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摘要 [目的] 为了建立蛋白核小球藻无菌培养体系。[方法] 选取卡那霉素、链霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、潮霉素和头孢霉素6种常用抗生素，比较蛋白核小球藻的除菌和纯化效果。同时，对比蛋白核小球藻对不同浓度的卡那霉素和潮霉素的耐受性以及单独使用卡那霉素和潮霉素的多次除菌效果。[结果] 卡那霉素和潮霉素对涂布带菌藻液的抑菌和除菌效果明显，其他4种抗生素的抑菌效果较差；小球藻对不同抗生素的耐受性不同，蛋白核小球藻对潮霉素敏感，50 mg/L就可以明显抑制其的生长，而对卡那霉素的敏感性要低得多，在200 mg/L时其生长受到显著抑制。[结论] 考虑到高浓度卡那霉素对蛋白核小球藻生长的抑制作用，最终确定用50 mg/L卡那霉素连续3次除菌处理的方式建立蛋白核小球藻的无菌培养体系；同时，测得纯化培养的蛋白核小球藻藻液在685 nm处具有最大吸收峰，在此波长下小球藻的细胞浓度与吸光值呈线性相关，可用A685来估测蛋白核小球藻浓度。
关键词 蛋白核小球藻；除菌；体系
中图分类号 S-3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）19-014-04
小球藻（Chlorella）是一种单细胞绿藻，属真核藻类。我国常见的种类有蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、椭圆小球藻（Chlorella ellipoidea）和普通小球藻（Chlorella vulgaris）等[1]。小球藻分布广，光合效率高，易于培养，可快速繁殖和生长[2-3]，且细胞内含有丰富的蛋白质、维生素、不饱和脂肪酸、类胡萝卜素和虾青素等多种营养物质，具有重要的营养和保健价值[4-6]。
微生物研究中一个重要的环节就是建立无菌培养体系。藻类也是如此。杂菌会给试验数据带来误差，甚至还会有假阳性结果[7]。蛋白核小球藻的细胞壁上极易吸附细菌，不易除去[8]。除菌与否能明显影响小球藻的生长特点。从生长曲线来看，未除菌小球藻与除菌后小球藻的生长速度大致相同，在曲线达到稳定期后它们的最大细胞密度相差不多。但是，未除菌小球藻在培养数天后少量细胞有下沉现象，还会黏附于培养设备的底部和侧壁，不易被摇起，颜色会从绿色向黄色变化。而经过除菌处理的小球藻经过长时间的培养也很少有细胞下沉，摇动时下沉的细胞易浮起，颜色一直呈现鲜绿，老化明显延迟。这可能是因为吸附在小球藻细胞表面的细菌会分泌能促使藻细胞老化的物质[9]。另外，在以特定波长的吸光度表示藻浓度时，细菌的存在还会给测定结果带来正误差。
研究表明，真核藻类细胞对多种常用抗生素不敏感，链霉素甚至可以促进很多真核藻类细胞的生长[10-11]。通过选择适当的抗生素，利用小球藻与其杂菌对抗生素敏感性的差异，在不对小球藻的生长造成影响的情况下，杀死或抑制杂菌[12-13]。
为了获得无菌的小球藻体系，选择氨苄青霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、头孢霉素和潮霉素6种实验室常用抗生素，对比它们的除菌效果，再结合蛋白核小球藻对抗生素的敏感性，选择适于蛋白核小球藻除菌的抗生素及其浓度。
1 材料与方法
1.1 试验藻种
蛋白核小球藻购于中科院水生生物研究所，编号为FACHB-9。
1.2 培养基及配制方法
1.2.1
液体培养基。BG-11培养基是藻类的通用培养基。1 L BG-11培养基中含硝酸钠1.5 g、三水合磷酸氢二钾3 mg、碳酸钠20 mg、柠檬酸6 mg、柠檬酸铁铵6 mg、乙二胺四乙酸1 mg、硼酸2.86 mg、四水合氯化锰1.81 mg、七水合硫酸锌0.222 mg、
二水合钼酸钠0.29 mg、硫酸铜0.79 mg、六水合硝酸钴0.049 2 mg、二水合氯化钙36 mg、七水合硫酸镁75 mg。各成分预先配制成储备溶液，浓度为培养基中浓度的1 000倍，4 ℃储存。储备时，各取储备液1 ml，定容至1 L，并调节pH至7，在121 ℃下灭菌25 min，冷却，即得到BG-11培养基。
1.2.2 固体培养基。各取1 ml储备溶液，并定容至1 L，称取13 g琼脂粉于培养基中，在充分混匀的状态下调节pH至7，在121 ℃下灭菌25 min，趁热分装到12.5 cm培养皿中，并冷却。
1.3 6种抗生素的除菌效果试验
将灭菌后的BG-11和浓度1.3%琼脂培养基分装到12.5 cm培养皿中，分别向其中加入6种抗生素，每种抗生素的浓度分别为50、100、200、400 mg/L，充分混匀后冷却。
将蛋白核小球藻藻液均匀涂布在培养基表面后密封，放入光照培养箱中，在25 ℃、4 320 lx光照强度下培养10 d，记录各培养皿中菌落数量。
1.4 蛋白核小球藻对潮霉素和卡那霉素的耐受性试验
将灭菌后的BG-11培养基分装到250 ml三角瓶中，分别加入潮霉素和卡那霉素。每个抗生素组都包括50、100、200、400 mg/L 4种浓度。将蛋白核小球藻藻液按5%比例接种到培养基中，密封好后放入光照培养箱中，在25 ℃、4 320 lx光照强度下培养10 d后观察。
1.5 潮霉素和卡那霉素多次除菌试验
将灭菌后的BG-11和浓度1.3%琼脂培养基分装到12.5 cm培养皿中，培养皿中的抗生素分别为50 mg/L潮霉素、50 mg/L卡那霉素和100 mg/L卡那霉素，充分混匀后冷却。
将蛋白核小球藻藻液均匀涂布在培养基表面后密封，放入光照培养箱中，在25 ℃、4 320 lx光照强度下培养10 d，记录各培养皿中菌落的数量。然后，将细菌接种到相同浓度抗生素的培养基中，如果没有菌落则无需接种。将接种后的培养基以同样的调节培养10 d，记录各培养皿中菌落的数量。对于仍然有菌落出现的培养基，再重复上述操作。 1.6 藻液紫外-可见光谱的检测
将除菌后的蛋白核小球藻藻液按5%比例接种到100 ml BG-11培养基中。在光照培养箱中以25 ℃、4 320 lx光照强度培养7 d，每天手摇3次。
移取3 ml藻液于1 cm比色杯中，以3 ml BG-11培养基为对照，扫描400～800 nm波长范围内藻液的紫外-可见光谱。
1.7 蛋白核小球藻繁殖时藻液pH的变化
将除菌后的蛋白核小球藻藻液接种到500 ml BG-11培养基中（按5%接种），在光照培养箱中以25 ℃、4 320 lx培养20 d，每天手摇3次。在培养期间，每天取5 ml藻液至试管中，测定藻液pH。
2 结果与分析
2.1 6种抗生素对蛋白核小球藻的除菌效果
为了获得纯化的蛋白核小球藻体系，必须选择合适的抗生素进行杀菌或抑菌。为此，选择卡那霉素、链霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、潮霉素和头孢霉素6种实验室常用抗生素，分别考察不同浓度对蛋白核小球藻的除菌效果。
蛋白核小球藻在含有50～400 mg/L抗生素的固体培养基表面生长10 d后，共出现3种菌落，分别为橘红色的细菌菌落、表面粗糙的白色菌落和透明的水泡状菌落。含头孢霉素的固体培养基较多出现橘红色菌落，含链霉素和庆大霉素的培养基表面也有橘红色菌落生长，但个数少于含头孢霉素的培养基。表面粗糙的白色菌落多出现在含头孢霉素和链霉素的固体培养基表面，而在卡那霉素培养基表面略少一些。透明的水泡状菌落较多地出现在链霉素培养基表面。
由表1可知，在6种抗生素中，链霉素、庆大霉素和氨苄青霉素对蛋白核小球藻藻液的除菌效果较差，浓度在400 mg/L时仍有菌落，在50 mg/L时菌落数量多于20个，不适宜用来单独除菌。头孢霉素与氨苄青霉素的抗菌谱相似，故数据接近，且头孢霉素对蛋白核小球藻的除菌效果略好于氨苄青霉素。潮霉素和卡那霉素的除菌效果较明显，卡那霉素在400 mg/L时培养基表面没有菌落，潮霉素在200、400 mg/L时培养基表明没有菌落，卡那霉素和潮霉素在低浓度时菌落数量也低于其他4种抗生素。因此，可以初步确定潮霉素或卡那霉素单独使用作为蛋白核小球藻除菌的抗生素。
2.2 蛋白核小球藻对潮霉素和卡那霉素的耐受性
尽管潮霉素和卡那霉素都能够达到除菌目的，但还必须考虑到蛋白核对它们的耐受情况。为此，分别考察了浓度为50、100、200、400 mg/L的潮霉素和卡那霉素对液体培养情况下小球藻的影响。
由图1可知，蛋白核小球藻在含有50～400 mg/L抗生素的液体培养基培养10 d后，藻液颜色随卡那霉素浓度的增加而明显变浅，当卡那霉素浓度为200和400 mg/L时藻液已经基本无色，与最右边空白对照组相比差别不大。当卡那霉素浓度为50和100 mg/L时，藻液呈现一种介于黄色和绿色之间的颜色，表明在此浓度下卡那霉素对蛋白核小球藻也有一定的影响。
由图2可知，当潮霉素浓度为50 mg/L时藻液已经接近无色，而当高于50 mg/L时溶液颜色与空白组没有明显差异，说明蛋白核小球藻对潮霉素较敏感，50 mg/L潮霉素已经可以明显抑制蛋白核小球藻的生长。无论是50 mg/L潮霉素还是100或200 mg/L卡那霉素都不能使BG-11+1.3%琼脂培养基表面不出现菌落，因此还必须研究卡那霉素或潮霉素的多次除菌效果。
2.3 卡那霉素和潮霉素多次除菌效果
由表1可知，50 mg/L潮霉素、100和200 mg/L卡那霉素已对小球藻的生长产生抑制作用，而在这些浓度水平下，一次除菌处理不能使固体培养基表面不出现菌落。因此，设计了卡那霉素和潮霉素多次除菌试验。由表2可知，50 mg/L潮霉素和50、100 mg/L卡那霉素经过3次除菌处理后固体表面培养基均无菌落出现。考虑到高浓度卡那霉素对蛋白核小球藻生长的抑制作用，最终确定用50 mg/L卡那霉素连续3次除菌处理的方式建立蛋白核小球藻的无菌培养体系。
经过上述除菌方法处理的蛋白核小球藻，再经5次传代培养（按10%接种，各代培养10 d），培养方式为BG-11培养基、25 ℃、日平均光照强度4 320 lx、每日手摇3次，彻底消除残留抗生素影响，然后将藻液涂布在LB+浓度1.3%琼脂固体培养基表面，在摇床中培养5 d（37 ℃，无光照），发现培养基表面无菌落出现，说明蛋白核小球藻培养液内无细菌存在。通过以上试验，成功地建立了小球藻的无菌培养体系。
2.4 蛋白核小球藻藻液的紫外-可见光谱
藻液浓度通常有两种表示方法：一是计数，二是以合适波长下A值作为浓度的参考。与计数相比，A值更加简便迅速，因此需要检测蛋白核小球藻藻液的紫外-可见光谱以确定最佳检测波长。
由图3可知，在波长扫描范围400～800 nm，从紫外区到500 nm范围内呈现一个宽而高的吸收带，在600～800 nm区间内有一个明显的波谷，出现在640 nm附近，最高峰出现在685 nm，在650 nm处还有一个较明显的肩峰。
吕旭阳等[14]研究表明，在450～700 nm波长下，小球藻细胞浓度与藻液吸光度之间均表现为极显著的线性相关，可以通过测定藻液吸光度，然后通过对应的直线回归方程换算出培养液的藻细胞浓度。因此，确定A685表示藻细胞浓度。
2.5 蛋白核小球藻繁殖时藻液pH的变化
培养基pH能影响小球藻的生长。研究表明，小球藻在pH为10左右的碱性环境下生长最快，在中性环境下虽然也能生长，但接种后有很长的迟缓期。 小球藻的生长也会影响到藻液pH的变化，表现为：
小球藻生长会利用培养基中的NO-3，NO-3被吸收进细胞的同时伴随有H+的共转运，使得藻液pH上升。这个上升过程是有限度的，H+浓度的降低会抑制吸收，同时培养基中的消耗也会抑制这个过程，达到平衡时pH保持稳定。由图4可知，藻液的pH随培养时间的增加而增大，在起始BG-11培养基的pH不同的情况下藻液最终的pH都稳定在11。 王逸云[7]研究发现，以f/2培养基培养一种海水小球藻（Chlorella sp. MACC/C95），藻液最终的pH稳定在10左右。两者的差异除了藻种的不同，还可能因为培养基配方中缓冲体系的差异以及NaNO3含量不同，BG-11培养基中NaNO3含量为1.5 g/L，而1 L f/2培养基中只含有NaNO3 74.8 mg。这意味着在BG-11培养基中，藻细胞可以吸收更多的H+，最终pH也略高一些。
3 结论
使用卡那霉素、链霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、潮霉素和头孢霉素6种抗生素用于蛋白核小球藻的除菌和纯化效果比较。研究表明，卡那霉素和潮霉素对涂布带菌藻液的抑菌和除菌效果明显，其他4种抗生素的抑菌效果较差；小球藻对不同抗生素的耐受性不同，蛋白核小球藻对潮霉素敏感，50 mg/L就可以明显抑制其生长；而对卡那霉素的敏感性要低得多，在200 mg/L时其生长才显著受到抑制；考虑到高浓度卡那霉素对蛋白核小球藻生长的抑制作用，最终确定用50 mg/L卡那霉素连续3次除菌处理的方式建立蛋白核小球藻的无菌培养体系；同时，测得纯化培养的蛋白核小球藻在685 nm处具有最大吸收峰，在此波长下小球藻的细胞浓度与吸光值呈线性相关，可用A685来估测蛋白核小球藻浓度。
参考文献
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[4] 李佳娥.小球藻多醣体的萃取与功能评估探讨[D].台湾：嘉南药理科技大学，2007.
[5] 董黎明，汪苹，李金穗，等.异养小球藻主要营养成分及氨基酸组成分析[J].食品科学，2012（3）：232-237.
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[10] WANG C H，WANG Y Y，SUN Y Y，et al.Effect of antibiotic treatment on toxin production by Alexandrium tamarense[J].Biomedical and Environmental Sciences， 2003， 16： 340-347.
[11] 黄健，宫相忠，唐学玺，等.链霉素对海洋微藻的毒物刺激效应[J].青岛海洋大学学报，2000，30（4）： 639-644.
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[13] COTTRELL M T，SUTTLE C A.Production of axenic cultures of Micromonas pusilla （Prasinophyceae） using antibiotics[J].J Phycol， 1993， 29： 385-387.
[14] 吕旭阳，张雯，杨阳，等.分光光度法测定小球藻数量的方法研究[J].安徽农业科学，2009（23）：11104-11105.
关键词 蛋白核小球藻；除菌；体系
中图分类号 S-3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）19-014-04
小球藻（Chlorella）是一种单细胞绿藻，属真核藻类。我国常见的种类有蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、椭圆小球藻（Chlorella ellipoidea）和普通小球藻（Chlorella vulgaris）等[1]。小球藻分布广，光合效率高，易于培养，可快速繁殖和生长[2-3]，且细胞内含有丰富的蛋白质、维生素、不饱和脂肪酸、类胡萝卜素和虾青素等多种营养物质，具有重要的营养和保健价值[4-6]。
微生物研究中一个重要的环节就是建立无菌培养体系。藻类也是如此。杂菌会给试验数据带来误差，甚至还会有假阳性结果[7]。蛋白核小球藻的细胞壁上极易吸附细菌，不易除去[8]。除菌与否能明显影响小球藻的生长特点。从生长曲线来看，未除菌小球藻与除菌后小球藻的生长速度大致相同，在曲线达到稳定期后它们的最大细胞密度相差不多。但是，未除菌小球藻在培养数天后少量细胞有下沉现象，还会黏附于培养设备的底部和侧壁，不易被摇起，颜色会从绿色向黄色变化。而经过除菌处理的小球藻经过长时间的培养也很少有细胞下沉，摇动时下沉的细胞易浮起，颜色一直呈现鲜绿，老化明显延迟。这可能是因为吸附在小球藻细胞表面的细菌会分泌能促使藻细胞老化的物质[9]。另外，在以特定波长的吸光度表示藻浓度时，细菌的存在还会给测定结果带来正误差。
研究表明，真核藻类细胞对多种常用抗生素不敏感，链霉素甚至可以促进很多真核藻类细胞的生长[10-11]。通过选择适当的抗生素，利用小球藻与其杂菌对抗生素敏感性的差异，在不对小球藻的生长造成影响的情况下，杀死或抑制杂菌[12-13]。
为了获得无菌的小球藻体系，选择氨苄青霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、头孢霉素和潮霉素6种实验室常用抗生素，对比它们的除菌效果，再结合蛋白核小球藻对抗生素的敏感性，选择适于蛋白核小球藻除菌的抗生素及其浓度。
1 材料与方法
1.1 试验藻种
蛋白核小球藻购于中科院水生生物研究所，编号为FACHB-9。
1.2 培养基及配制方法
1.2.1
液体培养基。BG-11培养基是藻类的通用培养基。1 L BG-11培养基中含硝酸钠1.5 g、三水合磷酸氢二钾3 mg、碳酸钠20 mg、柠檬酸6 mg、柠檬酸铁铵6 mg、乙二胺四乙酸1 mg、硼酸2.86 mg、四水合氯化锰1.81 mg、七水合硫酸锌0.222 mg、
二水合钼酸钠0.29 mg、硫酸铜0.79 mg、六水合硝酸钴0.049 2 mg、二水合氯化钙36 mg、七水合硫酸镁75 mg。各成分预先配制成储备溶液，浓度为培养基中浓度的1 000倍，4 ℃储存。储备时，各取储备液1 ml，定容至1 L，并调节pH至7，在121 ℃下灭菌25 min，冷却，即得到BG-11培养基。
1.2.2 固体培养基。各取1 ml储备溶液，并定容至1 L，称取13 g琼脂粉于培养基中，在充分混匀的状态下调节pH至7，在121 ℃下灭菌25 min，趁热分装到12.5 cm培养皿中，并冷却。
1.3 6种抗生素的除菌效果试验
将灭菌后的BG-11和浓度1.3%琼脂培养基分装到12.5 cm培养皿中，分别向其中加入6种抗生素，每种抗生素的浓度分别为50、100、200、400 mg/L，充分混匀后冷却。
将蛋白核小球藻藻液均匀涂布在培养基表面后密封，放入光照培养箱中，在25 ℃、4 320 lx光照强度下培养10 d，记录各培养皿中菌落数量。
1.4 蛋白核小球藻对潮霉素和卡那霉素的耐受性试验
将灭菌后的BG-11培养基分装到250 ml三角瓶中，分别加入潮霉素和卡那霉素。每个抗生素组都包括50、100、200、400 mg/L 4种浓度。将蛋白核小球藻藻液按5%比例接种到培养基中，密封好后放入光照培养箱中，在25 ℃、4 320 lx光照强度下培养10 d后观察。
1.5 潮霉素和卡那霉素多次除菌试验
将灭菌后的BG-11和浓度1.3%琼脂培养基分装到12.5 cm培养皿中，培养皿中的抗生素分别为50 mg/L潮霉素、50 mg/L卡那霉素和100 mg/L卡那霉素，充分混匀后冷却。
将蛋白核小球藻藻液均匀涂布在培养基表面后密封，放入光照培养箱中，在25 ℃、4 320 lx光照强度下培养10 d，记录各培养皿中菌落的数量。然后，将细菌接种到相同浓度抗生素的培养基中，如果没有菌落则无需接种。将接种后的培养基以同样的调节培养10 d，记录各培养皿中菌落的数量。对于仍然有菌落出现的培养基，再重复上述操作。 1.6 藻液紫外-可见光谱的检测
将除菌后的蛋白核小球藻藻液按5%比例接种到100 ml BG-11培养基中。在光照培养箱中以25 ℃、4 320 lx光照强度培养7 d，每天手摇3次。
移取3 ml藻液于1 cm比色杯中，以3 ml BG-11培养基为对照，扫描400～800 nm波长范围内藻液的紫外-可见光谱。
1.7 蛋白核小球藻繁殖时藻液pH的变化
将除菌后的蛋白核小球藻藻液接种到500 ml BG-11培养基中（按5%接种），在光照培养箱中以25 ℃、4 320 lx培养20 d，每天手摇3次。在培养期间，每天取5 ml藻液至试管中，测定藻液pH。
2 结果与分析
2.1 6种抗生素对蛋白核小球藻的除菌效果
为了获得纯化的蛋白核小球藻体系，必须选择合适的抗生素进行杀菌或抑菌。为此，选择卡那霉素、链霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、潮霉素和头孢霉素6种实验室常用抗生素，分别考察不同浓度对蛋白核小球藻的除菌效果。
蛋白核小球藻在含有50～400 mg/L抗生素的固体培养基表面生长10 d后，共出现3种菌落，分别为橘红色的细菌菌落、表面粗糙的白色菌落和透明的水泡状菌落。含头孢霉素的固体培养基较多出现橘红色菌落，含链霉素和庆大霉素的培养基表面也有橘红色菌落生长，但个数少于含头孢霉素的培养基。表面粗糙的白色菌落多出现在含头孢霉素和链霉素的固体培养基表面，而在卡那霉素培养基表面略少一些。透明的水泡状菌落较多地出现在链霉素培养基表面。
由表1可知，在6种抗生素中，链霉素、庆大霉素和氨苄青霉素对蛋白核小球藻藻液的除菌效果较差，浓度在400 mg/L时仍有菌落，在50 mg/L时菌落数量多于20个，不适宜用来单独除菌。头孢霉素与氨苄青霉素的抗菌谱相似，故数据接近，且头孢霉素对蛋白核小球藻的除菌效果略好于氨苄青霉素。潮霉素和卡那霉素的除菌效果较明显，卡那霉素在400 mg/L时培养基表面没有菌落，潮霉素在200、400 mg/L时培养基表明没有菌落，卡那霉素和潮霉素在低浓度时菌落数量也低于其他4种抗生素。因此，可以初步确定潮霉素或卡那霉素单独使用作为蛋白核小球藻除菌的抗生素。
2.2 蛋白核小球藻对潮霉素和卡那霉素的耐受性
尽管潮霉素和卡那霉素都能够达到除菌目的，但还必须考虑到蛋白核对它们的耐受情况。为此，分别考察了浓度为50、100、200、400 mg/L的潮霉素和卡那霉素对液体培养情况下小球藻的影响。
由图1可知，蛋白核小球藻在含有50～400 mg/L抗生素的液体培养基培养10 d后，藻液颜色随卡那霉素浓度的增加而明显变浅，当卡那霉素浓度为200和400 mg/L时藻液已经基本无色，与最右边空白对照组相比差别不大。当卡那霉素浓度为50和100 mg/L时，藻液呈现一种介于黄色和绿色之间的颜色，表明在此浓度下卡那霉素对蛋白核小球藻也有一定的影响。
由图2可知，当潮霉素浓度为50 mg/L时藻液已经接近无色，而当高于50 mg/L时溶液颜色与空白组没有明显差异，说明蛋白核小球藻对潮霉素较敏感，50 mg/L潮霉素已经可以明显抑制蛋白核小球藻的生长。无论是50 mg/L潮霉素还是100或200 mg/L卡那霉素都不能使BG-11+1.3%琼脂培养基表面不出现菌落，因此还必须研究卡那霉素或潮霉素的多次除菌效果。
2.3 卡那霉素和潮霉素多次除菌效果
由表1可知，50 mg/L潮霉素、100和200 mg/L卡那霉素已对小球藻的生长产生抑制作用，而在这些浓度水平下，一次除菌处理不能使固体培养基表面不出现菌落。因此，设计了卡那霉素和潮霉素多次除菌试验。由表2可知，50 mg/L潮霉素和50、100 mg/L卡那霉素经过3次除菌处理后固体表面培养基均无菌落出现。考虑到高浓度卡那霉素对蛋白核小球藻生长的抑制作用，最终确定用50 mg/L卡那霉素连续3次除菌处理的方式建立蛋白核小球藻的无菌培养体系。
经过上述除菌方法处理的蛋白核小球藻，再经5次传代培养（按10%接种，各代培养10 d），培养方式为BG-11培养基、25 ℃、日平均光照强度4 320 lx、每日手摇3次，彻底消除残留抗生素影响，然后将藻液涂布在LB+浓度1.3%琼脂固体培养基表面，在摇床中培养5 d（37 ℃，无光照），发现培养基表面无菌落出现，说明蛋白核小球藻培养液内无细菌存在。通过以上试验，成功地建立了小球藻的无菌培养体系。
2.4 蛋白核小球藻藻液的紫外-可见光谱
藻液浓度通常有两种表示方法：一是计数，二是以合适波长下A值作为浓度的参考。与计数相比，A值更加简便迅速，因此需要检测蛋白核小球藻藻液的紫外-可见光谱以确定最佳检测波长。
由图3可知，在波长扫描范围400～800 nm，从紫外区到500 nm范围内呈现一个宽而高的吸收带，在600～800 nm区间内有一个明显的波谷，出现在640 nm附近，最高峰出现在685 nm，在650 nm处还有一个较明显的肩峰。
吕旭阳等[14]研究表明，在450～700 nm波长下，小球藻细胞浓度与藻液吸光度之间均表现为极显著的线性相关，可以通过测定藻液吸光度，然后通过对应的直线回归方程换算出培养液的藻细胞浓度。因此，确定A685表示藻细胞浓度。
2.5 蛋白核小球藻繁殖时藻液pH的变化
培养基pH能影响小球藻的生长。研究表明，小球藻在pH为10左右的碱性环境下生长最快，在中性环境下虽然也能生长，但接种后有很长的迟缓期。 小球藻的生长也会影响到藻液pH的变化，表现为：
小球藻生长会利用培养基中的NO-3，NO-3被吸收进细胞的同时伴随有H+的共转运，使得藻液pH上升。这个上升过程是有限度的，H+浓度的降低会抑制吸收，同时培养基中的消耗也会抑制这个过程，达到平衡时pH保持稳定。由图4可知，藻液的pH随培养时间的增加而增大，在起始BG-11培养基的pH不同的情况下藻液最终的pH都稳定在11。 王逸云[7]研究发现，以f/2培养基培养一种海水小球藻（Chlorella sp. MACC/C95），藻液最终的pH稳定在10左右。两者的差异除了藻种的不同，还可能因为培养基配方中缓冲体系的差异以及NaNO3含量不同，BG-11培养基中NaNO3含量为1.5 g/L，而1 L f/2培养基中只含有NaNO3 74.8 mg。这意味着在BG-11培养基中，藻细胞可以吸收更多的H+，最终pH也略高一些。
3 结论
使用卡那霉素、链霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、潮霉素和头孢霉素6种抗生素用于蛋白核小球藻的除菌和纯化效果比较。研究表明，卡那霉素和潮霉素对涂布带菌藻液的抑菌和除菌效果明显，其他4种抗生素的抑菌效果较差；小球藻对不同抗生素的耐受性不同，蛋白核小球藻对潮霉素敏感，50 mg/L就可以明显抑制其生长；而对卡那霉素的敏感性要低得多，在200 mg/L时其生长才显著受到抑制；考虑到高浓度卡那霉素对蛋白核小球藻生长的抑制作用，最终确定用50 mg/L卡那霉素连续3次除菌处理的方式建立蛋白核小球藻的无菌培养体系；同时，测得纯化培养的蛋白核小球藻在685 nm处具有最大吸收峰，在此波长下小球藻的细胞浓度与吸光值呈线性相关，可用A685来估测蛋白核小球藻浓度。
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