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【摘要】 目的探讨一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)的水平与急性一氧化碳中毒患者病情的关系,寻找表达急性一氧化碳中毒(ACMP)患者病情变化的理想生物学标志。方法 应用比色法(colorimetric method)测定40例ACMP患者血清NO及NOS水平,并与38例正常对照进行比较。 结果 ACMP组患者血清NO及NOS水平明显高于正常对照组(P<0.05)。 结论 NO-NOS系统水平异常在ACMP引起的缺血缺氧性疾病发生中起重要作用。
【关键词】 一氧化碳中毒;一氧化氮;一氧化氮合酶
The serum NO and NOS levels and its clinical significance of patients with acute carbon monoxide poisoning
GUOZhi-yong,GUXin,WANG Hai-he.Department of Neurology,the First People’sHospital of Xinxiang City,Henan,Xinxiang 453002,China
【Abstract】 Objective Exploring the relationship between the nitric oxide (NO) and nitric oxide synthase (NOS) levels and the patients with acute carbon monoxide poisoning,to find an ideal biological marker which can express the changes in patients with acute carbon monoxide poisoning. Methods Measured the levels of serum NO and NOSbetween40 cases of acute carbon monoxide poisoning and 38 normal controls by using colorimetric method.Results The serum NO and NOS levels in patients with acute carbon monoxide poisoning were significantly higher than the normal controls(P<0.05).Conclusion The anomaly of NO-NOS system levels played an important role in hypoxic-ischemic diseases which caused by the acute carbon monoxide poisoning.
【Key words】 Carbon monoxide poisoning;Nitric oxide;Nitric oxide synthase
河南省新乡市第一人民医院神经内科(郭志勇 王海合);新乡医学院第二附属医院(顾欣)
急性一氧化碳中毒(acute carbon monoxide poisoning,ACMP)是临床上较为常见的中毒疾病之一,由于脑组织缺氧引起脑损伤,严重者可引起脑功能障碍,部分患者可以引起迟发性脑病,是目前临床上一个非常棘手的问题[1]。ACMP的实质是缺氧,其毒性效应受到广泛注意已有百余年历史,但一氧化碳中毒致脑损伤的机制迄今未明[2]。既往认为与自由基损伤关系密切,但随着ACMP致脑损伤机制的不断深入研究,已有大量动物试验表明一氧化氮(NO)与缺氧性疾病关系密切。这些研究发现NO 产生和释放过多均具有神经毒性[3]。但动物实验中ACMP时NO、NOS 的变化报告仍有争议,王燕等[4]报道一氧化碳中毒后大鼠小脑组织中NO明显增高,NOS活性明显降低;Lopez IA等[5]发现大鼠小脑iNOS上升明显;Harry等[6]报告一氧化碳中毒大鼠血浆NO 增高;而王耀宏[7]等发现在一氧化碳中毒大鼠颈静脉(脑循环) 血液中NO在一过性迅速升高后急剧下降,并持续维持低水平,NOS 的活性始终处于抑制状态,甚至连与NO 相对应的一过性增高过程也没有。目前对人类研究仅局限在单一血浆NO水平,其结果亦有矛盾[8-10],对NOS活性研究甚少。本文拟针对ACMP患者组和健康人对照组中血清NO及NOS水平进行联合检测分析,以探讨ACMP患者NO-NOS整体系统水平变化及其临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 (1)急性一氧化碳中毒组:诊断标准:①有明确的吸入较高浓度一氧化碳的接触史;②急性发生的中枢神经系统损害的症状和体征;③及时测定的COHb浓度>5%;④符合国家诊断标准(GB8781-88)。入组标准:①所有患者均符合急性一氧化碳中毒诊断标准;②急性中毒时均有昏迷史;③经抢救后均达痊愈;④痊愈后随访时间≥90 d,未发生急性一氧化碳中毒后迟发性脑病。40例患者均为新乡市第一人民医院神经内科2007年11月至2009年4月住院或急诊科留观患者,其中男19例,女21例;年龄40～80岁,平均(57.1±8.9)岁;文化程度:文盲12例,小学15例,中学以上13例。(2)正常对照组:选择同期新乡市第一人民医院门诊健康体检者,筛选去掉不符合的资料,最终38例入组,其中男性21例,女性17例;年龄40～83岁,平均(58.9±7.1)岁。文化程度:文盲11例,小学14例,中学以上13例。上述两组排除标准:①严重的心、脑、肝、肾疾病或功能不全,严重的糖尿病、内分泌疾病、免疫系统疾病、恶性肿瘤、营养不良、酒精依赖及其他精神疾患; ②有过敏史及激素治疗史,接受过免疫抑制剂,近半年内接受过预防接种;③妊娠、哺乳及月经期妇女;④近两周内有感染史;⑤血常规、肝功能、肾功能等实验室检查有重大异常。
1.2 急性一氧化碳中毒组与正常对照组一般资料的对比分析。
1.2.1 性别和年龄 从表1可以看出,两组研究对象之间在性别和年龄方面无显著性差异(P>0.05),表明两组一般资料齐同,具有良好的可比性。
表1
两组的性别和年龄(x±s)比较
组别例数性别
男女年龄(岁)
ACMP组 4019 21 57.1±8.9
正常对照组 38 21 17 58.9±7.1
注:两组性别比较,经 χ2检验,均P>0.05;两组年龄比较,经t检验,均P>0.05
1.2.2 文化程度 从表2可以看出,两组研究对象之间在文化程度方面无显著性差异(P>0.05),表明两组一般资料齐同,具有良好的可比性。
表2
两组的文化程度比较(例)
组别例数文盲小学中学以上
ACMP 组 4012 1513
正常对照组 3811 1413
注:两组文化程度两两比较,经 χ2检验,均P>0.05
1.3 研究方法
1.3.1 血标本采集时间 急性一氧化碳中毒患者于抢救成功完全清醒后进行,正常对照组于健康体检当天进行。
1.3.2 试剂来源与仪器 NO测试盒(酶法测NO2-+NO3-)和NOS测试盒[ 测总NOS(T-NOS)](南京建成生物工程研究所生产)。检测仪器为Tu-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。
1.3.3 标本采集和制备 所有研究对象均于早晨8～10时采集空腹肘静脉血,留取5 ml血液置于37℃电热恒温水浴箱中热浴30 min,取出于自动平衡离心机上处理(4000r/min,5 min),弃溶血标本,然后留取血清2～3 ml,立即置于-70℃低温冰箱中保存,以做NO和NOS的测定。
1.3.4 检测方法 两组均应用比色法测定血清NO和NOS浓度。
1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件分析,数据用(x±s)表示,所有数据均进行正态性检验和方差齐性检验,组间比较采用t检验。
2 结果
急性一氧化碳中毒组、正常对照组血清NO及NOS水平对照分析见表3。急性一氧化碳中毒组血清NO水平明显高于正常对照组(P<0.05);急性一氧化碳中毒组血清NOS水平明显高于正常对照组(P<0.05)。
表3
急性一氧化碳中毒组、正常对照组血清NO及NOS水平对照分析(x±s)
组别例 数 NO(μmol/l)NOS(U/ml)
ACMP 组4063.19±14.98△ 31.22±6.47△
正常对照组 3849.21±10.3419.76±7.59
注:t检验,△为与正常对照组比较,P<0.05
3 讨论
一氧化氮(NO)是一种自由基性质的气体,同时也是生物体内重要的信使分子和效应分子,NO作为氧自由基、非经典神经递质、细胞功能调节因子和信使,在神经系统正常功能和疾病发生发展中的起作用。一氧化氮合酶(NOS)是催化合成一氧化氮(NO)的关键酶,有三种亚型[11],分别称为神经元型NOS(nNOS)、诱导型NOS(iNOS)和内皮型NOS(eNOS),eNOS和nNOS合称为结构型NOS(cNOS)。cNOS的活性为钙及钙调蛋白依赖性,受细胞内Ca2+浓度生理性调节。在生理状态下cNOS催化合成少量的NO,以细胞间信息传递为主;在病理状态下,cNOS可被细胞内增高的Ca2+进一步激活,表达短暂性增高,催化合成大量的NO,但激活后的cNOS合成NO的时间短。iNOS是钙及钙调蛋白非依赖性酶,主要受一些细胞因子的诱导而激活,在正常生理条件下,各组织细胞的iNOS活性可忽略不计。该酶一旦被激活,则可大量持续地产生NO。
本文结果表明:急性一氧化碳中毒组血清NO及 NOS水平明显高于正常对照组(P<0.05)。此结果与以往部分动物实验结果亦基本相同[5,12,13],说明NO-NOS系统在本病神经损伤过程中起一定的作用。推测为急性一氧化碳中毒后,一氧化碳易与血红素含铁基团结合,抑制氧与血红蛋白的结合,造成全身组织严重缺氧。由于脑对缺氧十分敏感,因此急性一氧化碳中毒使脑组织和神经元发生严重的缺氧缺血性损伤,并导致中枢神经系统功能障碍,其机制可能是缺氧造成能量代谢障碍,三磷酸腺苷生成减少,引起脑细胞内大量钙离子内流激活NOS活性,从而破坏NO-NOS系统的动态平衡,导致NO产生增多。Lee HM等[14]通过芯片分析也证实吸入一氧化碳大鼠模型大脑中NOS及其配体显著增加。NO-NOS系统在神经系统各种病理生理过程中起重要作用,特别是脑的缺血缺氧性疾病。NO-NOS系统失平衡会进一步加重组织缺血缺氧和激发脑内炎性反应,产生一系列免疫反应,对脑内蛋白质和类脂产生抗原抗体反应,从而导致脑白质脱髓鞘变化。可见,进一步研究急性一氧化碳中毒患者血清NO及NOS水平不同时间点的动态变化,可使急性一氧化碳中毒分子机制的研究进入一个全新的领域,此探索可能具有重要的理论价值和实际意义,值得进一步追踪拓展。
参考文献
[1] 李湘民,刘郁.急性一氧化碳中毒大鼠血中内皮素与肿瘤坏死因子的变化及维拉帕米的作用.中华急诊医学杂志,2002,11(4):224.
[2] 何凤生.一氧化碳中毒研究动态.工业卫生与职业病,1984,10:259.
[3] 白欣立.一氧化氮在神经系统中的作用.医学综述,1996,2:655.
[4] 王燕,刘郁.急性一氧化碳中毒大鼠小脑组织一氧化氮及一氧化氮合酶活性的变化.急诊医学杂志,2000,9(3):158.
[5] Lopez IA,Acuna D,Beltran-Parrazal L,et al. Evidence for oxidative stress in the developing cerebellum of the rat after chronic mild carbon monoxide exposure (0.0025% in air). BMCNeurosci,2009,10:53.
[6] Harry I,Michnel FB,Tsuyoschi S,et al.Nitric oxide product and perivascular tyrosine nitration in brain after carbon monoxide poisoning in the rat.J clin Invest,1996,97(10): 2260.
[7] 王耀宏,赵金垣,崔书杰,等.外源性一氧化碳对大鼠脑内源性气体信使系统的影响.中国工业医学杂志,2003,16(5):261.
[8] 郭健,贺少枫,陈伟.高压氧对急性一氧化碳中毒患者血浆一氧化氮、内皮素-1 含量的影响.中华航海医学与高气压医学杂志,2004,11(1):8.
[9] 王伯良,仲月霞,曹义战,等.纳洛酮对急性一氧化碳中毒患者血浆一氧化氮、内皮素含量的影响.中华急诊医学杂志,2005,14(10):853.
[10] 马玉玲,李士玉,王琳.一氧化碳中毒血浆一氧化氮及氧自由基含量与病情关系的探讨.济宁医学院学报,2003,26(1):24.
[11] Dzielski T,Wierzbicka-Chmiel J,Chmiel A. Acute myocardial ischemia after carbon monoxide exposure: a case report. Pol Merkur Lekarski,2006,120(20):696.
[12] Hara S,Mukai T,Kurosaki K,et al.Role of nitric oxide system in hydroxyl radical generation in rat striatum due to carbon monoxide poisoning,as determined by microdialysis. Toxicology,2007,239(1-2):136.
[13] Castoldi AF,Coccini T,Randine G,et al. Lymphocyte cytochrome coxidase,cyclic GMP and cholinergic muscarinic receptors as peripheral indicators of carbon monoxide neurotoxicity after acute and repeated exposure in the rat. Life Sci,2006,78(17):1915.
[14] Lee HM,Greeley GH,Herndon DN,et al. A rat model of smoke inhalation injury: influence of combustion smoke on gene expression in the brain.Toxicol Appl Pharmacol,2005,208(3):255.
【关键词】 一氧化碳中毒;一氧化氮;一氧化氮合酶
The serum NO and NOS levels and its clinical significance of patients with acute carbon monoxide poisoning
GUOZhi-yong,GUXin,WANG Hai-he.Department of Neurology,the First People’sHospital of Xinxiang City,Henan,Xinxiang 453002,China
【Abstract】 Objective Exploring the relationship between the nitric oxide (NO) and nitric oxide synthase (NOS) levels and the patients with acute carbon monoxide poisoning,to find an ideal biological marker which can express the changes in patients with acute carbon monoxide poisoning. Methods Measured the levels of serum NO and NOSbetween40 cases of acute carbon monoxide poisoning and 38 normal controls by using colorimetric method.Results The serum NO and NOS levels in patients with acute carbon monoxide poisoning were significantly higher than the normal controls(P<0.05).Conclusion The anomaly of NO-NOS system levels played an important role in hypoxic-ischemic diseases which caused by the acute carbon monoxide poisoning.
【Key words】 Carbon monoxide poisoning;Nitric oxide;Nitric oxide synthase
河南省新乡市第一人民医院神经内科(郭志勇 王海合);新乡医学院第二附属医院(顾欣)
急性一氧化碳中毒(acute carbon monoxide poisoning,ACMP)是临床上较为常见的中毒疾病之一,由于脑组织缺氧引起脑损伤,严重者可引起脑功能障碍,部分患者可以引起迟发性脑病,是目前临床上一个非常棘手的问题[1]。ACMP的实质是缺氧,其毒性效应受到广泛注意已有百余年历史,但一氧化碳中毒致脑损伤的机制迄今未明[2]。既往认为与自由基损伤关系密切,但随着ACMP致脑损伤机制的不断深入研究,已有大量动物试验表明一氧化氮(NO)与缺氧性疾病关系密切。这些研究发现NO 产生和释放过多均具有神经毒性[3]。但动物实验中ACMP时NO、NOS 的变化报告仍有争议,王燕等[4]报道一氧化碳中毒后大鼠小脑组织中NO明显增高,NOS活性明显降低;Lopez IA等[5]发现大鼠小脑iNOS上升明显;Harry等[6]报告一氧化碳中毒大鼠血浆NO 增高;而王耀宏[7]等发现在一氧化碳中毒大鼠颈静脉(脑循环) 血液中NO在一过性迅速升高后急剧下降,并持续维持低水平,NOS 的活性始终处于抑制状态,甚至连与NO 相对应的一过性增高过程也没有。目前对人类研究仅局限在单一血浆NO水平,其结果亦有矛盾[8-10],对NOS活性研究甚少。本文拟针对ACMP患者组和健康人对照组中血清NO及NOS水平进行联合检测分析,以探讨ACMP患者NO-NOS整体系统水平变化及其临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 (1)急性一氧化碳中毒组:诊断标准:①有明确的吸入较高浓度一氧化碳的接触史;②急性发生的中枢神经系统损害的症状和体征;③及时测定的COHb浓度>5%;④符合国家诊断标准(GB8781-88)。入组标准:①所有患者均符合急性一氧化碳中毒诊断标准;②急性中毒时均有昏迷史;③经抢救后均达痊愈;④痊愈后随访时间≥90 d,未发生急性一氧化碳中毒后迟发性脑病。40例患者均为新乡市第一人民医院神经内科2007年11月至2009年4月住院或急诊科留观患者,其中男19例,女21例;年龄40～80岁,平均(57.1±8.9)岁;文化程度:文盲12例,小学15例,中学以上13例。(2)正常对照组:选择同期新乡市第一人民医院门诊健康体检者,筛选去掉不符合的资料,最终38例入组,其中男性21例,女性17例;年龄40～83岁,平均(58.9±7.1)岁。文化程度:文盲11例,小学14例,中学以上13例。上述两组排除标准:①严重的心、脑、肝、肾疾病或功能不全,严重的糖尿病、内分泌疾病、免疫系统疾病、恶性肿瘤、营养不良、酒精依赖及其他精神疾患; ②有过敏史及激素治疗史,接受过免疫抑制剂,近半年内接受过预防接种;③妊娠、哺乳及月经期妇女;④近两周内有感染史;⑤血常规、肝功能、肾功能等实验室检查有重大异常。
1.2 急性一氧化碳中毒组与正常对照组一般资料的对比分析。
1.2.1 性别和年龄 从表1可以看出,两组研究对象之间在性别和年龄方面无显著性差异(P>0.05),表明两组一般资料齐同,具有良好的可比性。
表1
两组的性别和年龄(x±s)比较
组别例数性别
男女年龄(岁)
ACMP组 4019 21 57.1±8.9
正常对照组 38 21 17 58.9±7.1
注:两组性别比较,经 χ2检验,均P>0.05;两组年龄比较,经t检验,均P>0.05
1.2.2 文化程度 从表2可以看出,两组研究对象之间在文化程度方面无显著性差异(P>0.05),表明两组一般资料齐同,具有良好的可比性。
表2
两组的文化程度比较(例)
组别例数文盲小学中学以上
ACMP 组 4012 1513
正常对照组 3811 1413
注:两组文化程度两两比较,经 χ2检验,均P>0.05
1.3 研究方法
1.3.1 血标本采集时间 急性一氧化碳中毒患者于抢救成功完全清醒后进行,正常对照组于健康体检当天进行。
1.3.2 试剂来源与仪器 NO测试盒(酶法测NO2-+NO3-)和NOS测试盒[ 测总NOS(T-NOS)](南京建成生物工程研究所生产)。检测仪器为Tu-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。
1.3.3 标本采集和制备 所有研究对象均于早晨8～10时采集空腹肘静脉血,留取5 ml血液置于37℃电热恒温水浴箱中热浴30 min,取出于自动平衡离心机上处理(4000r/min,5 min),弃溶血标本,然后留取血清2～3 ml,立即置于-70℃低温冰箱中保存,以做NO和NOS的测定。
1.3.4 检测方法 两组均应用比色法测定血清NO和NOS浓度。
1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件分析,数据用(x±s)表示,所有数据均进行正态性检验和方差齐性检验,组间比较采用t检验。
2 结果
急性一氧化碳中毒组、正常对照组血清NO及NOS水平对照分析见表3。急性一氧化碳中毒组血清NO水平明显高于正常对照组(P<0.05);急性一氧化碳中毒组血清NOS水平明显高于正常对照组(P<0.05)。
表3
急性一氧化碳中毒组、正常对照组血清NO及NOS水平对照分析(x±s)
组别例 数 NO(μmol/l)NOS(U/ml)
ACMP 组4063.19±14.98△ 31.22±6.47△
正常对照组 3849.21±10.3419.76±7.59
注:t检验,△为与正常对照组比较,P<0.05
3 讨论
一氧化氮(NO)是一种自由基性质的气体,同时也是生物体内重要的信使分子和效应分子,NO作为氧自由基、非经典神经递质、细胞功能调节因子和信使,在神经系统正常功能和疾病发生发展中的起作用。一氧化氮合酶(NOS)是催化合成一氧化氮(NO)的关键酶,有三种亚型[11],分别称为神经元型NOS(nNOS)、诱导型NOS(iNOS)和内皮型NOS(eNOS),eNOS和nNOS合称为结构型NOS(cNOS)。cNOS的活性为钙及钙调蛋白依赖性,受细胞内Ca2+浓度生理性调节。在生理状态下cNOS催化合成少量的NO,以细胞间信息传递为主;在病理状态下,cNOS可被细胞内增高的Ca2+进一步激活,表达短暂性增高,催化合成大量的NO,但激活后的cNOS合成NO的时间短。iNOS是钙及钙调蛋白非依赖性酶,主要受一些细胞因子的诱导而激活,在正常生理条件下,各组织细胞的iNOS活性可忽略不计。该酶一旦被激活,则可大量持续地产生NO。
本文结果表明:急性一氧化碳中毒组血清NO及 NOS水平明显高于正常对照组(P<0.05)。此结果与以往部分动物实验结果亦基本相同[5,12,13],说明NO-NOS系统在本病神经损伤过程中起一定的作用。推测为急性一氧化碳中毒后,一氧化碳易与血红素含铁基团结合,抑制氧与血红蛋白的结合,造成全身组织严重缺氧。由于脑对缺氧十分敏感,因此急性一氧化碳中毒使脑组织和神经元发生严重的缺氧缺血性损伤,并导致中枢神经系统功能障碍,其机制可能是缺氧造成能量代谢障碍,三磷酸腺苷生成减少,引起脑细胞内大量钙离子内流激活NOS活性,从而破坏NO-NOS系统的动态平衡,导致NO产生增多。Lee HM等[14]通过芯片分析也证实吸入一氧化碳大鼠模型大脑中NOS及其配体显著增加。NO-NOS系统在神经系统各种病理生理过程中起重要作用,特别是脑的缺血缺氧性疾病。NO-NOS系统失平衡会进一步加重组织缺血缺氧和激发脑内炎性反应,产生一系列免疫反应,对脑内蛋白质和类脂产生抗原抗体反应,从而导致脑白质脱髓鞘变化。可见,进一步研究急性一氧化碳中毒患者血清NO及NOS水平不同时间点的动态变化,可使急性一氧化碳中毒分子机制的研究进入一个全新的领域,此探索可能具有重要的理论价值和实际意义,值得进一步追踪拓展。
参考文献
[1] 李湘民,刘郁.急性一氧化碳中毒大鼠血中内皮素与肿瘤坏死因子的变化及维拉帕米的作用.中华急诊医学杂志,2002,11(4):224.
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[5] Lopez IA,Acuna D,Beltran-Parrazal L,et al. Evidence for oxidative stress in the developing cerebellum of the rat after chronic mild carbon monoxide exposure (0.0025% in air). BMCNeurosci,2009,10:53.
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[7] 王耀宏,赵金垣,崔书杰,等.外源性一氧化碳对大鼠脑内源性气体信使系统的影响.中国工业医学杂志,2003,16(5):261.
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[9] 王伯良,仲月霞,曹义战,等.纳洛酮对急性一氧化碳中毒患者血浆一氧化氮、内皮素含量的影响.中华急诊医学杂志,2005,14(10):853.
[10] 马玉玲,李士玉,王琳.一氧化碳中毒血浆一氧化氮及氧自由基含量与病情关系的探讨.济宁医学院学报,2003,26(1):24.
[11] Dzielski T,Wierzbicka-Chmiel J,Chmiel A. Acute myocardial ischemia after carbon monoxide exposure: a case report. Pol Merkur Lekarski,2006,120(20):696.
[12] Hara S,Mukai T,Kurosaki K,et al.Role of nitric oxide system in hydroxyl radical generation in rat striatum due to carbon monoxide poisoning,as determined by microdialysis. Toxicology,2007,239(1-2):136.
[13] Castoldi AF,Coccini T,Randine G,et al. Lymphocyte cytochrome coxidase,cyclic GMP and cholinergic muscarinic receptors as peripheral indicators of carbon monoxide neurotoxicity after acute and repeated exposure in the rat. Life Sci,2006,78(17):1915.
[14] Lee HM,Greeley GH,Herndon DN,et al. A rat model of smoke inhalation injury: influence of combustion smoke on gene expression in the brain.Toxicol Appl Pharmacol,2005,208(3):255.