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摘要： 利用FIASCO磁珠富集法，开发和筛选青藏高原特有珍贵植物西川红景天（Rhodiola alsia）多态性微卫星标记。结果表明：用（AG）15和（AC）15两种微卫星标记探针构建富集文库，共获得阳性克隆约2 500个；从中随机挑取1200检测，发现具有多态性的阳性克隆达400个；随机挑取200多态性的阳性克隆进行测序，从中获得105个SSR位点，用在线软件primer32.3.4成功设计得SSR引物105对；其中45对可以成功扩增，而13对所扩增的片段在相距较远的4个自然居群的24个个体中显示较高的遗传多态性。用4个居群的80个个体检测这13对引物发现，平均等位基因数（A）约为9.192，观测杂合度（Ho）和期望杂合度（He）均值分别约为0.712和0.734，如此高的多态性已经满足后期研究的需要；数个位点在某些居群中显著偏离哈迪温伯格平衡（P<0.01），这可能是实际研究的居群并不能达到哈迪—温伯格定律所假设的无限大等理想状态所致。结合此前基于表达序列标签（Expressed Sequence Tag，EST）序列开发的SSR多态性位点，该研究结果为今后利用SSR位点开展西川红景天的居群遗传结构分析和其他研究提供了一组有效工具。
关键词： 西川红景天， 微卫星， 引物， 磁珠富集法， 开发
中图分类号： Q941，Q948
文献标识码： A
文章编号： 10003142（2017）03034206
Abstract： FIASCO magnetic beads method was utilized to develop polymophic SSR markers of Rhodiola alsia， a precious species endemic to the QinghaiXizang Plateau. Two SSR marker probes， （AG）15 and （AC）15， were used to construct enriched SSR library and 2 500 positive clones were obtained. Then 1 200 positive clones were randomly selected to check and within which 400 clones were found with polymorphism. Half of the polymorphic clones were randomly chosen for sequencing and 105 SSR loci were achieved. Subsequently， 105 pairs of
primers were designed by online software， primer 32.3.4， for amplifying the SSR sequences. Among which， a total of 45 pairs of primers were positive for amplification and the sequences amplified by thirteen pairs showed high genetic polymorphism when detected in four far apart natural populations with 24 individuals. Afterwards， the whole of 80 individuals in the four populations were employed to check the thirteen SSR loci. The average number of alleles per locus （A） was around 9.192， the mean of observed heterozygosity （Ho） and the expected heterozygosity （He） were around 0.712 and around 0.734， respectively. Such an extraordinary polymorphism was enough to meet the needs of future research. However， several loci were significantly deviated from WeinbergHardy equilibrium （P<0.01） in some populations， which may be due to the fact that the population of the actual study could not reach the ideal state of WeinbergHardy’s law. Combining SSR polymorphic loci developed previously based on EST （Expressed Sequence Tag） sequences， this study provides a set of serviceable tools for population genetic structure analysis on R. alsia and other researches based on SSR markers.
Key words： Rhodiola alsia， SSR， primers， megnetic beads method， development
西川紅景天（Rhodiola alsia）是景天科（Crassulaceae）的青藏高原特有种，主要分布于青海南部、西藏东南部、四川西北部和云南西北部，海拔3 400～4 800 m的河漫滩、山坡石隙及流石坡地（Fu & Ohba， 2001）。西川红景天的独特生境使其附近伴生植物非常稀少，因此其在高海拔的生态环境中占据举足轻重的地位。而包括西川红景天在内的多种红景天属（Rhodiola）植物是一类重要的民族药材。传统医药典籍记载，红景天具有清热、治肺病、滋补元气、抗高原反应等功效；药理学研究发现，红景天对衰老、疲劳、缺氧、不良刺激、病毒乃至肿瘤等具有抵抗功能，并且有双向调节机体、影响学习记忆、保护骨骼系统等御病保健作用（顾艳丽等， 2003； 王强等， 2007）。然而，红景天在医药、保健领域的广泛使用导致了大量市场需求，也在一定程度上使作为红景天基原植物的西川红景天等植物处于濒危之境（姜爱玲和张岩， 2015）。 微卫星（microsatellite，SSR）发现于20世纪70年代，而SSR分子标记由Litt创建于1989年，在此后的近三十年里，SSR分子标记的研究与应用得到了长足发展。SSR因其优于RAPD、ISSR和AFLP等分子标记的共显性和高重复性（Wang & Szmidt， 2001）而广泛应用于遗传变异分析、物种起源进化、基因定型、指纹鉴定、遗传图谱构建、法医科学、微生物分型和动植物遗传育种等诸多研究领域（何平， 1998； Doerge， 2002； Liu et al， 2005； Gao et al， 2005； Yoshimoto et al， 2011； 陶星辰等， 2014），而西川红景天的微卫星引物的开发与筛选将为如此众多领域的研究提供重要的基礎。我们曾利用基于高通量测序获得的唐古红景天（R. tangutica）EST序列开发西川红景天的8条相对理想SSR位点及其引物（Zhang et al， 2015）。可能由于西川红景天与唐古红景天之间的物种差异，我们并没有高效地获得理想的西川红景天SSR位点及其引物，这不能满足后续研究的多样性的需求。因此，我们尝试使用磁珠富集法FIASCO（Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing Repeats）（Zane et al， 2002）开发西川红景天的微卫星引物，并进行筛选。
1材料与方法
1.1 材料
本研究中，用于微卫星标记多态性筛选的西川红景天分别采自青海省、四川省及西藏自治区等地，各个居群的海拔、经纬度在采集地中心使用GPS全球定位系统Etres GIS采集器记录（Garmin，中国台湾）（表1）。凭证标本保存于中国科学院西北高原生物研究所青藏高原生物标本馆（HNWP）。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA酶切与接头连接本研究所用的DNA为此前的研究中所获得的基因组DNA（Zhang et al， 2015）。按照试剂Mse I说明书中所给的参考比例配置25 μL的酶切反应体系液，即0.5 μg左右的基因组DNA与加入0.5 μL的内切酶Mse I（10 U·μL1，New England Biolabs，USA）在37 ℃水浴锅中恒温反应1 h，然后于65 ℃灭活10 min。酶切反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，弥散带分布于100～1 000 bp间为佳。
在酶切产物中连接上MseI的扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）接头AdapterA（5′gATgAgTCCTgACTACN3′，N代表碱基A、G、C、T）和AdapterB（5′gACgATgAgTCCTgAg3′），于16 ℃在10 μL反应体系液中连接过夜，反应体系如下：酶切反应产物 10 μL，AdapterA 1.5 μL，AdapterB 1.5 μL，10×T4 DNA ligase buffer 2.0 μL，50% PEG4000 2.0 μL，T4 DNA ligase （1 000 U·μL1） 0.2 μL，ddH2O 2.8 μL。然后65 ℃灭活10 min。
以接头连接产物为模板，进行PCR以检测接头连接是否成，反应体系为连接产物2.0 μL，ddH2O 15.7 μL， 10×Buffer（Mg2+） 2.5 μL， dNTP（2.5 mol·
L1） 1.6 μL，MseIN（10 mol·L1） 3.0 μL，Taq polymerase（5 U·μL1；TaKaRa，大连） 0.2 μL；PCR程序为95 ℃，5 min；（94 ℃，30 s；53 ℃，60 s；72 ℃，60 s） × 25；72 ℃，7 min；16 ℃，∞。然后1%琼脂糖凝胶电泳检测该PCR产物，并用AxyPrep（AXYGEN，美国）DNA凝胶纯化试剂盒严格按照该产品的说明书来回收、纯化PCR产物。
1.2.2 生物素标记探针杂交与富集用5′生物素标记过的探针（AG）15和（AC）15与上一步纯化后的PCR产物在杂交体系中48 ℃反应2 h。杂交体系为纯化后的PCR产物40 μL、探针（AG）15和（AC）15各15 μL（10 mmol·L1），4 × SSC（with 1%SDS） 65 μL。
取1 mg磁珠于1.5 mL离心管中，用300 μL TEN100缓慢冲洗，磁力架（New England Biolabs，美国）吸附约1 min，弃漂洗液，重复漂洗2次后，将磁珠悬浮于40 μL TEN100中。
将上一步获得的杂交产物加入已准备好的磁珠悬浮液中，28 ℃，110 r·min1恒温振荡温育30 min，然后用磁力架吸附磁珠，以使磁珠和混合液分离，弃掉混合液后进行如下洗脱：向所吸附的磁珠中加400 μL TEN1000，室温漂洗5 min，然后用磁力架吸附磁珠，弃洗脱液；重复2次，保留末次洗脱液记为①。向磁珠中加400 μL含0.1%SDS的0.2 × SSC，室温漂洗5 min，然后磁力架吸附，弃洗脱液；重复2次，保留末次洗脱液记为②。向磁珠中加50 μL TE并混匀，转移到PCR管中，95 ℃变性5 min，然后用磁力架吸附，保留上清液记为③。
分别用上述所得的3份洗脱液（①、②、③）为模板进行PCR，反应体系与反应程序同1.2.1所述，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收并纯化200～700 bp大小的PCR产物，用分光光度计NanoDrop 2000c检测回收到的产物浓度。
1.2.3 微卫星富集文库构建与筛选按照产品使用说明，使用pMDTM19T Vector Cloning Kit（TaKaRa，大连）将上一步获得的纯化的PCR产物进行T载体连接。然后按照产品使用说明将连接产物转入大肠杆菌（E. coli DH5α）超感受态细胞（TaKaRa，大连）；37 ℃恒温摇床摇菌1 h；然后超净工作台中涂板接种，37 ℃倒置培养。 挑选阳性单克隆于500 μL液体LB培养基中，37 ℃恒温摇床摇菌3～5 h，接着以此菌液为模板做菌落PCR，反应体系为DNA template 0.8 μL，ddH2O 17.5 μL，10×Buffer（Mg2+） 2.5 μL，dNTP（2.5 mol·L1） 0.2 μL，MseIN（10 mol·L1） 3.0 μL，Primer（（AG）15或（AC）15，5 mol·L1） 0.8 μL Taq polymerase（5 U·μL1） 0.2 μL，PCR程序同1.2.1；1%琼脂糖凝胶电泳检测结果；根据电泳结果，挑选PCR产物多于一条带的单克隆进行测序。
通过Chromas（Chromas Technelysim， 澳大利亚）软件查看测序所得的DNA序列，使用在线软件VecScreen（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/）去掉合格序列中的载体序列；使用ClustalX 2.0.12（Larkin et al， 2007）比对序列，去掉相同的单克隆序列，运用SSRHunter软件（李强和万建民， 2005）进行SSR位点搜索；在所获得的SSR序列中，随机选择100条序列，通过软件primer32.3.4（http：//primer3.sourceforge.net/）设计其引物。
1.2.4 微卫星的多态性筛选利用4个野外居群（表1）80个个体，检测SSR引物多态性。用分光光度计NanoDrop 2000c检测每个个体DNA样品的质量和浓度，并根据所测浓度将其逐一稀释到约10 ng·μL1，以便批量进行PCR。PCR反应体系为DNAtemplate 2 μL，ddH2O 14.2 μL，10×Buffer（Mg2+） 2.5 μL，dNTP（2.5 mol·L1） 0.6 μL，Primer（Forward和Reverse） 0.5 μL，Taq polymerase（5 U·μL1） 0.2 μL，PCR程序为[94 ℃，5 min；（94 ℃，45 s；Ta，30 s；72 ℃，30 s）×35；72 ℃，7 min；16 ℃，∞]。为了控制实验成本，PCR反应产物先用聚丙烯凝胶电泳进行预检测，对于呈现较高遗传多态性的SSR引物，将其PCR产物再用QIAxcel Advanced System （QIAGEN，德国）毛细管电泳检测分析。
统计每个位点的等位基因数量（Number of alleles per locus，A），利用GENEPOP version 4.0.10分析观测杂合度（Observed heterozygosities，Ho）、期望杂合度（Expected heterozygosities，He）（Rousset， 2008）。HardyWeinberg平衡也在GENEPOP中用确切性概率方法（Exact probability test）检测。
2结果与分析
采用（AG）15和（AC）15两种微卫星标记探针构建富集文库，共获得阳性克隆约2 500个；随机挑取1 200个进行PCR检测，具有多态性的阳性克隆达400个（33.33%），随机挑取200进行测序，分析测序得到的序列，去掉载体序列，将测序结果比对，去掉相同的单克隆序列，经SSRHunter搜索后，再利用primer32.3.4成功设计引物105对（52.5%）可用于SSR多态性筛选。经过温度梯度PCR筛选确定各对引物的退火温度后，从每个居群中随机挑取6个个体——共24个个体用于PCR，以初步筛选检测引物的多态性；先在1%琼脂糖凝胶电泳中检测PCR产物质量，后再用8%聚丙烯凝胶电泳检测引物多态性。聚丙烯凝胶电泳检测显示成功扩增45对，其中13对多态性较高（表2）。
用所获得的13对SSR引物，对4个居群全部的80个个体进行反应；1%琼脂糖凝胶电泳检测后，再在毛细管电泳中对其多态性进行检测。对毛细管电泳数据的统计分析显示，所检测的13个SSR位点（表3）的等位基因数为2到23不等，均值约为9.192； 观测杂合度（Ho）范围为0.048～0.952， 均值约为0.712；而期望杂合度（He）范围是0.000～1.000，均值约为0.734。GENEPOP检测显示多个位点在某些居群中显著偏离哈迪温伯格平衡（P<0.01）。
3讨论与结论
微卫星标记开发的方法多种多样，且各有利弊（李明芳和郑学勤， 2005）。因此，应根据物种信息、研究需要等情况选择合适的方法。磁珠富集法可以高效率、低成本、简单快捷地获得高质量的微卫星（Brown et al， 1995）；本研究也在以往的研究中使用FIASCO法在高山绣线菊（Spiraea alpina）（Khan et al， 2014）、窄叶鲜卑花（Sibiraea angustata）（Arranz et al， 2013）等物种中获得了大量微卫星多态性标记，实验方法成熟高效。因此，我们在高通量测序文库搜索法不满足后期研究需要的情况下选择FIASCO法对西川红景天进行微卫星标记开发。
多数真核生物中SSR重复单元主要为核苷酸（AC/TG）n，一般情况下，重复序列单元的碱基数目越少，其多态性越高，即两碱基重复序列类型的多态性最高，三碱基、四碱基则依次次之（Kruglyak et al， 2000）。在对西川红景天的近缘物种唐古红景天的Solexa高通量测序结果的SSR分析，发现其重复类型以三核苷酸重复类型为主，二核苷酸重复类型次之，但AG、GA、CT等核苷酸重复类型占总核苷酸类型的比例远高于三核苷酸重复类型中其他类型占总核苷酸类型的比例（雷淑芸等， 2014）。如前文所述，我们也利用唐古红景天转录组的高通量测序数据，通过基于EST的方法开发了一些SSR位点及其引物，因而在用磁珠富集法开发西川红景天的SSR过程中，我们仅选用了包括（AC/TG）n类型的两碱基重复的（AG）15和（AC）15两种生物素标记探针用于富集文库的构建，如果需要增加SSR种类，可以选用更多种类的探针进行文库构建（魏大为等， 2014）。在SSR位点多态性检测过程中，我们为了高效地反映微衛星引物的多态性，采用了聚丙烯凝胶电泳进行预检测，得到多态性较高的位点之后再用分辨率更高的毛细管电泳（精确度为2bp）进行多态性位点的分析检测，从而在一定程度上降低成本的同时提高检测结果的准确度。 我们所获得的SSR位点平均等位基因数约为9.192，观测杂合度（Ho）均值约为0.712，期望杂合度（He）均值约为0.734，如此高的多态性已满足后期研究的需要；GENEPOP检测显示数个位点在某些居群中显著偏离哈迪温伯格平衡（P<0.01），这可能是实际研究的居群并不能达到哈迪—温伯格定律所假设的无限大等理想状态所致。因此，这13对SSR位点及相应SSR引物可用于后期的研究。
综上所述，我们利用磁珠富集法获得的西川红景天13个SSR多态性位点，结合此前基于EST序列开发的SSR多态性位点，为今后利用微卫星位点开展西川红景天的居群遗传结构分析和其他研究提供了一组有效工具。
参考文献：
ARRANZ SE， AVARRE JC， BALASUNDARAM， et al， D. 2013. Permanent genetic resources added to molecular ecology resources database 1 December 201231 January 2013 [J]. Mol Ecol Resourc， 13（3）： 546-549.
BROWN J， HARDWICK L， WRIGHT A， 1995. A simple method for rapid isolation of microsatellites from yeast artificial chromosomes [J]. Mol Cell Probe， 9（1）： 53-57.
DOERGE R W， 2002. Mapping and analysis of quantitative trait loci in experimental populations [J]. Nat Rev Genet， 3（1）： 43-52.
FU K， OHBA H， 2001. Rhodiola （Crassulaceae） [M] //Flora of China. Beijing： Science Press； St. Louis： Missouri Botanical Garden Press， 8： 253-263.
GAO LZ， ZHANG CH， CHANG LP， JIA JZ， QIU， et al， 2005. Microsatellite diversity within Oryza sativa with emphasis on indicajaponica divergence [J]. Genet Res， 85（1）： 1-14.
GAO QB， ZHANG DJ， DUAN YZ， et al， 2012. Intraspecific divergences of Rhodiola alsia （Crassulaceae） based on plastid DNA and internal transcribed spacer fragments [J]. Bot J Linn Soc， 168（2）： 204-215.
GU YL， WANG DK， CHEN XY， et al， 2003. Progress in the research of Rhodiola [J]. Acta Med Sin， 18（9）： 560-561. [顧艳丽， 王东凯， 陈修毅， 等， 2003. 红景天研究进展 [J]. 中国医药学报， 18（9）： 560-561.]
HE P， 1998. Abundance， polymorphism and applications of microsatellite in eukaryote [J].Hereditas （Beijing）， 20（4）： 42-47. [何平1998. 真核生物中的微卫星及其应用 [J]. 遗传， 20（4）： 42-47.]
JIANG AL， ZHANG Y， 2015. Advances in evidencebased medical research of glucocorticoids application to respiratory diseases [J]. Chin J Clin Pharmacol Ther， 50（10）： 1161-1164. [姜爱玲， 张岩 2015. 红景天苷药理作用的研究进展. 中国临床药理学与治疗学， 50（10）： 1161-1164.]
KHAN G， ZHANG FQ， GAO QB， et al， 2014. Isolation of 16 microsatellite markers for Spiraea alpina and S. mongolica （Rosaceae） of the QinghaiTibet Plateau [J]. Appl Plant Sci， 2（1）： 1300059.
KRUGLYAK S， DURRETT R， SCHUG MD et al， 2000. Distribution and abundance of microsatellites in the yeast genome can be explained by a balance between slippage events and point mutations [J]. Mol Biol Evol， 17（1）： 1210-1219.
LARKIN MA， BLACKSHIELDS G， BROWN N， et al， 2007. Clustal W and Clustal X version 2.0 [J]. Bioinformatics， 23（21）： 2947-2948. LEI SY， GAO QB， FU PC et al， 2014. Analysis on microsatellite in Rhodiola algida based on Solexa sequensing [J]. Bull Bot Res， 34（6）：829-834. [雷淑芸， 高庆波， 付鹏程， 等， 2014. 基于 Solexa 高通量测序的唐古特红景天 （Rhodiola algida） 微卫星信息分析 [J]. 植物研究， 34（6）：829-834.]
LI MF， ZHENG XQ， 2005. Research progress of methods of SSR primers development [J].Hereditas （Beijing）， 26： 769-776. [李明芳， 郑学勤 2005. 开发 SSR 引物方法之研究动态 [J]. 遗传， 26： 769-776.]
LI Q， WAN JM， 2005. SSRHunter： development of a local searching software for SSR site [J]. Hereditas （Beijing）， 27（5）： 808-810. [李强， 万建民， 2005. SSRHunter， 一个本地化的 SSR 位点搜索软件的开发. 遗传， 27（5）： 808-810.]
LIU W， NIE H， WANG S， et al， 2005. Mapping a resistance gene in wheat cultivar Yangfu 9311 to yellow mosaic virus， using microsatellite markers [J]. Theor Appl Genet， 111（4）： 651-657.
ROUSSET F， 2008. Genepop’007：a complete reimplementation of the genepop software for Windows and Linux [J]. Mol Eco Resourc， 8（1）： 103-106.
TAO XC， SHANG QJ， LIU XY，et al， 2014. Isolation and identification of Cryptococcus neoformans from pigeon droppings in parts of Yunnan Province [J]. J Pathog Biol， 9（10）： 873-876. [陶星辰， 尚秋菊， 刘晓英， 等， 2014. 云南省部分地区鸽粪中新型隐球菌的分离与鉴定 [J]. 中国病原生物学杂志， 9（10）： 873-876.]
WANG Q， RUAN X， LI HD， et al， 2007. Research status， questions and strategies of rare medicinal plant Rhodiola L [J]. J Nat Resourc， 22（6）： 880-889. [王强， 阮晓， 李荷迪， 等， 2007. 珍稀药用资源植物红景天研究现状， 问题与对策. 自然资源学报， 22（6）： 880-889.]
WANG XR， SZMIDT AE， 2001. Molecular markers in population genetics of forest trees [J]. Scand J For Res， 16（3）： 199-220.
WEI DW， LIAN ZQ， WU XD， et al， 2014. Microsatellite enrichment by magnetic beads in Silurus lanzhouensis [J]. Acta Hydrobiol Sin， 38（4）： 791-796. [魏大為， 连总强， 吴旭东， 等， 2014. 磁珠富集法筛选兰州鲇微卫星分子标记. 水生生物学报， 38（4）： 791-796.]
YOSHIMOTO K， YOSHIDA J， ISHII G， et al， 2011. Two lung adenocarcinomas in the same lobe： multiple primaries or intrapulmonary metastasis？ [J]. Ann Thorac Cardiovasc Surg， 17（6）： 584-587.
ZANE L， BARGELLONI L， PATARNELLO T， 2002. Strategies for microsatellite isolation： a review [J]. Mol Ecol， 11（1）： 1-16.
ZHANG FQ， LEI SY， GAO QB， et al， 2015. Isolation of microsatellite loci for Rhodiola alsia （Crassulaceae）： an important ethnomedicinal herb endemic to the QinghaiTibetan plateau[J]. Genet Mol Res， 14（2）： 5266-5269.
关键词： 西川红景天， 微卫星， 引物， 磁珠富集法， 开发
中图分类号： Q941，Q948
文献标识码： A
文章编号： 10003142（2017）03034206
Abstract： FIASCO magnetic beads method was utilized to develop polymophic SSR markers of Rhodiola alsia， a precious species endemic to the QinghaiXizang Plateau. Two SSR marker probes， （AG）15 and （AC）15， were used to construct enriched SSR library and 2 500 positive clones were obtained. Then 1 200 positive clones were randomly selected to check and within which 400 clones were found with polymorphism. Half of the polymorphic clones were randomly chosen for sequencing and 105 SSR loci were achieved. Subsequently， 105 pairs of
primers were designed by online software， primer 32.3.4， for amplifying the SSR sequences. Among which， a total of 45 pairs of primers were positive for amplification and the sequences amplified by thirteen pairs showed high genetic polymorphism when detected in four far apart natural populations with 24 individuals. Afterwards， the whole of 80 individuals in the four populations were employed to check the thirteen SSR loci. The average number of alleles per locus （A） was around 9.192， the mean of observed heterozygosity （Ho） and the expected heterozygosity （He） were around 0.712 and around 0.734， respectively. Such an extraordinary polymorphism was enough to meet the needs of future research. However， several loci were significantly deviated from WeinbergHardy equilibrium （P<0.01） in some populations， which may be due to the fact that the population of the actual study could not reach the ideal state of WeinbergHardy’s law. Combining SSR polymorphic loci developed previously based on EST （Expressed Sequence Tag） sequences， this study provides a set of serviceable tools for population genetic structure analysis on R. alsia and other researches based on SSR markers.
Key words： Rhodiola alsia， SSR， primers， megnetic beads method， development
西川紅景天（Rhodiola alsia）是景天科（Crassulaceae）的青藏高原特有种，主要分布于青海南部、西藏东南部、四川西北部和云南西北部，海拔3 400～4 800 m的河漫滩、山坡石隙及流石坡地（Fu & Ohba， 2001）。西川红景天的独特生境使其附近伴生植物非常稀少，因此其在高海拔的生态环境中占据举足轻重的地位。而包括西川红景天在内的多种红景天属（Rhodiola）植物是一类重要的民族药材。传统医药典籍记载，红景天具有清热、治肺病、滋补元气、抗高原反应等功效；药理学研究发现，红景天对衰老、疲劳、缺氧、不良刺激、病毒乃至肿瘤等具有抵抗功能，并且有双向调节机体、影响学习记忆、保护骨骼系统等御病保健作用（顾艳丽等， 2003； 王强等， 2007）。然而，红景天在医药、保健领域的广泛使用导致了大量市场需求，也在一定程度上使作为红景天基原植物的西川红景天等植物处于濒危之境（姜爱玲和张岩， 2015）。 微卫星（microsatellite，SSR）发现于20世纪70年代，而SSR分子标记由Litt创建于1989年，在此后的近三十年里，SSR分子标记的研究与应用得到了长足发展。SSR因其优于RAPD、ISSR和AFLP等分子标记的共显性和高重复性（Wang & Szmidt， 2001）而广泛应用于遗传变异分析、物种起源进化、基因定型、指纹鉴定、遗传图谱构建、法医科学、微生物分型和动植物遗传育种等诸多研究领域（何平， 1998； Doerge， 2002； Liu et al， 2005； Gao et al， 2005； Yoshimoto et al， 2011； 陶星辰等， 2014），而西川红景天的微卫星引物的开发与筛选将为如此众多领域的研究提供重要的基礎。我们曾利用基于高通量测序获得的唐古红景天（R. tangutica）EST序列开发西川红景天的8条相对理想SSR位点及其引物（Zhang et al， 2015）。可能由于西川红景天与唐古红景天之间的物种差异，我们并没有高效地获得理想的西川红景天SSR位点及其引物，这不能满足后续研究的多样性的需求。因此，我们尝试使用磁珠富集法FIASCO（Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing Repeats）（Zane et al， 2002）开发西川红景天的微卫星引物，并进行筛选。
1材料与方法
1.1 材料
本研究中，用于微卫星标记多态性筛选的西川红景天分别采自青海省、四川省及西藏自治区等地，各个居群的海拔、经纬度在采集地中心使用GPS全球定位系统Etres GIS采集器记录（Garmin，中国台湾）（表1）。凭证标本保存于中国科学院西北高原生物研究所青藏高原生物标本馆（HNWP）。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA酶切与接头连接本研究所用的DNA为此前的研究中所获得的基因组DNA（Zhang et al， 2015）。按照试剂Mse I说明书中所给的参考比例配置25 μL的酶切反应体系液，即0.5 μg左右的基因组DNA与加入0.5 μL的内切酶Mse I（10 U·μL1，New England Biolabs，USA）在37 ℃水浴锅中恒温反应1 h，然后于65 ℃灭活10 min。酶切反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，弥散带分布于100～1 000 bp间为佳。
在酶切产物中连接上MseI的扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）接头AdapterA（5′gATgAgTCCTgACTACN3′，N代表碱基A、G、C、T）和AdapterB（5′gACgATgAgTCCTgAg3′），于16 ℃在10 μL反应体系液中连接过夜，反应体系如下：酶切反应产物 10 μL，AdapterA 1.5 μL，AdapterB 1.5 μL，10×T4 DNA ligase buffer 2.0 μL，50% PEG4000 2.0 μL，T4 DNA ligase （1 000 U·μL1） 0.2 μL，ddH2O 2.8 μL。然后65 ℃灭活10 min。
以接头连接产物为模板，进行PCR以检测接头连接是否成，反应体系为连接产物2.0 μL，ddH2O 15.7 μL， 10×Buffer（Mg2+） 2.5 μL， dNTP（2.5 mol·
L1） 1.6 μL，MseIN（10 mol·L1） 3.0 μL，Taq polymerase（5 U·μL1；TaKaRa，大连） 0.2 μL；PCR程序为95 ℃，5 min；（94 ℃，30 s；53 ℃，60 s；72 ℃，60 s） × 25；72 ℃，7 min；16 ℃，∞。然后1%琼脂糖凝胶电泳检测该PCR产物，并用AxyPrep（AXYGEN，美国）DNA凝胶纯化试剂盒严格按照该产品的说明书来回收、纯化PCR产物。
1.2.2 生物素标记探针杂交与富集用5′生物素标记过的探针（AG）15和（AC）15与上一步纯化后的PCR产物在杂交体系中48 ℃反应2 h。杂交体系为纯化后的PCR产物40 μL、探针（AG）15和（AC）15各15 μL（10 mmol·L1），4 × SSC（with 1%SDS） 65 μL。
取1 mg磁珠于1.5 mL离心管中，用300 μL TEN100缓慢冲洗，磁力架（New England Biolabs，美国）吸附约1 min，弃漂洗液，重复漂洗2次后，将磁珠悬浮于40 μL TEN100中。
将上一步获得的杂交产物加入已准备好的磁珠悬浮液中，28 ℃，110 r·min1恒温振荡温育30 min，然后用磁力架吸附磁珠，以使磁珠和混合液分离，弃掉混合液后进行如下洗脱：向所吸附的磁珠中加400 μL TEN1000，室温漂洗5 min，然后用磁力架吸附磁珠，弃洗脱液；重复2次，保留末次洗脱液记为①。向磁珠中加400 μL含0.1%SDS的0.2 × SSC，室温漂洗5 min，然后磁力架吸附，弃洗脱液；重复2次，保留末次洗脱液记为②。向磁珠中加50 μL TE并混匀，转移到PCR管中，95 ℃变性5 min，然后用磁力架吸附，保留上清液记为③。
分别用上述所得的3份洗脱液（①、②、③）为模板进行PCR，反应体系与反应程序同1.2.1所述，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收并纯化200～700 bp大小的PCR产物，用分光光度计NanoDrop 2000c检测回收到的产物浓度。
1.2.3 微卫星富集文库构建与筛选按照产品使用说明，使用pMDTM19T Vector Cloning Kit（TaKaRa，大连）将上一步获得的纯化的PCR产物进行T载体连接。然后按照产品使用说明将连接产物转入大肠杆菌（E. coli DH5α）超感受态细胞（TaKaRa，大连）；37 ℃恒温摇床摇菌1 h；然后超净工作台中涂板接种，37 ℃倒置培养。 挑选阳性单克隆于500 μL液体LB培养基中，37 ℃恒温摇床摇菌3～5 h，接着以此菌液为模板做菌落PCR，反应体系为DNA template 0.8 μL，ddH2O 17.5 μL，10×Buffer（Mg2+） 2.5 μL，dNTP（2.5 mol·L1） 0.2 μL，MseIN（10 mol·L1） 3.0 μL，Primer（（AG）15或（AC）15，5 mol·L1） 0.8 μL Taq polymerase（5 U·μL1） 0.2 μL，PCR程序同1.2.1；1%琼脂糖凝胶电泳检测结果；根据电泳结果，挑选PCR产物多于一条带的单克隆进行测序。
通过Chromas（Chromas Technelysim， 澳大利亚）软件查看测序所得的DNA序列，使用在线软件VecScreen（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/）去掉合格序列中的载体序列；使用ClustalX 2.0.12（Larkin et al， 2007）比对序列，去掉相同的单克隆序列，运用SSRHunter软件（李强和万建民， 2005）进行SSR位点搜索；在所获得的SSR序列中，随机选择100条序列，通过软件primer32.3.4（http：//primer3.sourceforge.net/）设计其引物。
1.2.4 微卫星的多态性筛选利用4个野外居群（表1）80个个体，检测SSR引物多态性。用分光光度计NanoDrop 2000c检测每个个体DNA样品的质量和浓度，并根据所测浓度将其逐一稀释到约10 ng·μL1，以便批量进行PCR。PCR反应体系为DNAtemplate 2 μL，ddH2O 14.2 μL，10×Buffer（Mg2+） 2.5 μL，dNTP（2.5 mol·L1） 0.6 μL，Primer（Forward和Reverse） 0.5 μL，Taq polymerase（5 U·μL1） 0.2 μL，PCR程序为[94 ℃，5 min；（94 ℃，45 s；Ta，30 s；72 ℃，30 s）×35；72 ℃，7 min；16 ℃，∞]。为了控制实验成本，PCR反应产物先用聚丙烯凝胶电泳进行预检测，对于呈现较高遗传多态性的SSR引物，将其PCR产物再用QIAxcel Advanced System （QIAGEN，德国）毛细管电泳检测分析。
统计每个位点的等位基因数量（Number of alleles per locus，A），利用GENEPOP version 4.0.10分析观测杂合度（Observed heterozygosities，Ho）、期望杂合度（Expected heterozygosities，He）（Rousset， 2008）。HardyWeinberg平衡也在GENEPOP中用确切性概率方法（Exact probability test）检测。
2结果与分析
采用（AG）15和（AC）15两种微卫星标记探针构建富集文库，共获得阳性克隆约2 500个；随机挑取1 200个进行PCR检测，具有多态性的阳性克隆达400个（33.33%），随机挑取200进行测序，分析测序得到的序列，去掉载体序列，将测序结果比对，去掉相同的单克隆序列，经SSRHunter搜索后，再利用primer32.3.4成功设计引物105对（52.5%）可用于SSR多态性筛选。经过温度梯度PCR筛选确定各对引物的退火温度后，从每个居群中随机挑取6个个体——共24个个体用于PCR，以初步筛选检测引物的多态性；先在1%琼脂糖凝胶电泳中检测PCR产物质量，后再用8%聚丙烯凝胶电泳检测引物多态性。聚丙烯凝胶电泳检测显示成功扩增45对，其中13对多态性较高（表2）。
用所获得的13对SSR引物，对4个居群全部的80个个体进行反应；1%琼脂糖凝胶电泳检测后，再在毛细管电泳中对其多态性进行检测。对毛细管电泳数据的统计分析显示，所检测的13个SSR位点（表3）的等位基因数为2到23不等，均值约为9.192； 观测杂合度（Ho）范围为0.048～0.952， 均值约为0.712；而期望杂合度（He）范围是0.000～1.000，均值约为0.734。GENEPOP检测显示多个位点在某些居群中显著偏离哈迪温伯格平衡（P<0.01）。
3讨论与结论
微卫星标记开发的方法多种多样，且各有利弊（李明芳和郑学勤， 2005）。因此，应根据物种信息、研究需要等情况选择合适的方法。磁珠富集法可以高效率、低成本、简单快捷地获得高质量的微卫星（Brown et al， 1995）；本研究也在以往的研究中使用FIASCO法在高山绣线菊（Spiraea alpina）（Khan et al， 2014）、窄叶鲜卑花（Sibiraea angustata）（Arranz et al， 2013）等物种中获得了大量微卫星多态性标记，实验方法成熟高效。因此，我们在高通量测序文库搜索法不满足后期研究需要的情况下选择FIASCO法对西川红景天进行微卫星标记开发。
多数真核生物中SSR重复单元主要为核苷酸（AC/TG）n，一般情况下，重复序列单元的碱基数目越少，其多态性越高，即两碱基重复序列类型的多态性最高，三碱基、四碱基则依次次之（Kruglyak et al， 2000）。在对西川红景天的近缘物种唐古红景天的Solexa高通量测序结果的SSR分析，发现其重复类型以三核苷酸重复类型为主，二核苷酸重复类型次之，但AG、GA、CT等核苷酸重复类型占总核苷酸类型的比例远高于三核苷酸重复类型中其他类型占总核苷酸类型的比例（雷淑芸等， 2014）。如前文所述，我们也利用唐古红景天转录组的高通量测序数据，通过基于EST的方法开发了一些SSR位点及其引物，因而在用磁珠富集法开发西川红景天的SSR过程中，我们仅选用了包括（AC/TG）n类型的两碱基重复的（AG）15和（AC）15两种生物素标记探针用于富集文库的构建，如果需要增加SSR种类，可以选用更多种类的探针进行文库构建（魏大为等， 2014）。在SSR位点多态性检测过程中，我们为了高效地反映微衛星引物的多态性，采用了聚丙烯凝胶电泳进行预检测，得到多态性较高的位点之后再用分辨率更高的毛细管电泳（精确度为2bp）进行多态性位点的分析检测，从而在一定程度上降低成本的同时提高检测结果的准确度。 我们所获得的SSR位点平均等位基因数约为9.192，观测杂合度（Ho）均值约为0.712，期望杂合度（He）均值约为0.734，如此高的多态性已满足后期研究的需要；GENEPOP检测显示数个位点在某些居群中显著偏离哈迪温伯格平衡（P<0.01），这可能是实际研究的居群并不能达到哈迪—温伯格定律所假设的无限大等理想状态所致。因此，这13对SSR位点及相应SSR引物可用于后期的研究。
综上所述，我们利用磁珠富集法获得的西川红景天13个SSR多态性位点，结合此前基于EST序列开发的SSR多态性位点，为今后利用微卫星位点开展西川红景天的居群遗传结构分析和其他研究提供了一组有效工具。
参考文献：
ARRANZ SE， AVARRE JC， BALASUNDARAM， et al， D. 2013. Permanent genetic resources added to molecular ecology resources database 1 December 201231 January 2013 [J]. Mol Ecol Resourc， 13（3）： 546-549.
BROWN J， HARDWICK L， WRIGHT A， 1995. A simple method for rapid isolation of microsatellites from yeast artificial chromosomes [J]. Mol Cell Probe， 9（1）： 53-57.
DOERGE R W， 2002. Mapping and analysis of quantitative trait loci in experimental populations [J]. Nat Rev Genet， 3（1）： 43-52.
FU K， OHBA H， 2001. Rhodiola （Crassulaceae） [M] //Flora of China. Beijing： Science Press； St. Louis： Missouri Botanical Garden Press， 8： 253-263.
GAO LZ， ZHANG CH， CHANG LP， JIA JZ， QIU， et al， 2005. Microsatellite diversity within Oryza sativa with emphasis on indicajaponica divergence [J]. Genet Res， 85（1）： 1-14.
GAO QB， ZHANG DJ， DUAN YZ， et al， 2012. Intraspecific divergences of Rhodiola alsia （Crassulaceae） based on plastid DNA and internal transcribed spacer fragments [J]. Bot J Linn Soc， 168（2）： 204-215.
GU YL， WANG DK， CHEN XY， et al， 2003. Progress in the research of Rhodiola [J]. Acta Med Sin， 18（9）： 560-561. [顧艳丽， 王东凯， 陈修毅， 等， 2003. 红景天研究进展 [J]. 中国医药学报， 18（9）： 560-561.]
HE P， 1998. Abundance， polymorphism and applications of microsatellite in eukaryote [J].Hereditas （Beijing）， 20（4）： 42-47. [何平1998. 真核生物中的微卫星及其应用 [J]. 遗传， 20（4）： 42-47.]
JIANG AL， ZHANG Y， 2015. Advances in evidencebased medical research of glucocorticoids application to respiratory diseases [J]. Chin J Clin Pharmacol Ther， 50（10）： 1161-1164. [姜爱玲， 张岩 2015. 红景天苷药理作用的研究进展. 中国临床药理学与治疗学， 50（10）： 1161-1164.]
KHAN G， ZHANG FQ， GAO QB， et al， 2014. Isolation of 16 microsatellite markers for Spiraea alpina and S. mongolica （Rosaceae） of the QinghaiTibet Plateau [J]. Appl Plant Sci， 2（1）： 1300059.
KRUGLYAK S， DURRETT R， SCHUG MD et al， 2000. Distribution and abundance of microsatellites in the yeast genome can be explained by a balance between slippage events and point mutations [J]. Mol Biol Evol， 17（1）： 1210-1219.
LARKIN MA， BLACKSHIELDS G， BROWN N， et al， 2007. Clustal W and Clustal X version 2.0 [J]. Bioinformatics， 23（21）： 2947-2948. LEI SY， GAO QB， FU PC et al， 2014. Analysis on microsatellite in Rhodiola algida based on Solexa sequensing [J]. Bull Bot Res， 34（6）：829-834. [雷淑芸， 高庆波， 付鹏程， 等， 2014. 基于 Solexa 高通量测序的唐古特红景天 （Rhodiola algida） 微卫星信息分析 [J]. 植物研究， 34（6）：829-834.]
LI MF， ZHENG XQ， 2005. Research progress of methods of SSR primers development [J].Hereditas （Beijing）， 26： 769-776. [李明芳， 郑学勤 2005. 开发 SSR 引物方法之研究动态 [J]. 遗传， 26： 769-776.]
LI Q， WAN JM， 2005. SSRHunter： development of a local searching software for SSR site [J]. Hereditas （Beijing）， 27（5）： 808-810. [李强， 万建民， 2005. SSRHunter， 一个本地化的 SSR 位点搜索软件的开发. 遗传， 27（5）： 808-810.]
LIU W， NIE H， WANG S， et al， 2005. Mapping a resistance gene in wheat cultivar Yangfu 9311 to yellow mosaic virus， using microsatellite markers [J]. Theor Appl Genet， 111（4）： 651-657.
ROUSSET F， 2008. Genepop’007：a complete reimplementation of the genepop software for Windows and Linux [J]. Mol Eco Resourc， 8（1）： 103-106.
TAO XC， SHANG QJ， LIU XY，et al， 2014. Isolation and identification of Cryptococcus neoformans from pigeon droppings in parts of Yunnan Province [J]. J Pathog Biol， 9（10）： 873-876. [陶星辰， 尚秋菊， 刘晓英， 等， 2014. 云南省部分地区鸽粪中新型隐球菌的分离与鉴定 [J]. 中国病原生物学杂志， 9（10）： 873-876.]
WANG Q， RUAN X， LI HD， et al， 2007. Research status， questions and strategies of rare medicinal plant Rhodiola L [J]. J Nat Resourc， 22（6）： 880-889. [王强， 阮晓， 李荷迪， 等， 2007. 珍稀药用资源植物红景天研究现状， 问题与对策. 自然资源学报， 22（6）： 880-889.]
WANG XR， SZMIDT AE， 2001. Molecular markers in population genetics of forest trees [J]. Scand J For Res， 16（3）： 199-220.
WEI DW， LIAN ZQ， WU XD， et al， 2014. Microsatellite enrichment by magnetic beads in Silurus lanzhouensis [J]. Acta Hydrobiol Sin， 38（4）： 791-796. [魏大為， 连总强， 吴旭东， 等， 2014. 磁珠富集法筛选兰州鲇微卫星分子标记. 水生生物学报， 38（4）： 791-796.]
YOSHIMOTO K， YOSHIDA J， ISHII G， et al， 2011. Two lung adenocarcinomas in the same lobe： multiple primaries or intrapulmonary metastasis？ [J]. Ann Thorac Cardiovasc Surg， 17（6）： 584-587.
ZANE L， BARGELLONI L， PATARNELLO T， 2002. Strategies for microsatellite isolation： a review [J]. Mol Ecol， 11（1）： 1-16.
ZHANG FQ， LEI SY， GAO QB， et al， 2015. Isolation of microsatellite loci for Rhodiola alsia （Crassulaceae）： an important ethnomedicinal herb endemic to the QinghaiTibetan plateau[J]. Genet Mol Res， 14（2）： 5266-5269.