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摘要 目的：研究紫草素通過激活活性氧（ROS）自由基诱导大肠癌细胞凋亡的作用机制。方法：通过MTT测定法检测紫草素对人结肠癌细胞系HCT116和SW480细胞活力的影响，结合Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒及流式细胞术检测细胞凋亡情况;通过Caspase 3/9活性测定试剂盒检测半胱天冬酶活性，使用ROS检测试剂盒检测紫草素处理对HCT116和SW480细胞中ROS水平的影响，并借助Western Blotting检测Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达情况。结果：细胞活力检测结果显示，人正常结肠黏膜上皮细胞系NCM460对紫草素干预不敏感，而紫草素对人结肠癌细胞系HCT116和SW480细胞活力表现出显著的抑制作用（均P<0.05）。在紫草素干预后，Western Blotting分析检测到细胞周期蛋白D、c-Myc、Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达水平显著下调（均P<0.05）。同时，紫草素以剂量依赖性方式上调了Caspase3和Caspase9蛋白表达水平（均P<0.05）。流式细胞术检测结果表明，经10 μmol/L紫草素处理24 h后，HCT116和SW480细胞凋亡率增加至59.2%和65.6%，而几乎没有坏死细胞（Annexin V-，PI+）;并检测到HCT116和SW480细胞线粒体膜电位被去极化。ROS水平检测结果显示，紫草素以剂量依赖性方式上调了HCT116和SW480细胞ROS水平。结论：紫草素通过线粒体介导途径诱导结肠癌细胞凋亡，Bcl-2蛋白家族和细胞内ROS水平升高在该过程中发挥重要作用。
关键词 紫草素;结肠癌;活性氧;细胞凋亡;细胞增殖;细胞活力;Bcl-2家族蛋白;线粒体
Shikonin by Activating Reactive Oxygen Species ROS to Inducing Apoptosis in Colorectal Cancer Cells
SUN Yanhua，LI Ming，XU Jianli，DONG Lu，CAO Xuebin，MENG Xiaojing
（Cangzhou People′s Hospital，Cangzhou 061000，China）
Abstract Objective：To study the molecular mechanism of shikonin by activating reactive oxygen species ROS to induce apoptosis of colorectal cancer cells.Methods：The effect of shikonin on the viability of human colon cancer cell lines HCT116 and SW480 was detected by MTT assay，combined with Annexin V-FITC/PI apoptosis detection kit and flow cytometry to detect cell apoptosis; by Caspase 3/9 activity assay kit and caspase activity were was detected.ROS detection kit was used to detect the effect of shikonin treatment on the ROS levels in HCT116 and SW480 cells，and the expression of Bcl-2 and Bcl-xL proteins was detected by Western Blotting.Results：Cell viability test results showed that human normal colonic mucosal epithelial cell line NCM460 was not sensitive to shikonin intervention，while shikonin showed a significant inhibitory effect on human colon cancer cell lines HCT116 and SW480 cells（P<0.05）.Western Blotting detected cyclin D and c-Myc，and Bcl-2 and Bcl-xL protein levels were significantly down-regulated after shikonin intervention（P<0.05）.Meanwhile，shikonin increased the expression levels of Caspase3 and Caspase9 protein in a dose-dependent manner（P<0.05）.Flow cytometry results showed that after treated with 10 μmol/L shikonin for 24 h，the apoptosis rate of HCT116 and SW480 cells increased to 59.2% and 65.6%，with almost no necrotic cells（Annexin V-，PI+）; Mitochondrial membrane potentials to HCT116 and SW480 cells were depolarized.ROS levels showed that shikonin up-regulated ROS levels in HCT116 and SW480 cells in a dose-dependent manner.Conclusion：Shikonin induces apoptosis of colon cancer cells through mitochondria-mediated pathway，and Bcl-2 protein family and intracellular ROS levels play an important role in this process. Keywords Shikonin; Colon cancer; Reactive oxygen species; Cell apoptosis; Cell Proliferation; Cell viability; Bcl-2 family protein; Mitochondria
中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.018
结肠癌是目前世界范围内高发性癌症之一，其中发达国家发病率较高，主要归因于不健康的饮食以及肥胖[1]。随着社会高速发展，结肠癌确诊病例在我国呈现高速增长趋势[2]。已有研究报道，紫草素可有效抑制乳腺癌、肝癌和肺癌等肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡和自噬[3-6]。但是紫草素诱导自噬的作用机制尚未阐明。细胞凋亡和坏死性凋亡是限制恶性细胞成活和传播的天然过程[7]。活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）作为肿瘤生物学的重要研究指标，一方面，氧化应激直接参与了肿瘤生长，转移;另一方面，细胞内ROS的累积会对细胞器的蛋白质、酶和质膜系统造成损害，最终激活细胞凋亡信号通路[8-10]。因此，增加氧化应激是选择性杀死癌细胞的重要治疗策略。本研究旨在阐明外源性氧化应激介导的细胞凋亡在紫草素诱导大肠癌HCT116和SW480细胞凋亡的作用机制，以期将紫草素开发为结肠癌治疗药物提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 人结肠癌细胞系HCT116和SW480，以及正常人结肠黏膜上皮细胞系NCM460，由中国医学科学院基础医学研究所提供，本研究已获医院伦理委员会批准（伦理审批号：CZRMYY-JCSY-1903-N018）。培养基为含10%胎牛血清的RPMI 1640常规培养基。将细胞培养于CO2浓度为5%，温度为37 ℃的培养箱中。
1.1.2 药物 紫草素（Sigma-Aldrich公司，美国，货号：hc10871），溶解于二甲基亚砜（DMSO）中使用。
1.1.3 试剂与仪器 RPMI 1640常规培养基（ThermoFisher公司，美国，货号：A4192302）。ZVAD-FMK（MedChemExpress公司，美国，货号：161401-82-7），碘化丙啶缓冲液（江苏碧云天生物技术研究所，货号：ST512），N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）（江苏碧云天生物技术研究所，货号：S0077），L-谷胱甘肽（GSH）（江苏碧云天生物技术研究所，货号：S0077）。Caspase 3/9活性测定试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所，货号：C1115/C1158），ROS检测试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所，货号：S0033M），Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所，货号：C1075M），Pierce BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific公司，美国，货号：23225）。抗体Bcl-2（Cell Signaling Technology公司，美国，货号：15071），抗体Bcl-xL（Cell Signaling Technology公司，美国，货号：2764），抗体BAX（Cell Signaling Technology公司，美国，货号：89477），抗体Caspase 3（Cell Signaling Technology公司，美国，货号：9662），抗体Caspase 9（Cell Signaling Technology公司，美国，货号：9508），抗体β-actin（Abcam公司，英国，货号：ab8226），抗体c-Myc（Abcam公司，英国，货号：ab32072），抗体Cyclin D（Abcam公司，英国，货号：ab141070），抗体Cyclin E（Abcam公司，英国，货号：ab33911），辣过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠二抗（Santa Cruz公司，美国，货号：sc-47778），山羊抗兔二抗（Santa Cruz公司，美国，货号：sc-2357）。FACS流式细胞仪（BD Biosciences公司，加拿大，货号：343020）。细胞培养箱（Thermo Scientific公司，美国，型号：51030993），酶标仪（Bio-Rad Laboratories，Inc.，美国，型号：168-1130），电泳系统（Bio-Rad Laboratories，Inc.，美国，型号：BJ005269）。
1.2 方法
1.2.1 细胞活力测定 根据实验操作方案使用MTT测定法检测细胞活力。具体操作步骤为：将细胞接种在96孔细胞培养板中，并用不同浓度的药物处理特定时间。处理好的细胞用MTT（5 mg/mL）温育4 h，并在除去上清液后用DMSO溶解。最后，在酶标仪中490 nm处测量吸光度。实验分组包括：1）不同浓度梯度紫草素处理对SW480、HCT116和SW480细胞成活率影响实验，紫草素浓度设置0、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μmol/L;2）5 μmol/L紫草素处理3组细胞不同时间梯度对细胞成活率影响实验，检测时间设置0、6、12、18、24、30、36 h。
1.2.2 细胞周期检测 将SW480细胞接种在6孔细胞培养板中12 h，然后用不同浓度紫草素处理24 h。使用FACS流式细胞仪在具有RNase的碘化丙啶缓冲液存在的情况下进行细胞周期检测。
1.2.3 细胞凋亡分析 将HCT116和SW480细胞接种在6孔细胞培养板板中12 h，然后用对应试剂处理24 h，收获细胞并用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2次。通过Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒及FACS流式细胞仪进行细胞凋亡检测。实验分组：紫草素浓度设置：0、2.5、5、10 μmol/L。 1.2.4 Caspase 3及Caspase 9活性检测 根据操作说明使用Caspase 3/9活性测定试剂盒检测半胱天冬酶活性。具体操作步骤为：将细胞置于6孔细胞培养板中12 h，用试剂处理24 h，收获并重悬于裂解緩冲液中。将细胞蛋白质标准化，并通过底物和酶之间的相互作用评估半胱天冬酶活性。
1.2.5 Western Blotting检测 将细胞或肿瘤组织悬浮于Laemmli缓冲液中。蛋白质浓度使用BCA蛋白质测定试剂盒进行测定。等量蛋白质样品通过SDS-PAGE进行电泳，并转移到聚偏二氟乙烯转移膜。用TBST中的5%新鲜脱脂牛奶封闭膜，并在4 ℃下与TBST中的特异性一抗孵育过夜。将膜用TBST洗涤3次，并在室温下与第二抗体温育2 h。最后，使用ECL试剂盒进行曝光显影，用凝胶成像系统获取蛋白质条带图片。实验分组包括：1）不同浓度紫草素处理对Cyclin D，Cyclin E和c-Myc蛋白表达水平的影响，紫草素浓度设置：0、2.5、5、10 μmol/L;2）不同浓度紫草素处理对Caspase3和Caspase9蛋白表达水平的影响，紫草素浓度设置：0、10、20、30 μmol/L;3）不同浓度紫草素处理对Bcl-2、Bcl-xL和BAX蛋白表达水平的影响，紫草素浓度设置：0、10、20、30 μmol/L。
1.2.6 细胞内ROS检测 使用ROS检测试剂盒测量细胞内ROS。具体操作步骤为：将细胞置于6孔细胞培养板中12 h，用试剂处理12 h，并在37 ℃及黑暗中与DCFH-DA探针温育。通过流式细胞仪测量DCF荧光强度。实验分组：1）不同浓度梯度紫草素处理对ROS水平的影响，紫草素浓度设置：0、2.5、5、10 μmol/L;2）抗氧化剂NAC或GSH干预再接受紫草素处理对ROS水平、凋亡率、Caspase 3和Caspase 9活性的影响，其中DMSO组只经DMSO处理;SHK组只接受紫草素处理;SHK+NAC组经NAC干预，并接受紫草素处理;SHK+GSH组经GSH干预，并接受紫草素处理。
1.2.7 细胞转染 为阐明Bcl-2家族蛋白在紫草素诱导细胞凋亡中的作用机制，首先，在GV316质粒中构建Bcl-2和Bcl-xL过表达质粒。Bcl-2和Bcl-xL表达质粒由Genechem Institute（中国上海）合成。使用Thermo Fisher Scientific的Lipofectamine TM 2000进行质粒转染。其次，通过Western Blotting检测过表达载体瞬时转染SW480细胞中的过表达情况;其中，Control组转染GV316质粒;GV316-Bcl-2组转染GV316 Bcl-2过表达质粒;GV316-Bcl-xL组转染GV316 Bcl-xL过表达质粒。按1.2.3所述实验方法，对Bcl-2和Bcl-xL过表达SW480细胞再接受紫草素处理的凋亡率进行检测分析;其中，Control组转染GV316质粒，不经紫草素处理;SHK组转染GV316质粒，并接受紫草素处理;SHK+Bcl-2组转染GV316 Bcl-2过表达质粒，并接受紫草素处理;SHK+Bcl-xL组转染GV316 Bcl-xL过表达质粒，并接受紫草素处理。
1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism ver.6统计软件对实验数据进行统计分析，所得数据以均数±标准差（±s）表示，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 紫草素对结肠癌细胞增殖的抑制作用 结果表明，紫草素以剂量依赖性方式抑制结肠癌细胞增殖，同时，紫草素对人结肠癌细胞系HCT116和SW480的抑制活性显著高于人正常结肠黏膜上皮细胞系NCM460（P<0.05）。这表明，紫草素对杀死肿瘤细胞呈现出一定选择性。同时本研究也确定了紫草素处理的时间依赖效应。结果表明，紫草素对人结肠癌细胞系HCT116，SW480的抑制效果随时间依赖性增加，并且人正常结肠黏膜上皮细胞系NCM460对培养时间的增加仍然不敏感，更接近其随时间延长的自然生长状态。Western Blotting分析检测到参与G1期的细胞周期蛋白D和c-Myc受紫草素处理影响，其蛋白表达明显减少。见图1。
2.2 紫草素诱导结肠癌细胞凋亡 流式细胞术统计分析结果表明，经浓度梯度紫草素处理后，HCT116和SW480诱导细胞凋亡率明显增加，而几乎没有坏死细胞（Annexin V-，PI+）。同时，HCT116和SW480细胞经ZVAD干预后，也没有观察到坏死比例增加的现象。此外，早期凋亡细胞（Annexin V+，PI-）的比例随着ZVAD的共同处理而降低，表明紫草素具有诱导细胞凋亡的能力。Caspase3和Caspase9的Western Blotting检测到紫草素诱导的细胞凋亡中半胱天冬酶裂解的剂量呈依赖性作用。这些结果表明，紫草素激活了Caspase级联反应，进而诱导结肠癌细胞凋亡。见图2。
2.3 由线粒体介导紫草素诱导的细胞凋亡作用 流式细胞术检测结果表明，HCT116和SW480细胞在紫草素浓度梯度处理后，其线粒体膜电位被去极化。Western Blotting检测结果显示，Bcl-2和Bcl-xL的表达随着紫草素的处理呈现下降趋势，但没有发现其中BAX的显著变化。为了进一步阐明Bcl-2家族在紫草素诱导的细胞凋亡作用机制，瞬时转染构建了Bcl-2和Bcl-xL的过表达体系，再经紫草素处理，Bcl-2或Bcl-xL过表达观察组的细胞凋亡率降低。这些数据表明紫草素通过激活结肠癌细胞中的线粒体介导途径来诱导细胞凋亡。见图3。
2.4 ROS水平在紫草素诱导细胞凋亡中的作用 ROS水平检测结果表明，紫草素剂量依赖性地促进结肠癌细胞中ROS的产生。NAC和GSH是2种常规抗氧化剂，通过与紫草素共同处理发现，NAC或GSH可以阻断紫草素依赖性细胞内ROS的产生，同时，使得细胞凋亡率显著降低。此外，结肠癌细胞Caspase 3和Caspase 9活性在抗氧化剂NAC或GSH作用下明显降低，而紫草素诱导的线粒体膜电位去极化效果也因NAC或GSH作用而减弱。以上结果表明，紫草通过提高细胞内ROS水平和活化线粒体介导的凋亡通路来实现结肠癌细胞凋亡。见图4。 3 讨论
癌症是全球性公共卫生问题，尽管在癌症早期诊断和治疗方面已经进行了大量研究，但许多患者仍死于化疗药物耐药性引起的疾病复发[11]。因此，新药研发能为结肠癌治疗提供了更多可选方案。紫草素已被证实具有抗肿瘤治疗效果[12-13]。本研究实验结果表明，紫草素以剂量依赖的方式有效抑制结肠癌细胞增殖，其中的细胞周期蛋白是紫草素抗癌作用的靶点之一，这与紫草素在乳腺癌细胞相关研究报道结果类似[14]。已有的紫草素安全性相关研究报道中，也证实紫草素对非肿瘤细胞的毒性极小，例如胃上皮细胞系GES-1[15]和正常人肝细胞系L02[5]。综合本研究结果，紫草素是具备进一步发展临床应用价值的结肠癌治疗药物。
肿瘤药物抗性的潜在机制主要归因于抗细胞凋亡途径，癌细胞对化学治疗药物诱导细胞凋亡的敏感性取决于促凋亡信号和抗细胞凋亡信号之间的平衡。死亡受体介导途径和线粒体介导途径是2种主要的凋亡途径[16]。紫草素已被证实为许多肿瘤中的细胞凋亡诱导剂[15]。细胞凋亡是经遗传编码的程序性细胞死亡，这对于机体在生理和病理条件下发挥着至关重要的作用[17-18]。已有研究报道中，紫草素通过诱导程序性细胞死亡，包括凋亡和壞死实现其抗肿瘤效果[19]。本研究结果表明，紫草素以剂量依赖的方式诱导结肠癌细胞HCT116和SW480细胞系凋亡，而并没有发现明显的坏死细胞（Annexin V-，PI+）。此外，泛半胱天冬蛋白酶抑制剂ZVAD在本研究中显示出有效降低早期凋亡细胞比例的作用，进一步证实紫草素诱导细胞凋亡而非细胞坏死性凋亡。
线粒体介导凋亡途径作为主要的凋亡途径之一，Bcl-2家族蛋白在其中发挥着重要作用[20-21]。本研究对HCT116和SW480细胞的线粒体膜电位的检测表明，在紫草素处理后线粒体膜电位去极化，并且通过Bcl-2或Bcl-xL的过表达可抵消部分去极化作用。尽管作为线粒体凋亡蛋白的具体作用机制需要进一步研究，但Bcl-2家族成员在调节紫草素诱导的结肠癌细胞凋亡中发挥着重要作用。而进一步对半胱天冬蛋白酶的检测结果表明，紫草素增加了Caspase3和Caspase9的活性。以上结果证实，紫草素在结肠癌细胞中诱导Bcl-2家族的线粒体凋亡程序。
与正常细胞比较，肿瘤细胞具有更高的代谢和氧化应激，更容易受外源因子诱导的ROS水平变化影响[22]。因此，提高肿瘤细胞内ROS水平有望作为一种选择性杀死癌细胞的策略。细胞内ROS的积累包括2种来源，其一是异常代谢产生，另外还可以通过外源性药物诱导产生。ROS积累可以激活线粒体依赖性凋亡[23-24]，紫草素诱导某些肿瘤细胞中ROS的累积已有研究报道[25]。基于细胞内ROS将不发荧光的DCFH探针氧化成可以通过流式细胞仪检测的DCF荧光探针，便于检测紫草素处理对HCT116和SW480细胞中ROS水平的影响。目前的一些化疗药物通过直接产生ROS，或通过破坏抗氧化系统发挥抗肿瘤作用[26]。本研究结果表明，紫草素以剂量依赖性地提高结肠癌细胞内ROS水平。为了阐明紫草素诱导的细胞凋亡中ROS水平变化机制，进一步评估了2种抗氧化剂，NAC和GSH抗氧化剂有效改善了紫草素诱导的细胞死亡和半胱天冬蛋白酶活化。此外，NAC和GSH抵消了紫草素诱导的线粒体膜电位去极化和Bcl-2或Bcl-xL表达降低。这表明在紫草素诱导的结肠癌细胞凋亡中，ROS作用于线粒体介导通路上游。以上实验结果证明，ROS的积累，下调了Bcl-2和Bcl-xL的表达，线粒体膜电位的去极化，以及半胱天冬蛋白酶级联反应的激活保证了紫草素诱导的结肠癌细胞凋亡。
综上所述，本研究表明紫草素具有诱导结肠癌细胞凋亡的能力。紫草素诱导的结肠癌细胞凋亡由线粒体介导，并受Bcl-2蛋白家族调节;细胞内ROS水平提高在紫草素诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。结合已有紫草素安全性相关研究结果，紫草素可以作为人类结肠癌的潜在治疗候选药物。
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（2020-05-20收稿 责任编辑：杨燕）
基金项目：河北省医学科学研究重点课题计划项目（20191249）
作者简介：孙艳华（1981.05—），男，硕士，主治医师，研究方向：肠胃疾病的发病机制和临床诊治，E-mail：[email protected]
关键词 紫草素;结肠癌;活性氧;细胞凋亡;细胞增殖;细胞活力;Bcl-2家族蛋白;线粒体
Shikonin by Activating Reactive Oxygen Species ROS to Inducing Apoptosis in Colorectal Cancer Cells
SUN Yanhua，LI Ming，XU Jianli，DONG Lu，CAO Xuebin，MENG Xiaojing
（Cangzhou People′s Hospital，Cangzhou 061000，China）
Abstract Objective：To study the molecular mechanism of shikonin by activating reactive oxygen species ROS to induce apoptosis of colorectal cancer cells.Methods：The effect of shikonin on the viability of human colon cancer cell lines HCT116 and SW480 was detected by MTT assay，combined with Annexin V-FITC/PI apoptosis detection kit and flow cytometry to detect cell apoptosis; by Caspase 3/9 activity assay kit and caspase activity were was detected.ROS detection kit was used to detect the effect of shikonin treatment on the ROS levels in HCT116 and SW480 cells，and the expression of Bcl-2 and Bcl-xL proteins was detected by Western Blotting.Results：Cell viability test results showed that human normal colonic mucosal epithelial cell line NCM460 was not sensitive to shikonin intervention，while shikonin showed a significant inhibitory effect on human colon cancer cell lines HCT116 and SW480 cells（P<0.05）.Western Blotting detected cyclin D and c-Myc，and Bcl-2 and Bcl-xL protein levels were significantly down-regulated after shikonin intervention（P<0.05）.Meanwhile，shikonin increased the expression levels of Caspase3 and Caspase9 protein in a dose-dependent manner（P<0.05）.Flow cytometry results showed that after treated with 10 μmol/L shikonin for 24 h，the apoptosis rate of HCT116 and SW480 cells increased to 59.2% and 65.6%，with almost no necrotic cells（Annexin V-，PI+）; Mitochondrial membrane potentials to HCT116 and SW480 cells were depolarized.ROS levels showed that shikonin up-regulated ROS levels in HCT116 and SW480 cells in a dose-dependent manner.Conclusion：Shikonin induces apoptosis of colon cancer cells through mitochondria-mediated pathway，and Bcl-2 protein family and intracellular ROS levels play an important role in this process. Keywords Shikonin; Colon cancer; Reactive oxygen species; Cell apoptosis; Cell Proliferation; Cell viability; Bcl-2 family protein; Mitochondria
中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.018
结肠癌是目前世界范围内高发性癌症之一，其中发达国家发病率较高，主要归因于不健康的饮食以及肥胖[1]。随着社会高速发展，结肠癌确诊病例在我国呈现高速增长趋势[2]。已有研究报道，紫草素可有效抑制乳腺癌、肝癌和肺癌等肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡和自噬[3-6]。但是紫草素诱导自噬的作用机制尚未阐明。细胞凋亡和坏死性凋亡是限制恶性细胞成活和传播的天然过程[7]。活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）作为肿瘤生物学的重要研究指标，一方面，氧化应激直接参与了肿瘤生长，转移;另一方面，细胞内ROS的累积会对细胞器的蛋白质、酶和质膜系统造成损害，最终激活细胞凋亡信号通路[8-10]。因此，增加氧化应激是选择性杀死癌细胞的重要治疗策略。本研究旨在阐明外源性氧化应激介导的细胞凋亡在紫草素诱导大肠癌HCT116和SW480细胞凋亡的作用机制，以期将紫草素开发为结肠癌治疗药物提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 人结肠癌细胞系HCT116和SW480，以及正常人结肠黏膜上皮细胞系NCM460，由中国医学科学院基础医学研究所提供，本研究已获医院伦理委员会批准（伦理审批号：CZRMYY-JCSY-1903-N018）。培养基为含10%胎牛血清的RPMI 1640常规培养基。将细胞培养于CO2浓度为5%，温度为37 ℃的培养箱中。
1.1.2 药物 紫草素（Sigma-Aldrich公司，美国，货号：hc10871），溶解于二甲基亚砜（DMSO）中使用。
1.1.3 试剂与仪器 RPMI 1640常规培养基（ThermoFisher公司，美国，货号：A4192302）。ZVAD-FMK（MedChemExpress公司，美国，货号：161401-82-7），碘化丙啶缓冲液（江苏碧云天生物技术研究所，货号：ST512），N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）（江苏碧云天生物技术研究所，货号：S0077），L-谷胱甘肽（GSH）（江苏碧云天生物技术研究所，货号：S0077）。Caspase 3/9活性测定试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所，货号：C1115/C1158），ROS检测试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所，货号：S0033M），Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所，货号：C1075M），Pierce BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific公司，美国，货号：23225）。抗体Bcl-2（Cell Signaling Technology公司，美国，货号：15071），抗体Bcl-xL（Cell Signaling Technology公司，美国，货号：2764），抗体BAX（Cell Signaling Technology公司，美国，货号：89477），抗体Caspase 3（Cell Signaling Technology公司，美国，货号：9662），抗体Caspase 9（Cell Signaling Technology公司，美国，货号：9508），抗体β-actin（Abcam公司，英国，货号：ab8226），抗体c-Myc（Abcam公司，英国，货号：ab32072），抗体Cyclin D（Abcam公司，英国，货号：ab141070），抗体Cyclin E（Abcam公司，英国，货号：ab33911），辣过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠二抗（Santa Cruz公司，美国，货号：sc-47778），山羊抗兔二抗（Santa Cruz公司，美国，货号：sc-2357）。FACS流式细胞仪（BD Biosciences公司，加拿大，货号：343020）。细胞培养箱（Thermo Scientific公司，美国，型号：51030993），酶标仪（Bio-Rad Laboratories，Inc.，美国，型号：168-1130），电泳系统（Bio-Rad Laboratories，Inc.，美国，型号：BJ005269）。
1.2 方法
1.2.1 细胞活力测定 根据实验操作方案使用MTT测定法检测细胞活力。具体操作步骤为：将细胞接种在96孔细胞培养板中，并用不同浓度的药物处理特定时间。处理好的细胞用MTT（5 mg/mL）温育4 h，并在除去上清液后用DMSO溶解。最后，在酶标仪中490 nm处测量吸光度。实验分组包括：1）不同浓度梯度紫草素处理对SW480、HCT116和SW480细胞成活率影响实验，紫草素浓度设置0、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μmol/L;2）5 μmol/L紫草素处理3组细胞不同时间梯度对细胞成活率影响实验，检测时间设置0、6、12、18、24、30、36 h。
1.2.2 细胞周期检测 将SW480细胞接种在6孔细胞培养板中12 h，然后用不同浓度紫草素处理24 h。使用FACS流式细胞仪在具有RNase的碘化丙啶缓冲液存在的情况下进行细胞周期检测。
1.2.3 细胞凋亡分析 将HCT116和SW480细胞接种在6孔细胞培养板板中12 h，然后用对应试剂处理24 h，收获细胞并用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2次。通过Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒及FACS流式细胞仪进行细胞凋亡检测。实验分组：紫草素浓度设置：0、2.5、5、10 μmol/L。 1.2.4 Caspase 3及Caspase 9活性检测 根据操作说明使用Caspase 3/9活性测定试剂盒检测半胱天冬酶活性。具体操作步骤为：将细胞置于6孔细胞培养板中12 h，用试剂处理24 h，收获并重悬于裂解緩冲液中。将细胞蛋白质标准化，并通过底物和酶之间的相互作用评估半胱天冬酶活性。
1.2.5 Western Blotting检测 将细胞或肿瘤组织悬浮于Laemmli缓冲液中。蛋白质浓度使用BCA蛋白质测定试剂盒进行测定。等量蛋白质样品通过SDS-PAGE进行电泳，并转移到聚偏二氟乙烯转移膜。用TBST中的5%新鲜脱脂牛奶封闭膜，并在4 ℃下与TBST中的特异性一抗孵育过夜。将膜用TBST洗涤3次，并在室温下与第二抗体温育2 h。最后，使用ECL试剂盒进行曝光显影，用凝胶成像系统获取蛋白质条带图片。实验分组包括：1）不同浓度紫草素处理对Cyclin D，Cyclin E和c-Myc蛋白表达水平的影响，紫草素浓度设置：0、2.5、5、10 μmol/L;2）不同浓度紫草素处理对Caspase3和Caspase9蛋白表达水平的影响，紫草素浓度设置：0、10、20、30 μmol/L;3）不同浓度紫草素处理对Bcl-2、Bcl-xL和BAX蛋白表达水平的影响，紫草素浓度设置：0、10、20、30 μmol/L。
1.2.6 细胞内ROS检测 使用ROS检测试剂盒测量细胞内ROS。具体操作步骤为：将细胞置于6孔细胞培养板中12 h，用试剂处理12 h，并在37 ℃及黑暗中与DCFH-DA探针温育。通过流式细胞仪测量DCF荧光强度。实验分组：1）不同浓度梯度紫草素处理对ROS水平的影响，紫草素浓度设置：0、2.5、5、10 μmol/L;2）抗氧化剂NAC或GSH干预再接受紫草素处理对ROS水平、凋亡率、Caspase 3和Caspase 9活性的影响，其中DMSO组只经DMSO处理;SHK组只接受紫草素处理;SHK+NAC组经NAC干预，并接受紫草素处理;SHK+GSH组经GSH干预，并接受紫草素处理。
1.2.7 细胞转染 为阐明Bcl-2家族蛋白在紫草素诱导细胞凋亡中的作用机制，首先，在GV316质粒中构建Bcl-2和Bcl-xL过表达质粒。Bcl-2和Bcl-xL表达质粒由Genechem Institute（中国上海）合成。使用Thermo Fisher Scientific的Lipofectamine TM 2000进行质粒转染。其次，通过Western Blotting检测过表达载体瞬时转染SW480细胞中的过表达情况;其中，Control组转染GV316质粒;GV316-Bcl-2组转染GV316 Bcl-2过表达质粒;GV316-Bcl-xL组转染GV316 Bcl-xL过表达质粒。按1.2.3所述实验方法，对Bcl-2和Bcl-xL过表达SW480细胞再接受紫草素处理的凋亡率进行检测分析;其中，Control组转染GV316质粒，不经紫草素处理;SHK组转染GV316质粒，并接受紫草素处理;SHK+Bcl-2组转染GV316 Bcl-2过表达质粒，并接受紫草素处理;SHK+Bcl-xL组转染GV316 Bcl-xL过表达质粒，并接受紫草素处理。
1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism ver.6统计软件对实验数据进行统计分析，所得数据以均数±标准差（±s）表示，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 紫草素对结肠癌细胞增殖的抑制作用 结果表明，紫草素以剂量依赖性方式抑制结肠癌细胞增殖，同时，紫草素对人结肠癌细胞系HCT116和SW480的抑制活性显著高于人正常结肠黏膜上皮细胞系NCM460（P<0.05）。这表明，紫草素对杀死肿瘤细胞呈现出一定选择性。同时本研究也确定了紫草素处理的时间依赖效应。结果表明，紫草素对人结肠癌细胞系HCT116，SW480的抑制效果随时间依赖性增加，并且人正常结肠黏膜上皮细胞系NCM460对培养时间的增加仍然不敏感，更接近其随时间延长的自然生长状态。Western Blotting分析检测到参与G1期的细胞周期蛋白D和c-Myc受紫草素处理影响，其蛋白表达明显减少。见图1。
2.2 紫草素诱导结肠癌细胞凋亡 流式细胞术统计分析结果表明，经浓度梯度紫草素处理后，HCT116和SW480诱导细胞凋亡率明显增加，而几乎没有坏死细胞（Annexin V-，PI+）。同时，HCT116和SW480细胞经ZVAD干预后，也没有观察到坏死比例增加的现象。此外，早期凋亡细胞（Annexin V+，PI-）的比例随着ZVAD的共同处理而降低，表明紫草素具有诱导细胞凋亡的能力。Caspase3和Caspase9的Western Blotting检测到紫草素诱导的细胞凋亡中半胱天冬酶裂解的剂量呈依赖性作用。这些结果表明，紫草素激活了Caspase级联反应，进而诱导结肠癌细胞凋亡。见图2。
2.3 由线粒体介导紫草素诱导的细胞凋亡作用 流式细胞术检测结果表明，HCT116和SW480细胞在紫草素浓度梯度处理后，其线粒体膜电位被去极化。Western Blotting检测结果显示，Bcl-2和Bcl-xL的表达随着紫草素的处理呈现下降趋势，但没有发现其中BAX的显著变化。为了进一步阐明Bcl-2家族在紫草素诱导的细胞凋亡作用机制，瞬时转染构建了Bcl-2和Bcl-xL的过表达体系，再经紫草素处理，Bcl-2或Bcl-xL过表达观察组的细胞凋亡率降低。这些数据表明紫草素通过激活结肠癌细胞中的线粒体介导途径来诱导细胞凋亡。见图3。
2.4 ROS水平在紫草素诱导细胞凋亡中的作用 ROS水平检测结果表明，紫草素剂量依赖性地促进结肠癌细胞中ROS的产生。NAC和GSH是2种常规抗氧化剂，通过与紫草素共同处理发现，NAC或GSH可以阻断紫草素依赖性细胞内ROS的产生，同时，使得细胞凋亡率显著降低。此外，结肠癌细胞Caspase 3和Caspase 9活性在抗氧化剂NAC或GSH作用下明显降低，而紫草素诱导的线粒体膜电位去极化效果也因NAC或GSH作用而减弱。以上结果表明，紫草通过提高细胞内ROS水平和活化线粒体介导的凋亡通路来实现结肠癌细胞凋亡。见图4。 3 讨论
癌症是全球性公共卫生问题，尽管在癌症早期诊断和治疗方面已经进行了大量研究，但许多患者仍死于化疗药物耐药性引起的疾病复发[11]。因此，新药研发能为结肠癌治疗提供了更多可选方案。紫草素已被证实具有抗肿瘤治疗效果[12-13]。本研究实验结果表明，紫草素以剂量依赖的方式有效抑制结肠癌细胞增殖，其中的细胞周期蛋白是紫草素抗癌作用的靶点之一，这与紫草素在乳腺癌细胞相关研究报道结果类似[14]。已有的紫草素安全性相关研究报道中，也证实紫草素对非肿瘤细胞的毒性极小，例如胃上皮细胞系GES-1[15]和正常人肝细胞系L02[5]。综合本研究结果，紫草素是具备进一步发展临床应用价值的结肠癌治疗药物。
肿瘤药物抗性的潜在机制主要归因于抗细胞凋亡途径，癌细胞对化学治疗药物诱导细胞凋亡的敏感性取决于促凋亡信号和抗细胞凋亡信号之间的平衡。死亡受体介导途径和线粒体介导途径是2种主要的凋亡途径[16]。紫草素已被证实为许多肿瘤中的细胞凋亡诱导剂[15]。细胞凋亡是经遗传编码的程序性细胞死亡，这对于机体在生理和病理条件下发挥着至关重要的作用[17-18]。已有研究报道中，紫草素通过诱导程序性细胞死亡，包括凋亡和壞死实现其抗肿瘤效果[19]。本研究结果表明，紫草素以剂量依赖的方式诱导结肠癌细胞HCT116和SW480细胞系凋亡，而并没有发现明显的坏死细胞（Annexin V-，PI+）。此外，泛半胱天冬蛋白酶抑制剂ZVAD在本研究中显示出有效降低早期凋亡细胞比例的作用，进一步证实紫草素诱导细胞凋亡而非细胞坏死性凋亡。
线粒体介导凋亡途径作为主要的凋亡途径之一，Bcl-2家族蛋白在其中发挥着重要作用[20-21]。本研究对HCT116和SW480细胞的线粒体膜电位的检测表明，在紫草素处理后线粒体膜电位去极化，并且通过Bcl-2或Bcl-xL的过表达可抵消部分去极化作用。尽管作为线粒体凋亡蛋白的具体作用机制需要进一步研究，但Bcl-2家族成员在调节紫草素诱导的结肠癌细胞凋亡中发挥着重要作用。而进一步对半胱天冬蛋白酶的检测结果表明，紫草素增加了Caspase3和Caspase9的活性。以上结果证实，紫草素在结肠癌细胞中诱导Bcl-2家族的线粒体凋亡程序。
与正常细胞比较，肿瘤细胞具有更高的代谢和氧化应激，更容易受外源因子诱导的ROS水平变化影响[22]。因此，提高肿瘤细胞内ROS水平有望作为一种选择性杀死癌细胞的策略。细胞内ROS的积累包括2种来源，其一是异常代谢产生，另外还可以通过外源性药物诱导产生。ROS积累可以激活线粒体依赖性凋亡[23-24]，紫草素诱导某些肿瘤细胞中ROS的累积已有研究报道[25]。基于细胞内ROS将不发荧光的DCFH探针氧化成可以通过流式细胞仪检测的DCF荧光探针，便于检测紫草素处理对HCT116和SW480细胞中ROS水平的影响。目前的一些化疗药物通过直接产生ROS，或通过破坏抗氧化系统发挥抗肿瘤作用[26]。本研究结果表明，紫草素以剂量依赖性地提高结肠癌细胞内ROS水平。为了阐明紫草素诱导的细胞凋亡中ROS水平变化机制，进一步评估了2种抗氧化剂，NAC和GSH抗氧化剂有效改善了紫草素诱导的细胞死亡和半胱天冬蛋白酶活化。此外，NAC和GSH抵消了紫草素诱导的线粒体膜电位去极化和Bcl-2或Bcl-xL表达降低。这表明在紫草素诱导的结肠癌细胞凋亡中，ROS作用于线粒体介导通路上游。以上实验结果证明，ROS的积累，下调了Bcl-2和Bcl-xL的表达，线粒体膜电位的去极化，以及半胱天冬蛋白酶级联反应的激活保证了紫草素诱导的结肠癌细胞凋亡。
综上所述，本研究表明紫草素具有诱导结肠癌细胞凋亡的能力。紫草素诱导的结肠癌细胞凋亡由线粒体介导，并受Bcl-2蛋白家族调节;细胞内ROS水平提高在紫草素诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。结合已有紫草素安全性相关研究结果，紫草素可以作为人类结肠癌的潜在治疗候选药物。
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（2020-05-20收稿 责任编辑：杨燕）
基金项目：河北省医学科学研究重点课题计划项目（20191249）
作者简介：孙艳华（1981.05—），男，硕士，主治医师，研究方向：肠胃疾病的发病机制和临床诊治，E-mail：[email protected]