【摘 要】
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目的:利用Cre/LoxP系统建立眼组织特异性Smad4基因敲除小鼠并进行初步表型分析。方法:通过PAX6启动子驱动的Cre转基因小鼠(Le-Cre)作为介导敲除的工具鼠,将其与Smad4条件基因
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目的:利用Cre/LoxP系统建立眼组织特异性Smad4基因敲除小鼠并进行初步表型分析。方法:通过PAX6启动子驱动的Cre转基因小鼠(Le-Cre)作为介导敲除的工具鼠,将其与Smad4条件基因小鼠(Smad4fl/fl)结合获得Le-Cre特异性Smad4基因敲除小鼠或变异小鼠(Le-Cre;Smad4fl/fl)。为了证实条件性基因敲除的特异性及有效性,通过PCR技术对小鼠或鼠胚进行了相关基因分析,特定组织绿色荧光蛋白(GFP)的表达及Smad4蛋白的检测,同时利用ROSA26报导基因小鼠藉LacZ染色显示Le-Cre在眼组织的表达;并对Smad4变异小鼠的表型进行了观察。结果:早在E10.0左右,鼠胚晶状体位置及眼周外胚层发现强荧光的GFP表达,表明Le-Cre明确出现在特定的靶组织。通过小鼠基因型分析,确定了小鼠或鼠胚是否携带Cre重组酶基因、Smad4条件性等位基因和/或Rosa报导基因,对小鼠晶体DNA的基因分析也证实Smad4基因在某些特异性眼组织内得到剔除。通过在Cre转基因小鼠导入报导基因,并籍LacZ染色对Cre重组酶的表达进行检测,显示了Cre重组酶的时空表达及其表达的组织特异性。Smad4免疫组化染色显示,在正常发育胚鼠眼可见广泛的Smad4表达,早期主要存在于胞浆,随着胚眼发育向核内转移;而在Smad4变异鼠胚眼,结果表明Smad4在Cre重组酶所表达的组织内缺乏表达。观察发现Smad4变异鼠可以顺利存活,但表现出眼球缩小、眼窝凹陷、眼睑畸形开放、闭合不能及眼周毛发脱失的外观。结论:通过基因和蛋白水平的检测证实了Le-Cre;Smad4基因敲除鼠的建立及Smad4在变异小鼠中表达的缺乏。Smad4在眼组织的敲除导致了眼及附属器的明显异常,为深入了解眼球发育及Smad4对其影响的机制提供了一个可信的动物模型。
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