化、死亡10%NaClO70.000.000.000.00消毒不彻底消毒不彻底100.0020.000.0010消毒不彻底带有茎尖的拔节长高120.0050.000.0033.33消毒不彻底带有茎尖的拔节长高156.6788.333.3370.00保持绿色，腋芽萌动带有茎尖的拔节长高188.3396.675.0076.67保持绿色，腋芽萌动带有茎尖的拔节长高
2.2不同激素配比对白刺增殖的影响
从表4可以看出，6号培养基（MS 6-BA 0.2 mg/L IBA 0.5 mg/L）增殖系数最高，达4.08；其次是MS IBA 0.5 mg/L的11号培养基，增殖系数达3.94，二者差异不显著；简化培养基MS0的增殖系数达2.36，显著低于6号和11号培养基，却显著高于其他激素组合。其余激素组合的增殖系数在105～1.45之间，增殖率均较低。从试管苗生长状态看，6号、11号和12号这3种培养基中茎段芽苗的增殖生长状态是健康的。
2.3不同激素对白刺生根的影响
不同激素对白刺苗的生根效果见表5。加入激素0.25、0.5 mg/L IBA的1号、2号培养基生根率相对较高，分别达到9167%和96.67%，二者差异不显著，但显著高于加入0.25、0.5 mg/L IAA的3号、4号培养基和简化培养基对白刺茎段的生根率。生根时间来看，加入0.5 mg/L IBA的2号培养基生根仅需10～12 d，1号、3号、4号培养基多在18～25 d生根。从生根数来看，茎段在加有激素的培养基上基本都是基部微膨大处长出1条粗根，只有在简化培养基MS0中培养的茎段是从基部直接长出2～3条又细又长的根。
表4不同激素对白刺增殖的影响
培养基增殖系数增殖状态11.45c偶丛生，生长慢，叶绿21.20efg偶丛生，生长慢，叶微黄31.05g少丛生，叶小，发黄41.26def偶丛生，叶小，发黄51.42cd偶丛生，有生长，叶绿64.08a丛生，拔节生长快，茎壮，叶绿71.33cde偶丛生，生长慢，叶黄白81.07g少丛生，生长慢，叶黄白91.16fg偶丛生，生长慢，叶黄白101.19efg偶丛生，生长慢，叶黄白113.94a生根，拔节生长快，茎壮，叶绿122.36b生根，拔节生长，茎细，叶绿注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。
3结论与讨论
无菌外植体的获得是组织培养的关键一步，其生长状态直接影响到后续工作的开展。由于试验中采用的枝条来源于表5不同激素对白刺生根影响的结果
培养基生根时间
荒漠自然环境中，其表面和内生菌多而复杂，使得无菌外植体的获得比较困难。本试验结果表明，0.1% HgCl2作为消毒剂，对复杂的菌群有很好的抑制作用，但同时也对外植体自身极易造成伤害，使得外植体褐化死亡，所以不是白刺野外茎段灭菌理想的消毒剂。10% NaClO作为消毒剂，因其性质温和，对处理的外植体没有致死现象；也正是这个原因，其对于外界环境采摘的外植体灭菌效果不理想，但对于室内种子萌发获得的幼嫩实生苗茎段，灭菌处理15 min以上，就能达到理想效果，外界采摘的枝条比新生实生苗茎段木质化程度高，萌芽所需时间也长，生长相对较弱。因此本试验以种子室内发芽所得实生苗茎段为外植体，采用10% NaClO消毒15～18 min灭菌效率最佳。
从增殖诱导的结果看，在加有激素0.2 mg/L 6-BA 05 mg/L IBA和0.5 mg/L IBA的培养基增殖效果较好，简化MS0培养基也有较好的增殖效果。这一结论与何正伦等结果[19，22]不同，可能与所采用的外植体来源不同有关，虽然都是茎段，但是取自于室内种子萌发实生苗的茎段较外界生长的枝条茎段幼嫩，分生能力强，在MS0培养基上能够直接生根，再以拔节长高的方式生长，成为一种可取的简化增殖方式。而且由于简化MS0培养基采取的是自来水代替蒸馏水配制的培养基，市售白糖代替试验用蔗糖等措施，使得成本降低，同时培养基配制的操作上也有所简化，这对规模化生产具有十分积极的意义。
从生根诱导的处理结果看，在1/2MS 0.5 mg/L IBA培养基中生根效果最好，不但生根快，而且根粗壮，这与孙雪新等的结果[13]相同。在本试验中，简化MS0培养基中也能够直接生根，只是带顶芽的茎段生根更容易。
本试验认为比较适宜的消毒方案是10% NaClO对室内种子萌发获得的实生苗茎段消毒15～18 min；比较适宜的增殖培养基是MS 0.2 mg/L 6-BA 0.5 mg/L IBA或MS 05 mg/L IBA；比较适宜的生根培养基是1/2MS 0.5 mg/L IBA。
在本试验中，白刺的茎段在简易培养基MS0中也能健康增殖生长，这使得组培中不同品种所需激素种类不同的这一局限性有所缓和，这也为今后对不同品种的白刺进行初步再生体系的建立提供参考。 参考文献：
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