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摘要：目的 建立金茵利胆口服液的质量标准。方法 采用薄层色谱法对金茵利胆口服液中茵陈、蒲公英、枳壳、五味子进行定性鉴别。采用高效液相色谱法对该制剂中有效成分柚皮苷、新橙皮苷进行定量测定， Phenomenex C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相，梯度洗脱，检测波长254 nm，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃。结果 薄层色谱鉴别斑点清晰，专属性强，阴性对照无干扰。柚皮苷和新橙皮苷分别在0.56～5.60 μg（r=0.999 9）、0.38～3.80 μg（r=0.999 8）范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为99.86%（RSD=2.04%）、98.95%（RSD=2.45%）。结论 本研究建立的定性定量检测方法操作简便、准确可靠、专属性强、重复性好，可作为金茵利胆口服液的质量控制方法。
关键词：金茵利胆口服液；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）06-0087-04
金茵利胆口服液是兰州市第二人民医院的院内制剂（甘药制字Z04010906），由茵陈、金钱草、蒲公英、黄连、枳壳、五味子等18味中药提取加工而成，具有疏肝利胆、清热解毒、行气化瘀、理气活血、利胆排石之功。该方在本院用于治疗慢性肝炎、胆道感染、胆道结石、胆囊炎、黄疸等，在临床使用已有20余年。为有效控制金茵利胆口服液的质量，确保临床用药安全有效，本研究采用薄层色谱法（TLC）对处方中茵陈、蒲公英、枳壳和五味子进行定性鉴别，采用高效液相色谱法（HPLC）对其有效成分柚皮苷、新橙皮苷进行定量测定，并依此建立可靠、准确稳定、专属性强的质量控制方法。
1 仪器与试药
Agilent 1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；FA2004N型电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司；恒温水浴锅，江苏省金坛市环宇科学仪器厂，型号HH-8；超声波提取器，济宁天华超声电子仪器有限公司，型号TH-100BQ。
对照品柚皮苷（批号110722-201111）、新橙皮苷（批号111857-201102）、五味子甲素（批号110764- 201111），对照药材茵陈（批号121555-201101）、蒲公英（批号121195-200902）、枳壳（批号120981- 201104）、五味子（批号120922-201309），中国食品药品检定研究院；金茵利胆口服液（批号130807、130904、131011）及缺茵陈、缺蒲公英、缺枳壳和缺五味子阴性对照样品，兰州市第二人民医院制剂室自制；硅胶G板、GF254板，青岛海洋化工厂；甲醇（色谱纯），深圳西陇化工股份有限公司；磷酸（色谱纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；双蒸水（自制），其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 定性鉴别
2.1.1 茵陈 取本品30 mL，用三氯甲烷振摇提取3次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。取茵陈对照药材1 g，加水40 mL，煎煮30 min，过滤，滤液同法制成茵陈对照药材溶液。取缺茵陈的金茵利胆口服液样品30 mL，按供试品溶液制备方法制备，作为茵陈阴性对照溶液。按薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B]试验，分别吸取上述3种溶液各5 μL，于同一硅胶G薄层板上点样，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-丙酮（6∶3∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，与对照药材色谱相应的位置上，显相同蓝色荧光斑点，且阴性对照无干扰。
2.1.2 蒲公英 取本品30 mL，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次60 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取蒲公英对照药材1 g，加水50 mL，煎煮1 h，过滤，滤液浓缩至30 mL，同法制成蒲公英对照药材溶液。另取缺蒲公英的金茵利胆口服液样品30 mL，按供试品溶液制备方法制备，作为蒲公英阴性对照溶液。按薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B]试验，分别吸取上述3种溶液各8 ?L，于同一硅胶G薄层板上点样，以氯仿-乙酸乙酯-甲酸（9∶6∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，与对照药材色谱相应的位置上，显相同蓝色荧光斑点，阴性对照无干扰。
2.1.3 枳壳 取本品30 mL，加甲醇60 mL，加热回流1 h，放冷，过滤，滤液浓缩至5 mL，作为供试品溶液。取枳壳对照药材1 g，加水50 mL煎煮1 h，过滤，滤液浓缩至30 mL，同法制成枳壳对照药材溶液。取缺枳壳的金茵利胆口服液样品30 mL，按供试品溶液制备方法制备，作为枳壳阴性对照溶液。按薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B]试验，分别吸取上述3种溶液各5 ?L，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（4∶2∶0.15∶5）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，与对照药材色谱相应的位置上，显相同蓝色荧光斑点，阴性对照无干扰。
2.1.4 五味子 取本品30 mL，加甲醇90 mL，加热回流1 h，过滤，滤液蒸干，加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取五味子对照药材1 g，加水60 mL，煎煮1 h， 过滤，滤液浓缩至30 mL，同法制成五味子对照药材溶液。另取五味子甲素，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。另取缺五味子的金茵利胆口服液样品30 mL，按供试品溶液制备方法制备，作为五味子阴性对照溶液。按薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B]试验，分别吸取上述4种溶液各6 ?L，于同一硅胶GF254薄层板上点样，以石油醚（30～60 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应位置上，显相同蓝黑色荧光斑点，且阴性对照无干扰。 2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex C18柱（5 μm， 4.6 mm×250 mm）；以甲醇为流动相B，0.1%磷酸水溶液为流动相A，梯度洗脱（0～35 min，20%→35%B；35～60 min，35%→80%B）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：25 ℃[6]；进样量：20 μL。
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取五氧化二磷真空干燥12 h的柚皮苷和新橙皮苷对照品适量，置棕色容量瓶中，加甲醇配制成浓度分别为柚皮苷280 μg/mL、新橙皮苷190 μg/mL的混合对照品储备液，置于4 ℃避光保存备用。
2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取本品1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）15 min，放冷，加甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得[7]。
2.2.4 阴性对照溶液的制备 取缺枳壳的阴性对照样品，按“2.2.3”项下方法制备，即得。
2.2.5 专属性试验 分别精密吸取柚皮苷和新橙皮苷混合对照品储备液、供试品溶液和阴性对照溶液各20 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，色谱图见图1。结果显示，柚皮苷、新橙皮苷色谱分离良好，阴性对照无干扰[7-8]。
2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.2”项下混合对照品储备液2、4、6、10、20 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。以进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：柚皮苷Y=163 492X+4625.2，r=0.999 9；新橙皮苷Y=117 867X+8035.9，r=0.999 8。结果表明，柚皮苷和新橙皮苷分别在0.56～5.60 μg、0.38～3.80 μg范围内线性关系良好。
2.2.7 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下混合对照品储备液各20 μL，重复连续进样6次，柚皮苷和新橙皮苷的色谱峰峰面积RSD分别为1.81%、1.77%，结果表明仪器精密度良好。
2.2.8 稳定性试验 精密吸取同一金茵利胆口服液供试品（批号130807）溶液，分别于配制后0、4、8、12、24 h，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，柚皮苷和新橙皮苷色谱峰峰面积RSD分别为2.74%、2.16%，结果表明在室温条件下该供试品溶液24 h内稳定性良好。
2.2.9 重复性试验 取6份同一批号（批号130807）样品，按“2.2.3”项下方法制备，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，柚皮苷和新橙皮苷色谱峰峰面积RSD分别为2.17%、2.59%，结果表明该方法重复性良好。
2.2.10 加样回收率试验 精密量取已知含量的本品（批号130807）9份，每3份1组，每份1 mL，每组中加入一定量的柚皮苷和新橙皮苷混合对照品储备液，按“2.2.3“项下方法制成低、中、高3个浓度的样品溶液，分别精密吸取20 μL，注入高效液相色谱仪，以外标法测定柚皮苷和新橙皮苷含量[9]，结果见表1、表2。
2.2.11 样品含量测定 按“2.2.3”项下制备方法及“2.2.1”项下色谱条件，分别测定3批金茵利胆口服液样品中柚皮苷和新橙皮苷的含量，结果见表3。
3 讨论
本试验参考文献[1-5]，经多次试验，优化筛选展开剂、显色剂等检测条件，对金茵利胆口服液中茵陈、蒲公英、枳壳、五味子进行了薄层色谱鉴别。结果表明，所建立的薄层鉴别方法分离度好，专属性强，阴性对照无干扰。
本试验建立了同时测定金茵利胆口服液中柚皮苷和新橙皮苷含量的HPLC方法，该方法能将混合对照品及样品中的2种有效成分良好分离。根据相关文献[10-13]，考察比较了甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸及甲醇-磷酸不同浓度作为流动相的分离效果。当以甲醇-水为流动相时，柚皮苷和新橙皮苷色谱峰峰形宽钝；以乙腈-水、乙腈-磷酸为流动相时，二者的色谱峰较低，分离度差；以甲醇-0.1%磷酸水体系为流动相时，二者的色谱峰峰形良好，分离度高，无杂质干扰，故选择以甲醇-0.1%磷酸水为流动相。对柚皮苷、新橙皮苷进行全波长扫描后，发现在254 nm测定时，色谱峰峰形分离度良好。试验中还比较了Phenomenex 250 mm C18柱（菲罗门公司）和150 mm C18柱（岛津公司）对2种成分的分离效果，在既定的色谱条件下，发现用250 mm C18柱时，柚皮苷和新橙皮苷的分离效果及峰形较好，故选用Phenomenex 250 mm C18柱。
结果表明，所建立的金茵利胆口服液TLC定性鉴别和柚皮苷及新橙皮苷的HPLC含量测定方法操作简便，重复性好，专属性强，可用于该制剂的质量控制。
参考文献：
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[8] 张金莲，何敏，谢一辉，等.高效液相色谱法测定枳壳饮片中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（6）：68-70.
[9] 黄爱华，曹驰，曾元儿，等.HPLC法测定不同规格酸橙枳实中新橙皮苷和柚皮苷的含量[J].药物分析杂志，2009，29（9）：1448-1450.
[10] 郭琦丽，吕武青，曾莉萍，等.HPLC测定陈皮-枳壳药对提取物中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（20）：100-103.
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[12] 丁桂兰，薛亚光，邢春来，等.HPLC测定橘红丸中柚皮苷、橙皮苷的含量[J].中成药，2004，26（9）：707-710.
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（收稿日期：2014-10-29）
（修回日期：2014-11-18；编辑：陈静）
关键词：金茵利胆口服液；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）06-0087-04
金茵利胆口服液是兰州市第二人民医院的院内制剂（甘药制字Z04010906），由茵陈、金钱草、蒲公英、黄连、枳壳、五味子等18味中药提取加工而成，具有疏肝利胆、清热解毒、行气化瘀、理气活血、利胆排石之功。该方在本院用于治疗慢性肝炎、胆道感染、胆道结石、胆囊炎、黄疸等，在临床使用已有20余年。为有效控制金茵利胆口服液的质量，确保临床用药安全有效，本研究采用薄层色谱法（TLC）对处方中茵陈、蒲公英、枳壳和五味子进行定性鉴别，采用高效液相色谱法（HPLC）对其有效成分柚皮苷、新橙皮苷进行定量测定，并依此建立可靠、准确稳定、专属性强的质量控制方法。
1 仪器与试药
Agilent 1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；FA2004N型电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司；恒温水浴锅，江苏省金坛市环宇科学仪器厂，型号HH-8；超声波提取器，济宁天华超声电子仪器有限公司，型号TH-100BQ。
对照品柚皮苷（批号110722-201111）、新橙皮苷（批号111857-201102）、五味子甲素（批号110764- 201111），对照药材茵陈（批号121555-201101）、蒲公英（批号121195-200902）、枳壳（批号120981- 201104）、五味子（批号120922-201309），中国食品药品检定研究院；金茵利胆口服液（批号130807、130904、131011）及缺茵陈、缺蒲公英、缺枳壳和缺五味子阴性对照样品，兰州市第二人民医院制剂室自制；硅胶G板、GF254板，青岛海洋化工厂；甲醇（色谱纯），深圳西陇化工股份有限公司；磷酸（色谱纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；双蒸水（自制），其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 定性鉴别
2.1.1 茵陈 取本品30 mL，用三氯甲烷振摇提取3次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。取茵陈对照药材1 g，加水40 mL，煎煮30 min，过滤，滤液同法制成茵陈对照药材溶液。取缺茵陈的金茵利胆口服液样品30 mL，按供试品溶液制备方法制备，作为茵陈阴性对照溶液。按薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B]试验，分别吸取上述3种溶液各5 μL，于同一硅胶G薄层板上点样，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-丙酮（6∶3∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，与对照药材色谱相应的位置上，显相同蓝色荧光斑点，且阴性对照无干扰。
2.1.2 蒲公英 取本品30 mL，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次60 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取蒲公英对照药材1 g，加水50 mL，煎煮1 h，过滤，滤液浓缩至30 mL，同法制成蒲公英对照药材溶液。另取缺蒲公英的金茵利胆口服液样品30 mL，按供试品溶液制备方法制备，作为蒲公英阴性对照溶液。按薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B]试验，分别吸取上述3种溶液各8 ?L，于同一硅胶G薄层板上点样，以氯仿-乙酸乙酯-甲酸（9∶6∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，与对照药材色谱相应的位置上，显相同蓝色荧光斑点，阴性对照无干扰。
2.1.3 枳壳 取本品30 mL，加甲醇60 mL，加热回流1 h，放冷，过滤，滤液浓缩至5 mL，作为供试品溶液。取枳壳对照药材1 g，加水50 mL煎煮1 h，过滤，滤液浓缩至30 mL，同法制成枳壳对照药材溶液。取缺枳壳的金茵利胆口服液样品30 mL，按供试品溶液制备方法制备，作为枳壳阴性对照溶液。按薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B]试验，分别吸取上述3种溶液各5 ?L，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（4∶2∶0.15∶5）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，与对照药材色谱相应的位置上，显相同蓝色荧光斑点，阴性对照无干扰。
2.1.4 五味子 取本品30 mL，加甲醇90 mL，加热回流1 h，过滤，滤液蒸干，加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取五味子对照药材1 g，加水60 mL，煎煮1 h， 过滤，滤液浓缩至30 mL，同法制成五味子对照药材溶液。另取五味子甲素，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。另取缺五味子的金茵利胆口服液样品30 mL，按供试品溶液制备方法制备，作为五味子阴性对照溶液。按薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B]试验，分别吸取上述4种溶液各6 ?L，于同一硅胶GF254薄层板上点样，以石油醚（30～60 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应位置上，显相同蓝黑色荧光斑点，且阴性对照无干扰。 2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex C18柱（5 μm， 4.6 mm×250 mm）；以甲醇为流动相B，0.1%磷酸水溶液为流动相A，梯度洗脱（0～35 min，20%→35%B；35～60 min，35%→80%B）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：25 ℃[6]；进样量：20 μL。
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取五氧化二磷真空干燥12 h的柚皮苷和新橙皮苷对照品适量，置棕色容量瓶中，加甲醇配制成浓度分别为柚皮苷280 μg/mL、新橙皮苷190 μg/mL的混合对照品储备液，置于4 ℃避光保存备用。
2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取本品1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）15 min，放冷，加甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得[7]。
2.2.4 阴性对照溶液的制备 取缺枳壳的阴性对照样品，按“2.2.3”项下方法制备，即得。
2.2.5 专属性试验 分别精密吸取柚皮苷和新橙皮苷混合对照品储备液、供试品溶液和阴性对照溶液各20 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，色谱图见图1。结果显示，柚皮苷、新橙皮苷色谱分离良好，阴性对照无干扰[7-8]。
2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.2”项下混合对照品储备液2、4、6、10、20 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。以进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：柚皮苷Y=163 492X+4625.2，r=0.999 9；新橙皮苷Y=117 867X+8035.9，r=0.999 8。结果表明，柚皮苷和新橙皮苷分别在0.56～5.60 μg、0.38～3.80 μg范围内线性关系良好。
2.2.7 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下混合对照品储备液各20 μL，重复连续进样6次，柚皮苷和新橙皮苷的色谱峰峰面积RSD分别为1.81%、1.77%，结果表明仪器精密度良好。
2.2.8 稳定性试验 精密吸取同一金茵利胆口服液供试品（批号130807）溶液，分别于配制后0、4、8、12、24 h，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，柚皮苷和新橙皮苷色谱峰峰面积RSD分别为2.74%、2.16%，结果表明在室温条件下该供试品溶液24 h内稳定性良好。
2.2.9 重复性试验 取6份同一批号（批号130807）样品，按“2.2.3”项下方法制备，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，柚皮苷和新橙皮苷色谱峰峰面积RSD分别为2.17%、2.59%，结果表明该方法重复性良好。
2.2.10 加样回收率试验 精密量取已知含量的本品（批号130807）9份，每3份1组，每份1 mL，每组中加入一定量的柚皮苷和新橙皮苷混合对照品储备液，按“2.2.3“项下方法制成低、中、高3个浓度的样品溶液，分别精密吸取20 μL，注入高效液相色谱仪，以外标法测定柚皮苷和新橙皮苷含量[9]，结果见表1、表2。
2.2.11 样品含量测定 按“2.2.3”项下制备方法及“2.2.1”项下色谱条件，分别测定3批金茵利胆口服液样品中柚皮苷和新橙皮苷的含量，结果见表3。
3 讨论
本试验参考文献[1-5]，经多次试验，优化筛选展开剂、显色剂等检测条件，对金茵利胆口服液中茵陈、蒲公英、枳壳、五味子进行了薄层色谱鉴别。结果表明，所建立的薄层鉴别方法分离度好，专属性强，阴性对照无干扰。
本试验建立了同时测定金茵利胆口服液中柚皮苷和新橙皮苷含量的HPLC方法，该方法能将混合对照品及样品中的2种有效成分良好分离。根据相关文献[10-13]，考察比较了甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸及甲醇-磷酸不同浓度作为流动相的分离效果。当以甲醇-水为流动相时，柚皮苷和新橙皮苷色谱峰峰形宽钝；以乙腈-水、乙腈-磷酸为流动相时，二者的色谱峰较低，分离度差；以甲醇-0.1%磷酸水体系为流动相时，二者的色谱峰峰形良好，分离度高，无杂质干扰，故选择以甲醇-0.1%磷酸水为流动相。对柚皮苷、新橙皮苷进行全波长扫描后，发现在254 nm测定时，色谱峰峰形分离度良好。试验中还比较了Phenomenex 250 mm C18柱（菲罗门公司）和150 mm C18柱（岛津公司）对2种成分的分离效果，在既定的色谱条件下，发现用250 mm C18柱时，柚皮苷和新橙皮苷的分离效果及峰形较好，故选用Phenomenex 250 mm C18柱。
结果表明，所建立的金茵利胆口服液TLC定性鉴别和柚皮苷及新橙皮苷的HPLC含量测定方法操作简便，重复性好，专属性强，可用于该制剂的质量控制。
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（收稿日期：2014-10-29）
（修回日期：2014-11-18；编辑：陈静）