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摘要：从黄岛区盐碱地采集土壤样品，分离和筛选高效解磷菌，并进行鉴定，在此基础上，研究了其对盐碱地的改良作用。结果表明，从盐碱地中分离到6株解磷菌，其中PC02解磷能力最高，有效磷含量为80.3 mg/L；结合其形态特征、生理生化特性和16S rDNA基因序列及系统发育树分析，将其鉴定为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）；解磷菌PC02具有降低盐碱地pH值和提高土壤有效磷含量的作用。
关键词：盐碱地；解磷菌；巨大芽孢杆菌
中图分类号：S154.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）11-0069-04
Abstract The soil sample of saline-alkali land in Huangdao was collected to isolate and screen high phosphate-solubilizing bacteria， then the screened strain was identified and its improving effects on saline-alkali land were determined. The results showed that six phosphate-solubilizing bacterial strains were isolated， among which， PC02 had the highest phosphate-solubilizing capacity with the available phosphorus content of 80.3 mg/L. Combined with the analyses of morphological， physiological and biochemical characteristics， 16S rDNA sequence and phylogenetic tree， PC02 was identified as Bacillus megaterium. It had the functions of reducing pH value and improving available phosphorus content of saline-alkali land.
Keywords Saline-alkali land； Phosphate-solubilizing bacterium； Bacillus megaterium
土壤盐碱化是一个世界性问题。据估计，全球盐碱地每年以100万～150万 hm2的速度增长[1]。盐碱地占全球总陆地面积的10%[2]，我国是土壤盐碱化最为严重的国家之一。盐碱地治理是一项长期持久的工作，最本质的是从根本上改良盐碱地。磷是植物生长发育必需的营养元素，在农业生产中可直接影响作物产量。植物吸收的磷主要来自土壤，而盐碱地中pH较高，95%以上的磷很难被植物直接吸收利用，为无效态磷[3]。另外，作物对施入的磷肥当季利用率只有5%～10%[4]，大部分磷积累在土壤中，因此提高盐碱地中磷的利用率具有非常重要的意义。
解磷菌是一种可将土壤中难溶性磷转化为植物可以吸收利用的可溶性磷的特殊微生物功能类群[5]，在转化土壤难溶性磷和提高磷肥利用率方面具有非常重要的作用[6]。解磷菌成为研究热点。然而对解磷菌的研究多在对一些作物生长的影响上，未见对盐碱地改良效果的相关研究。本文针对盐碱地问题筛选并鉴定了一株高效解磷菌，并初步试验了其对盐碱地的改良效果，以期为盐碱地改良提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 样品来源 土样：采自青岛黄岛区盐碱地。
1.1.2 培养基 富集培养基：葡萄糖10 g，磷酸三钙 5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4 0.1 g，酵母粉 0.5 g，水1 L，pH 7.0。
初筛培养基：富集培养基中加入琼脂粉20 g。
PVK培养基：初筛培养基加入0.4%溴酚蓝（pH 6.7）6 mL。
复筛培养基：葡萄糖10 g，酵母粉 10 g，磷酸三钙 5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4 0.1 g，水1 L，pH 7.0。
发酵培养基：葡萄糖10 g，酵母粉 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4 0.1 g，MnSO4 0.02 g，水1 L，pH 7.0。
生理生化鉴定培养基：依据《常见细菌系统鉴定手册》[7]配制。
1.2 试验方法
1.2.1 解磷菌的分离和筛选 取10 g采集土样置于100 mL无菌水摇瓶中，32℃振荡30 min；取5 mL原液加到以磷酸三钙为唯一磷源的50 mL富集培养基中，32℃培养72 h；取5 mL富集液转移到另一新鲜的富集培养基中，连续转接3次。
将最后的富集液稀释105倍，取稀释的悬液0.1 mL涂布初筛培养基，32℃培养。待平板长出菌落，挑取单菌落，在另一个平板上划线纯化，多次划线后用显微镜检查菌落是否单一，直至获得纯培养物后斜面保存备用。
1.2.2 高效解磷优良菌株的筛选 将筛选到的菌株接种到PVK培养基上，32℃培养48 h，观察透明圈大小。选择透明圈较大的菌株进行下一步试验。
按照文献[8]检测有效磷含量。将筛选到的菌株接种到复筛培养基上，32℃培养4 d，12 000 r/min离心10 min，取上清液按照文献方法检测有效磷含量。
1.2.3 高效解磷优良菌株的鉴定 ① 形态学特征与生理生化特征鉴定。将筛选到的高效解磷优良菌株涂布于初筛培养基平板上，32℃培养48 h，观察细胞形态和菌落特征，部分生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》[9]。 ② 16S rDNA鉴定。基因组总DNA提取后，利用正向引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和反向引物5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′进行16S rDNA全序列扩增，PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增效果。将克隆后的样品送至华大基因进行测序。
将所得序列在NCBI上进行BLAST分析比对，并选取相关菌株，利用MEGA 5.0软件采用Neighbor Joining法构建系统进化树。
1.2.4 高效解磷优良菌株的解磷特性研究 将筛选到的高效解磷优良菌株接种到发酵培养基中，摇床培养至完全转芽孢。以黄岛区盐碱地为试验对象，将该菌株发酵液施入盐碱地，以不施发酵液的盐碱地为对照，比较pH值、有效磷含量。pH值测定采用电位测定法，有效磷含量测定同1.2.2。
2 结果与分析
2.1 高效解磷菌株的分离筛选
本研究从黄岛区盐碱地中通过富集和初筛分离到18株细菌，在PVK培养基上生长、可产生透明圈的有6株，编号分别为PA03、PB01、PB03、PC02、PC05和PF03。这6株菌能在以磷酸三钙为唯一磷源的培养基上生长，并能在PVK培养基上产生透明圈，说明这6株菌具有解磷效果。
将筛选到的6株细菌接种到复筛培养基，32℃培养4 d，所得上清液的有效磷含量如表1所示。可见，菌株PC02发酵液内有效磷含量明显高于其他菌株，因此将其作为下一步的研究菌株。
2.2 高效解磷菌株PC02的鉴定
2.2.1 形态特征 菌株PC02在初筛平板上培养48 h后，菌落呈圆形，乳白色，不透明，表面光滑，隆起，湿润，边缘整齐；杆状，有芽孢，无鞭毛，革兰氏染色阳性。
2.2.2 生理生化特性 菌株PC02的生理生化结果如表2所示。可见，该菌株与巨大芽孢杆菌的生理生化特征相同，结合形态特征，该菌株初步鉴定为巨大芽孢杆菌。
2.2.3 16S rDNA基因序列及系统发育树分析 测序得到菌株PC02的16S rDNA基因序列，1 404 bp。构建系统发育树，如图1所示，菌株PC02与巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）亲缘关系最近，确定该菌株为巨大芽孢杆菌。
2.3 高效解磷菌株PC02发酵液对盐碱地的改良作用
在PC02发酵液施入盐碱地前，对照组和试验组pH值均为8.12，有效磷含量为8 mg/kg，总磷含量0.12%。施入3个月后，对照组pH值、有效磷含量和总磷含量无明显变化，试验组pH 值7.76，有效磷含量 11 mg/kg，总磷含量0.12%。通过施入PC02发酵液，土壤pH值明显降低，总磷不变的情况下有效磷含量明显提高，可见巨大芽孢杆菌对盐碱地有一定的改良作用。
3 讨论与结论
本研究从黄岛区盐碱地中分离出6株解磷菌，通过对有效磷的定量检测，筛选到一株解磷能力强的菌株PC02。结合其形态特征、生理生化特性和16S rDNA基因序列及系统发育树分析将其鉴定为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。通过盐碱地改良试验，证明了解磷菌PC02可降低土壤pH和提高土壤有效磷含量。
本研究筛选到的解磷菌PC02解磷能力较强，但与李鸣晓[10]、李振东[11]等筛选到的菌株解磷能力还有一定差距，可以通过菌株驯化、诱变育种或培养基及发酵条件的优化来提高菌株的解磷能力。植物对有效磷的吸收利用是一个较复杂的过程，菌株转化的有效磷对植物生长的作用有待进一步研究。
参 考 文 献：
[1] Kovda V A. Loss of productive land due to salinization[J]. Ambio.， 1983， 12（2）： 9l-93.
[2] 赵明范. 世界土壤盐渍化现状及研究趋势[J]. 世界林业研究， 1994， 7（1）： 84-86.
[3] 邵宗臣， 赵美芝. 土壤中积累态磷活化动力学的研究Ⅰ.有机质的影响[J]. 土壤学报， 2002， 39（3）： 318-325.
[4] 贺梦醒， 高毅， 胡正雪， 等. 解磷菌株B25的筛选、鉴定及其解磷能力[J]. 应用生态学报， 2012， 23 （1）： 235-239.
[5] 吴鹏飞， 张冬梅， 郝丽红， 等. 解磷微生物研究现状与展望[J]. 中国农业科技导报， 2008， 10 （3）： 40-46.
[6] Mehta P， Walia A， Chauhan A， et al. Plant growth promoting traits of phosphate-solubilizing rhizobacteria isolated from apple trees in trans Himalayan region of Himachal Pradesh[J]. Arch. Microbiol.， 2013， 195 （5）： 357-369.
[7] 东秀珠， 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京： 科学出版社， 2001： 349-388.
[8] 南京农学院. 土壤农化分析[M]. 北京： 农业出版社， 1980.
[9] 布坎南， 吉本斯， 等. 伯杰细菌鉴定手册[M]. 科学出版社， 1984： 729-759.
[10]李鸣晓， 席北斗， 魏自民， 等. 耐高温解磷菌的筛选及解磷能力研究[J]. 环境科学研究， 2008， 21（3）： 165-169.
[11]李振东， 陈秀蓉， 杨成德， 等. 乳白香青内生解磷菌的筛选鉴定及解磷特性研究[J]. 草业学报， 2013， 22（6）：150-158.
关键词：盐碱地；解磷菌；巨大芽孢杆菌
中图分类号：S154.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）11-0069-04
Abstract The soil sample of saline-alkali land in Huangdao was collected to isolate and screen high phosphate-solubilizing bacteria， then the screened strain was identified and its improving effects on saline-alkali land were determined. The results showed that six phosphate-solubilizing bacterial strains were isolated， among which， PC02 had the highest phosphate-solubilizing capacity with the available phosphorus content of 80.3 mg/L. Combined with the analyses of morphological， physiological and biochemical characteristics， 16S rDNA sequence and phylogenetic tree， PC02 was identified as Bacillus megaterium. It had the functions of reducing pH value and improving available phosphorus content of saline-alkali land.
Keywords Saline-alkali land； Phosphate-solubilizing bacterium； Bacillus megaterium
土壤盐碱化是一个世界性问题。据估计，全球盐碱地每年以100万～150万 hm2的速度增长[1]。盐碱地占全球总陆地面积的10%[2]，我国是土壤盐碱化最为严重的国家之一。盐碱地治理是一项长期持久的工作，最本质的是从根本上改良盐碱地。磷是植物生长发育必需的营养元素，在农业生产中可直接影响作物产量。植物吸收的磷主要来自土壤，而盐碱地中pH较高，95%以上的磷很难被植物直接吸收利用，为无效态磷[3]。另外，作物对施入的磷肥当季利用率只有5%～10%[4]，大部分磷积累在土壤中，因此提高盐碱地中磷的利用率具有非常重要的意义。
解磷菌是一种可将土壤中难溶性磷转化为植物可以吸收利用的可溶性磷的特殊微生物功能类群[5]，在转化土壤难溶性磷和提高磷肥利用率方面具有非常重要的作用[6]。解磷菌成为研究热点。然而对解磷菌的研究多在对一些作物生长的影响上，未见对盐碱地改良效果的相关研究。本文针对盐碱地问题筛选并鉴定了一株高效解磷菌，并初步试验了其对盐碱地的改良效果，以期为盐碱地改良提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 样品来源 土样：采自青岛黄岛区盐碱地。
1.1.2 培养基 富集培养基：葡萄糖10 g，磷酸三钙 5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4 0.1 g，酵母粉 0.5 g，水1 L，pH 7.0。
初筛培养基：富集培养基中加入琼脂粉20 g。
PVK培养基：初筛培养基加入0.4%溴酚蓝（pH 6.7）6 mL。
复筛培养基：葡萄糖10 g，酵母粉 10 g，磷酸三钙 5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4 0.1 g，水1 L，pH 7.0。
发酵培养基：葡萄糖10 g，酵母粉 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4 0.1 g，MnSO4 0.02 g，水1 L，pH 7.0。
生理生化鉴定培养基：依据《常见细菌系统鉴定手册》[7]配制。
1.2 试验方法
1.2.1 解磷菌的分离和筛选 取10 g采集土样置于100 mL无菌水摇瓶中，32℃振荡30 min；取5 mL原液加到以磷酸三钙为唯一磷源的50 mL富集培养基中，32℃培养72 h；取5 mL富集液转移到另一新鲜的富集培养基中，连续转接3次。
将最后的富集液稀释105倍，取稀释的悬液0.1 mL涂布初筛培养基，32℃培养。待平板长出菌落，挑取单菌落，在另一个平板上划线纯化，多次划线后用显微镜检查菌落是否单一，直至获得纯培养物后斜面保存备用。
1.2.2 高效解磷优良菌株的筛选 将筛选到的菌株接种到PVK培养基上，32℃培养48 h，观察透明圈大小。选择透明圈较大的菌株进行下一步试验。
按照文献[8]检测有效磷含量。将筛选到的菌株接种到复筛培养基上，32℃培养4 d，12 000 r/min离心10 min，取上清液按照文献方法检测有效磷含量。
1.2.3 高效解磷优良菌株的鉴定 ① 形态学特征与生理生化特征鉴定。将筛选到的高效解磷优良菌株涂布于初筛培养基平板上，32℃培养48 h，观察细胞形态和菌落特征，部分生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》[9]。 ② 16S rDNA鉴定。基因组总DNA提取后，利用正向引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和反向引物5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′进行16S rDNA全序列扩增，PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增效果。将克隆后的样品送至华大基因进行测序。
将所得序列在NCBI上进行BLAST分析比对，并选取相关菌株，利用MEGA 5.0软件采用Neighbor Joining法构建系统进化树。
1.2.4 高效解磷优良菌株的解磷特性研究 将筛选到的高效解磷优良菌株接种到发酵培养基中，摇床培养至完全转芽孢。以黄岛区盐碱地为试验对象，将该菌株发酵液施入盐碱地，以不施发酵液的盐碱地为对照，比较pH值、有效磷含量。pH值测定采用电位测定法，有效磷含量测定同1.2.2。
2 结果与分析
2.1 高效解磷菌株的分离筛选
本研究从黄岛区盐碱地中通过富集和初筛分离到18株细菌，在PVK培养基上生长、可产生透明圈的有6株，编号分别为PA03、PB01、PB03、PC02、PC05和PF03。这6株菌能在以磷酸三钙为唯一磷源的培养基上生长，并能在PVK培养基上产生透明圈，说明这6株菌具有解磷效果。
将筛选到的6株细菌接种到复筛培养基，32℃培养4 d，所得上清液的有效磷含量如表1所示。可见，菌株PC02发酵液内有效磷含量明显高于其他菌株，因此将其作为下一步的研究菌株。
2.2 高效解磷菌株PC02的鉴定
2.2.1 形态特征 菌株PC02在初筛平板上培养48 h后，菌落呈圆形，乳白色，不透明，表面光滑，隆起，湿润，边缘整齐；杆状，有芽孢，无鞭毛，革兰氏染色阳性。
2.2.2 生理生化特性 菌株PC02的生理生化结果如表2所示。可见，该菌株与巨大芽孢杆菌的生理生化特征相同，结合形态特征，该菌株初步鉴定为巨大芽孢杆菌。
2.2.3 16S rDNA基因序列及系统发育树分析 测序得到菌株PC02的16S rDNA基因序列，1 404 bp。构建系统发育树，如图1所示，菌株PC02与巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）亲缘关系最近，确定该菌株为巨大芽孢杆菌。
2.3 高效解磷菌株PC02发酵液对盐碱地的改良作用
在PC02发酵液施入盐碱地前，对照组和试验组pH值均为8.12，有效磷含量为8 mg/kg，总磷含量0.12%。施入3个月后，对照组pH值、有效磷含量和总磷含量无明显变化，试验组pH 值7.76，有效磷含量 11 mg/kg，总磷含量0.12%。通过施入PC02发酵液，土壤pH值明显降低，总磷不变的情况下有效磷含量明显提高，可见巨大芽孢杆菌对盐碱地有一定的改良作用。
3 讨论与结论
本研究从黄岛区盐碱地中分离出6株解磷菌，通过对有效磷的定量检测，筛选到一株解磷能力强的菌株PC02。结合其形态特征、生理生化特性和16S rDNA基因序列及系统发育树分析将其鉴定为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。通过盐碱地改良试验，证明了解磷菌PC02可降低土壤pH和提高土壤有效磷含量。
本研究筛选到的解磷菌PC02解磷能力较强，但与李鸣晓[10]、李振东[11]等筛选到的菌株解磷能力还有一定差距，可以通过菌株驯化、诱变育种或培养基及发酵条件的优化来提高菌株的解磷能力。植物对有效磷的吸收利用是一个较复杂的过程，菌株转化的有效磷对植物生长的作用有待进一步研究。
参 考 文 献：
[1] Kovda V A. Loss of productive land due to salinization[J]. Ambio.， 1983， 12（2）： 9l-93.
[2] 赵明范. 世界土壤盐渍化现状及研究趋势[J]. 世界林业研究， 1994， 7（1）： 84-86.
[3] 邵宗臣， 赵美芝. 土壤中积累态磷活化动力学的研究Ⅰ.有机质的影响[J]. 土壤学报， 2002， 39（3）： 318-325.
[4] 贺梦醒， 高毅， 胡正雪， 等. 解磷菌株B25的筛选、鉴定及其解磷能力[J]. 应用生态学报， 2012， 23 （1）： 235-239.
[5] 吴鹏飞， 张冬梅， 郝丽红， 等. 解磷微生物研究现状与展望[J]. 中国农业科技导报， 2008， 10 （3）： 40-46.
[6] Mehta P， Walia A， Chauhan A， et al. Plant growth promoting traits of phosphate-solubilizing rhizobacteria isolated from apple trees in trans Himalayan region of Himachal Pradesh[J]. Arch. Microbiol.， 2013， 195 （5）： 357-369.
[7] 东秀珠， 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京： 科学出版社， 2001： 349-388.
[8] 南京农学院. 土壤农化分析[M]. 北京： 农业出版社， 1980.
[9] 布坎南， 吉本斯， 等. 伯杰细菌鉴定手册[M]. 科学出版社， 1984： 729-759.
[10]李鸣晓， 席北斗， 魏自民， 等. 耐高温解磷菌的筛选及解磷能力研究[J]. 环境科学研究， 2008， 21（3）： 165-169.
[11]李振东， 陈秀蓉， 杨成德， 等. 乳白香青内生解磷菌的筛选鉴定及解磷特性研究[J]. 草业学报， 2013， 22（6）：150-158.