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摘要:为进一步研发安全、高效的柑橘防腐保鲜剂提供一定的理论依据。采用滤纸片法和生长速率法,利用20种中草药的乙醇提取物对一株柑橘采后致腐真菌P01进行抑菌试验。结果表明,用滤纸片法进行抑菌作用测定,发现射干、苦参、厚朴、丁香、木香、连翘、肉桂的乙醇提取物对P01具有一定的抑制作用。用生长速率法,以提取物质量浓度15 mg/mL对初次筛选出的7种中草药提取物进一步进行抑菌试验,发现丁香、射干、厚朴、肉桂、苦参、木香的乙醇提取物抑菌率都在50%以上,效果最好的是丁香乙醇浸提物,抑菌率达到90.00%,其次是射干乙醇浸提物,其抑菌率达81.25%。
关键词:中草药提取物;柑橘;致腐真菌;抑菌作用
中图分类号:S666文献标识码:A文章编号:1006-6500(2009)02-0056-03
Inhibition of 20 Kinds of Chinese Herbs Extracts Against a Rot-causing Fungus in Postharvest Citrus Fruits
HU Mei,CHEN Gen-qiang,DU Gen-ping
(College of Forestry,Henan University of Science and Technology,Luoyang,Henan471003,China)
Abstract:The aim of test was to provide basis for researching safe and concentrated preservatives of citrus fruits. The inhibition of alcohol extracts from 20 kinds Chinese herbs againast a rot-causing fungus in postharvest citrus fruits were tested through filter paper method and plate growth rate method. In the test of filter paper method, alcohol extracts of Rhizoma belamcandae, Sophora flavescens Ait, Citrus grandis Tomentosa, Flos caryophyllata, Aucklandia lappa, Forsythia suspense,Cinnamomi cassiae Presl, expressed inhibition against P01. In the test of plate growth rate method with alcohol extracts at 15 mg/mL, the inhibitory rates of alcohol extracts from Flos caryophyllata, Rhizoma belamcandae, Citrus grandis Tomentosa, Cinnamomi cassiae Presl, Sophora flavescens Ait, Aucklandia lappa were over 50%. The inhibitory rates of alcohol extracts from Flos caryophyllata and Rhizoma belamcandae were 90.00% and 81.25% ,respectively.
Key words: Chinese herb extract;citrus;rot-causing fungus;inhibition
柑橘是世界产量最多的水果,也是我国主要的水果之一[1]。柑橘采后在贮藏运输的过程中,常常由于病原菌的侵染而造成腐烂,轻则影响果实的食用品质和商品价值,重则造成大量烂果,导致严重的经济损失[2]。目前,柑橘防腐多采用化学防腐剂,如多菌灵、甲基托布津等,这些化学物质虽然能够杀死病原菌,达到防腐保鲜的目的,但是对人体健康却有一定的不利影响,甚至出现致癌、致畸、致突变等潜在危害。因此,从20世纪80年代人们就开始寻找新的、更安全有效的方法来控制水果采后病害[3]。
中草药作为我国的宝贵遗产其抑菌作用早已广泛应用于医药行业,很多研究已证实了中草药的杀菌成分对果蔬防腐保鲜的效果[3]。而且植物源防腐剂具有高效、低毒、易降解、不污染环境等优点,已成为传统化学防腐剂的有效替代[4]。本试验利用20种中草药的乙醇提取物对一株柑橘采后致病菌进行了抑菌试验,以期为进一步研发安全、高效的柑橘防腐保鲜剂提供一定的理论依据。
1材料和方法
1.1材 料
1.1.1供试菌株供试菌株由柑橘采后一腐烂病果上分离纯化得到,经鉴定为意大利青霉(PeniciLLium italicum Wehmer),编号为P01。
1.1.2供试中草药供试的20种中草药均购于河南洛阳张仲景大药房。20种中草药及利用部位分别是:大黄(根)、丁香(花蕾)、木香(根)、柴胡(根)、艾叶(叶)、连翘(果实)、白头翁(根)、虎杖(茎)、五味子(果实)、厚朴(果皮)、金银花(花蕾)、射干(根)、黄芩(根)、苦参(根)、蛇床子(种子)、细辛(全草)、蒲公英(全草)、辛夷(花蕾)、甘草(根)、肉桂(树皮)。
1.1.3供试培养基供试培养基为PDA培养基。
1.2方 法
1.2.1中草药提取物的制备将干燥的中草药材料粉碎,过0.45 mm筛,称取15.0 g,浸于50 mL 80%的乙醇中,28 ℃,80 r/min振荡提取48 h,再在28 ℃下静置提取5 d,3层纱布过滤,取滤液旋转蒸发(50 ℃)至稀膏状,残余物溶于10 mL 80%乙醇中,摇匀,得中草药提取母液,放入4 ℃冰箱中保存备用[5,6]。
1.2.2中草药提取物对P01抑制作用的初步测定(滤纸片法)吸取1 mL供试菌孢子悬液(2.50×104个/mL)于PDA平板上,用无菌涂布棒涂抹均匀。然后放入直径为6 mm的含药滤纸片(将无菌滤纸片在各种中草药提取液中浸泡2 h),每皿放1片。对照为80%的乙醇浸泡过的滤纸片,重复6次。于26 ℃恒温培养箱内培养3 d后用十字交叉法测量抑菌圈直径大小,计算抑菌圈宽度[5]。
抑菌圈宽度(mm)=(抑菌圈直径-滤纸片直径)/ 2
1.2.3中草药提取物对P01抑菌作用的再次测定(生长速率法)将1.2.2方法筛选出的几种具有抑菌活性的中草药提取液各准确吸取1 mL,与99 mL冷却至50 ℃左右的PDA培养基混合均匀,制成1%的含药培养基(培养基含药量为15 mg/mL),同时为了防止细菌污染,培养基中还加入了5 mg/mL的链霉素1 mL。取含药培养基100 mL均匀倒入6个培养皿(Φ9 cm)中制成平板,在每个平板中央接直径0.4 cm的P01菌片1片,以加1 mL 80%乙醇和1 mL链霉素(5 mg/mL)的PDA培养基作对照。置于26 ℃恒温培养箱内培养3 d,用十字交叉法测量菌落直径大小,并计算抑菌率[7]。
1.3数据处理分析
差异显著性分析采用DPS(Data Processing System)统计软件LSD法进行。
2结果与分析
2.1中草药提取物对P01抑制作用的初步测定
以P01为供试菌,采用滤纸片法,对20种中草药的乙醇浸提物进行了抑菌作用试验,结果见表1。
由表1可以看出,以上20种中草药乙醇提取物中,射干、苦参、厚朴、丁香、木香、连翘、肉桂7种中草药的乙醇提取物对P01菌丝的生长具有一定的抑制作用,表现为:射干>苦参>肉桂>厚朴>丁香>木香>连翘。而含其它13种中草药乙醇提取物的滤纸片周围均未出现抑菌圈,说明这些中草药乙醇提取物对P01没有抑制作用或抑制作用不强。
2.2中草药提取物对P01的抑制作用的再次测定(生长率法)
对前面筛选出的具有一定抑菌作用的7种中草药乙醇提取液,用生长速率法又进一步进行了抑菌作用测定,结果见表2。
由表2可以看出,与对照比较,以上几种中草药乙醇提取液对P01菌丝的生长具有不同的抑制作用,表现为:丁香>射干>厚朴>肉桂>苦参>木香>连翘。其中丁香的抑制效果最好,抑菌率达到90.00%,其次是射干,抑菌率为81.25%,厚朴、肉桂、苦参、木香的抑菌率也在50%～70%之间,说明这6种中草药的乙醇提取物对P01的抑菌效果较好,尤其是丁香和射干。
从试验结果来看,用滤纸片法和生长速率法得到的结果不尽相同,分析其原因,可能主要是因为提取物的浓度不同,滤纸片法所用的直径6 mm的滤纸片浸入中草药提取物中,所吸取的药液量虽不能确定,但毕竟有限,而有些中草药提取物可能在其浓度较低时抑菌效果并不好,例如丁香,在用滤纸片法试验时抑菌效果并不突出,但在生长速率法试验时,在提取物浓度为15 mg/mL时,抑菌效果最好,可能就是此原因。
3结论与讨论
⑴ 用滤纸片法进行抑菌作用测定,发现射干、苦参、厚朴、丁香、木香、连翘、肉桂的乙醇提取物对一株柑橘采后致腐菌P01具有一定的抑制作用。用生长速率法,以提取物质量浓度15 mg/mL进行抑菌试验,发现丁香、射干、厚朴、肉桂、苦参、木香的乙醇提取物抑菌率都在50%以上,其中最好的是丁香乙醇浸提物,其抑菌率达到90.00%,其次是射干乙醇浸提物,其抑菌率达81.25%。
⑵ 我国具有丰富的中草药资源,在本试验中,仅选用了20种中草药,通过简易提取方式得到其粗提物,对柑橘采后的一种致腐菌进行了抑菌作用试验,因此,可能还会有抑菌效果更好的中草药未被采用,有待于进一步去探索。
⑶ 目前,中草药提取物用于柑橘防腐保鲜方面的研究报道还较少,应该进一步加强这方面的研究。本试验中发现的两种中草药乙醇提物的作用方式、作用机理以及在活体上的防腐效果还有待于进一步研究。
参考文献:
[1] 王士刚.柑橘贮藏保鲜技术[J].湖北农业科学,1989(10):33-34.
[2] 邓雨艳,曾凯芳.柑橘果实采后侵染性病害防治技术研究进展[J].食品科技,2008(4):211-214.
[3] 吴小虎,艾启俊,肖艺.天然中草药果蔬防腐保鲜剂的研究与应用[J].保鲜与加工,2006(2):4-6.
[4] 杨玉萍,李艾莲.植物源杀菌剂研究进展[J].农药市场信息,2006(6):12-13.
[5] 王丽丽,田晋奇.植物提取物对霉菌的抑制作用[J].氨基酸和生物资源,2004,26(4):17-19.
[6] 黄奔立,朱华,顾艳,等. 中草药对5种蔬菜病菌的抑制作用[J]. 扬州大学学报:农业与生命科学版,2006,27(3):84-86.
[7] 王树桐,胡同乐,王晓燕,等.对番茄灰霉病菌有抗菌活性的植物提取物的室内筛选[J].河北农业大学学报,2003,26(1):61-64.
关键词:中草药提取物;柑橘;致腐真菌;抑菌作用
中图分类号:S666文献标识码:A文章编号:1006-6500(2009)02-0056-03
Inhibition of 20 Kinds of Chinese Herbs Extracts Against a Rot-causing Fungus in Postharvest Citrus Fruits
HU Mei,CHEN Gen-qiang,DU Gen-ping
(College of Forestry,Henan University of Science and Technology,Luoyang,Henan471003,China)
Abstract:The aim of test was to provide basis for researching safe and concentrated preservatives of citrus fruits. The inhibition of alcohol extracts from 20 kinds Chinese herbs againast a rot-causing fungus in postharvest citrus fruits were tested through filter paper method and plate growth rate method. In the test of filter paper method, alcohol extracts of Rhizoma belamcandae, Sophora flavescens Ait, Citrus grandis Tomentosa, Flos caryophyllata, Aucklandia lappa, Forsythia suspense,Cinnamomi cassiae Presl, expressed inhibition against P01. In the test of plate growth rate method with alcohol extracts at 15 mg/mL, the inhibitory rates of alcohol extracts from Flos caryophyllata, Rhizoma belamcandae, Citrus grandis Tomentosa, Cinnamomi cassiae Presl, Sophora flavescens Ait, Aucklandia lappa were over 50%. The inhibitory rates of alcohol extracts from Flos caryophyllata and Rhizoma belamcandae were 90.00% and 81.25% ,respectively.
Key words: Chinese herb extract;citrus;rot-causing fungus;inhibition
柑橘是世界产量最多的水果,也是我国主要的水果之一[1]。柑橘采后在贮藏运输的过程中,常常由于病原菌的侵染而造成腐烂,轻则影响果实的食用品质和商品价值,重则造成大量烂果,导致严重的经济损失[2]。目前,柑橘防腐多采用化学防腐剂,如多菌灵、甲基托布津等,这些化学物质虽然能够杀死病原菌,达到防腐保鲜的目的,但是对人体健康却有一定的不利影响,甚至出现致癌、致畸、致突变等潜在危害。因此,从20世纪80年代人们就开始寻找新的、更安全有效的方法来控制水果采后病害[3]。
中草药作为我国的宝贵遗产其抑菌作用早已广泛应用于医药行业,很多研究已证实了中草药的杀菌成分对果蔬防腐保鲜的效果[3]。而且植物源防腐剂具有高效、低毒、易降解、不污染环境等优点,已成为传统化学防腐剂的有效替代[4]。本试验利用20种中草药的乙醇提取物对一株柑橘采后致病菌进行了抑菌试验,以期为进一步研发安全、高效的柑橘防腐保鲜剂提供一定的理论依据。
1材料和方法
1.1材 料
1.1.1供试菌株供试菌株由柑橘采后一腐烂病果上分离纯化得到,经鉴定为意大利青霉(PeniciLLium italicum Wehmer),编号为P01。
1.1.2供试中草药供试的20种中草药均购于河南洛阳张仲景大药房。20种中草药及利用部位分别是:大黄(根)、丁香(花蕾)、木香(根)、柴胡(根)、艾叶(叶)、连翘(果实)、白头翁(根)、虎杖(茎)、五味子(果实)、厚朴(果皮)、金银花(花蕾)、射干(根)、黄芩(根)、苦参(根)、蛇床子(种子)、细辛(全草)、蒲公英(全草)、辛夷(花蕾)、甘草(根)、肉桂(树皮)。
1.1.3供试培养基供试培养基为PDA培养基。
1.2方 法
1.2.1中草药提取物的制备将干燥的中草药材料粉碎,过0.45 mm筛,称取15.0 g,浸于50 mL 80%的乙醇中,28 ℃,80 r/min振荡提取48 h,再在28 ℃下静置提取5 d,3层纱布过滤,取滤液旋转蒸发(50 ℃)至稀膏状,残余物溶于10 mL 80%乙醇中,摇匀,得中草药提取母液,放入4 ℃冰箱中保存备用[5,6]。
1.2.2中草药提取物对P01抑制作用的初步测定(滤纸片法)吸取1 mL供试菌孢子悬液(2.50×104个/mL)于PDA平板上,用无菌涂布棒涂抹均匀。然后放入直径为6 mm的含药滤纸片(将无菌滤纸片在各种中草药提取液中浸泡2 h),每皿放1片。对照为80%的乙醇浸泡过的滤纸片,重复6次。于26 ℃恒温培养箱内培养3 d后用十字交叉法测量抑菌圈直径大小,计算抑菌圈宽度[5]。
抑菌圈宽度(mm)=(抑菌圈直径-滤纸片直径)/ 2
1.2.3中草药提取物对P01抑菌作用的再次测定(生长速率法)将1.2.2方法筛选出的几种具有抑菌活性的中草药提取液各准确吸取1 mL,与99 mL冷却至50 ℃左右的PDA培养基混合均匀,制成1%的含药培养基(培养基含药量为15 mg/mL),同时为了防止细菌污染,培养基中还加入了5 mg/mL的链霉素1 mL。取含药培养基100 mL均匀倒入6个培养皿(Φ9 cm)中制成平板,在每个平板中央接直径0.4 cm的P01菌片1片,以加1 mL 80%乙醇和1 mL链霉素(5 mg/mL)的PDA培养基作对照。置于26 ℃恒温培养箱内培养3 d,用十字交叉法测量菌落直径大小,并计算抑菌率[7]。
1.3数据处理分析
差异显著性分析采用DPS(Data Processing System)统计软件LSD法进行。
2结果与分析
2.1中草药提取物对P01抑制作用的初步测定
以P01为供试菌,采用滤纸片法,对20种中草药的乙醇浸提物进行了抑菌作用试验,结果见表1。
由表1可以看出,以上20种中草药乙醇提取物中,射干、苦参、厚朴、丁香、木香、连翘、肉桂7种中草药的乙醇提取物对P01菌丝的生长具有一定的抑制作用,表现为:射干>苦参>肉桂>厚朴>丁香>木香>连翘。而含其它13种中草药乙醇提取物的滤纸片周围均未出现抑菌圈,说明这些中草药乙醇提取物对P01没有抑制作用或抑制作用不强。
2.2中草药提取物对P01的抑制作用的再次测定(生长率法)
对前面筛选出的具有一定抑菌作用的7种中草药乙醇提取液,用生长速率法又进一步进行了抑菌作用测定,结果见表2。
由表2可以看出,与对照比较,以上几种中草药乙醇提取液对P01菌丝的生长具有不同的抑制作用,表现为:丁香>射干>厚朴>肉桂>苦参>木香>连翘。其中丁香的抑制效果最好,抑菌率达到90.00%,其次是射干,抑菌率为81.25%,厚朴、肉桂、苦参、木香的抑菌率也在50%～70%之间,说明这6种中草药的乙醇提取物对P01的抑菌效果较好,尤其是丁香和射干。
从试验结果来看,用滤纸片法和生长速率法得到的结果不尽相同,分析其原因,可能主要是因为提取物的浓度不同,滤纸片法所用的直径6 mm的滤纸片浸入中草药提取物中,所吸取的药液量虽不能确定,但毕竟有限,而有些中草药提取物可能在其浓度较低时抑菌效果并不好,例如丁香,在用滤纸片法试验时抑菌效果并不突出,但在生长速率法试验时,在提取物浓度为15 mg/mL时,抑菌效果最好,可能就是此原因。
3结论与讨论
⑴ 用滤纸片法进行抑菌作用测定,发现射干、苦参、厚朴、丁香、木香、连翘、肉桂的乙醇提取物对一株柑橘采后致腐菌P01具有一定的抑制作用。用生长速率法,以提取物质量浓度15 mg/mL进行抑菌试验,发现丁香、射干、厚朴、肉桂、苦参、木香的乙醇提取物抑菌率都在50%以上,其中最好的是丁香乙醇浸提物,其抑菌率达到90.00%,其次是射干乙醇浸提物,其抑菌率达81.25%。
⑵ 我国具有丰富的中草药资源,在本试验中,仅选用了20种中草药,通过简易提取方式得到其粗提物,对柑橘采后的一种致腐菌进行了抑菌作用试验,因此,可能还会有抑菌效果更好的中草药未被采用,有待于进一步去探索。
⑶ 目前,中草药提取物用于柑橘防腐保鲜方面的研究报道还较少,应该进一步加强这方面的研究。本试验中发现的两种中草药乙醇提物的作用方式、作用机理以及在活体上的防腐效果还有待于进一步研究。
参考文献:
[1] 王士刚.柑橘贮藏保鲜技术[J].湖北农业科学,1989(10):33-34.
[2] 邓雨艳,曾凯芳.柑橘果实采后侵染性病害防治技术研究进展[J].食品科技,2008(4):211-214.
[3] 吴小虎,艾启俊,肖艺.天然中草药果蔬防腐保鲜剂的研究与应用[J].保鲜与加工,2006(2):4-6.
[4] 杨玉萍,李艾莲.植物源杀菌剂研究进展[J].农药市场信息,2006(6):12-13.
[5] 王丽丽,田晋奇.植物提取物对霉菌的抑制作用[J].氨基酸和生物资源,2004,26(4):17-19.
[6] 黄奔立,朱华,顾艳,等. 中草药对5种蔬菜病菌的抑制作用[J]. 扬州大学学报:农业与生命科学版,2006,27(3):84-86.
[7] 王树桐,胡同乐,王晓燕,等.对番茄灰霉病菌有抗菌活性的植物提取物的室内筛选[J].河北农业大学学报,2003,26(1):61-64.