论文部分内容阅读
【摘要】 目的 观察减毒活菌卡介苗（BCG）对哮喘小鼠肺组织TLR4表达的影响，以探讨BCG对哮喘治疗的可能作用机制。方法 昆明小鼠建立哮喘模型并多次BCG接种，Western Blotting 检测肺组织TLR4的表达。结果 BCG干预组小鼠TLR4基因表达量与空白对照组以及哮喘发病组相比增强。结论 卡介苗对哮喘的治疗作用可能与肺组织TLR4上调有关。
【关键词】
卡介苗；哮喘；TLR4
哮喘存在有气道高反应性、IgE调节和特异性反应基因。Toll样受体是在哺乳动物中发现的与果蝇有同源性的蛋白，命名为TLR，最初发现的TLR4是目前研究最多的[1]。研究证实，BCG其分枝杆菌脂蛋白能与巨噬细胞上Toll样受体结合，促进巨噬细胞产生IL12、IFNγ，抑制IL4、IL5的产生，从而纠正哮喘中Th1/Th2亚群数目和（或）功能失衡[2]。本实验意在研究BCG对哮喘小鼠模型中肺组织TLR4的影响，为临床哮喘治疗提供新的研究方向及思路，并将发现以TLRs和其信号途径作为靶点去治疗、干预多种疾病的新方法。
1 材料与方法
11 实验动物与试剂
昆明种小白鼠、卵白蛋白（OVA，GradeⅡ）、减毒活菌卡介苗（BCG）、抗TLR4单克隆抗体、抗GAPDH单克隆抗体、HRP标记的小鼠IgG抗体等。
12 实验动物的分组及致敏模型制备
实验动物随机分为三组，分别为空白对照组、哮喘发病组和BCG干预组，每组10只小鼠。哮喘发病组：第1、7、14天腹腔注射008%OVA致敏，每次02 ml，Al（OH）3作为免疫佐剂。第15天开始雾化激发；BCG干预组：哮喘模型的建立同哮喘发病组，在每次致敏前1 d和最后雾化激发1 h内BCG皮内注射再次干预，每次剂量为0025 mg；空白对照组：用生理盐水代替OVA。所有小鼠在最后一次激发24 h后获取标本。
13 小鼠肺组织TLR4蛋白的Western Blotting 检测
取各组实验小鼠肺组织提取总蛋白，测定浓度。各组蛋白样品SDSPAGE电泳后，电转移至PVDF膜上。PVDF膜经封闭2 h后，用稀释后的TLR4单克隆抗体，4℃孵育过夜。再进一步与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育后，滴加化学发光底物，X光胶片感光检测蛋白信号。
14 统计学方法
所有实验结果采用SPSS100软件进行统计分析，计量数据以（x±s）的形式表示。组间差异采用t检验。
图1
各组小鼠肺组织中TLR4蛋白表达的Western Blotting鉴定
1为空白对照组，2为哮喘发病组，3为BCG干预组，GAPDH蛋白为内参照
2 结果
TLR4蛋白在空白对照组的肺组织中仅有微量的表达，哮喘发病组中TLR4 蛋白的表达量较对照组略有升高，而BCG干预组中TLR4 蛋白的表达量较前两组均有显著的增强（灰度分析数据未显示）。
3 讨论
BCG为结核杆菌的减毒活疫苗，其主要成分是卡介苗核糖核酸。研究证实[3]，TLR4的配体结合TLR4后，通过跨膜结构将病原相关分子刺激信号转导入细胞内，产生复杂的级联信号反应，其中TLR4NFKB信号途径参与细胞免疫应答、炎性反应和抗凋亡相关基因的转录是细胞免疫学领域的研究热点。但BCG是否也能通过TLR4途径介导并激活Th1 型免疫反应尚不清楚。
我们通过实验发现经BCG干预后，TLR4基因表达量与空白对照组以及哮喘发病组相比均有显著升高。BCG可能是通过刺激TLR4表达上调，进而调节Th1/Th2平衡，在哮喘发病的治疗中发挥重要作用。而关于BCG作为TLR4的配体如何发挥功能仍需进一步的实验研究验证。
参 考 文 献
[1] Mikko Hallman，Mika R met，et alTollLike Receptors As Sensors Of PathogensPediatric Research，2001，50（3）
[2] ISChoi，YIKohEffects of BCG revaccination on asthmaAllergy，2003，58：1114–1116
[3] An De Creus，Masanori Abe，et alLow TLR4 Expression by Liver Dendritic Cells Correlates with Reduced Capacity to Activate Allogeneic T Cells in Response to Endotoxin1The Journal of Immunology，2005，174：2037–2045
【关键词】
卡介苗；哮喘；TLR4
哮喘存在有气道高反应性、IgE调节和特异性反应基因。Toll样受体是在哺乳动物中发现的与果蝇有同源性的蛋白，命名为TLR，最初发现的TLR4是目前研究最多的[1]。研究证实，BCG其分枝杆菌脂蛋白能与巨噬细胞上Toll样受体结合，促进巨噬细胞产生IL12、IFNγ，抑制IL4、IL5的产生，从而纠正哮喘中Th1/Th2亚群数目和（或）功能失衡[2]。本实验意在研究BCG对哮喘小鼠模型中肺组织TLR4的影响，为临床哮喘治疗提供新的研究方向及思路，并将发现以TLRs和其信号途径作为靶点去治疗、干预多种疾病的新方法。
1 材料与方法
11 实验动物与试剂
昆明种小白鼠、卵白蛋白（OVA，GradeⅡ）、减毒活菌卡介苗（BCG）、抗TLR4单克隆抗体、抗GAPDH单克隆抗体、HRP标记的小鼠IgG抗体等。
12 实验动物的分组及致敏模型制备
实验动物随机分为三组，分别为空白对照组、哮喘发病组和BCG干预组，每组10只小鼠。哮喘发病组：第1、7、14天腹腔注射008%OVA致敏，每次02 ml，Al（OH）3作为免疫佐剂。第15天开始雾化激发；BCG干预组：哮喘模型的建立同哮喘发病组，在每次致敏前1 d和最后雾化激发1 h内BCG皮内注射再次干预，每次剂量为0025 mg；空白对照组：用生理盐水代替OVA。所有小鼠在最后一次激发24 h后获取标本。
13 小鼠肺组织TLR4蛋白的Western Blotting 检测
取各组实验小鼠肺组织提取总蛋白，测定浓度。各组蛋白样品SDSPAGE电泳后，电转移至PVDF膜上。PVDF膜经封闭2 h后，用稀释后的TLR4单克隆抗体，4℃孵育过夜。再进一步与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育后，滴加化学发光底物，X光胶片感光检测蛋白信号。
14 统计学方法
所有实验结果采用SPSS100软件进行统计分析，计量数据以（x±s）的形式表示。组间差异采用t检验。
图1
各组小鼠肺组织中TLR4蛋白表达的Western Blotting鉴定
1为空白对照组，2为哮喘发病组，3为BCG干预组，GAPDH蛋白为内参照
2 结果
TLR4蛋白在空白对照组的肺组织中仅有微量的表达，哮喘发病组中TLR4 蛋白的表达量较对照组略有升高，而BCG干预组中TLR4 蛋白的表达量较前两组均有显著的增强（灰度分析数据未显示）。
3 讨论
BCG为结核杆菌的减毒活疫苗，其主要成分是卡介苗核糖核酸。研究证实[3]，TLR4的配体结合TLR4后，通过跨膜结构将病原相关分子刺激信号转导入细胞内，产生复杂的级联信号反应，其中TLR4NFKB信号途径参与细胞免疫应答、炎性反应和抗凋亡相关基因的转录是细胞免疫学领域的研究热点。但BCG是否也能通过TLR4途径介导并激活Th1 型免疫反应尚不清楚。
我们通过实验发现经BCG干预后，TLR4基因表达量与空白对照组以及哮喘发病组相比均有显著升高。BCG可能是通过刺激TLR4表达上调，进而调节Th1/Th2平衡，在哮喘发病的治疗中发挥重要作用。而关于BCG作为TLR4的配体如何发挥功能仍需进一步的实验研究验证。
参 考 文 献
[1] Mikko Hallman，Mika R met，et alTollLike Receptors As Sensors Of PathogensPediatric Research，2001，50（3）
[2] ISChoi，YIKohEffects of BCG revaccination on asthmaAllergy，2003，58：1114–1116
[3] An De Creus，Masanori Abe，et alLow TLR4 Expression by Liver Dendritic Cells Correlates with Reduced Capacity to Activate Allogeneic T Cells in Response to Endotoxin1The Journal of Immunology，2005，174：2037–2045