论文部分内容阅读
【摘要】为了建立葛粉中测量大豆苷元成分的方法。我们将色谱柱设定为Agilent zorbax SB-C18（4.6mm×150mm，5μm），流动相通过乙腈-0.1%甲酸对其梯度洗脱，并将检测波长设定成258nm，流速为1mL·min-1。通过实验我们测出大豆苷元的线性范围以及加样回收率，并且使用此方法进行实检测操作起来较为简单，测定结果也较为精确，可将此方法在葛粉类食品中大豆苷元的含量測定以及产品质量控制中多加应用。
【关键词】RP-HPLC；大豆苷元；含量测定，葛粉
大豆异黄酮作为主要的植物雌激素，它有着和雌激素一样的功效，它不仅可以降低乳腺癌、前列腺癌的发病率，减轻更年期因雌激素缺乏而导致的停经期综合症和骨质疏松症，而且它还可以延缓衰老、预防心血管等多种疾病。大豆异黄酮引起国内外越来越多的注意和研讨，在我国，市场上出现很多含大豆异黄酮类成分的提取物、这些保健食品有的进口有的国产名目不一，质量也良莠不齐。我国的中药葛根和甘葛藤中含有葛根素、大豆苷元等大豆异黄酮类成分，该类药食同源的中药常加工成葛粉用于保健食品，具有很好的保健作用和市场价值。现在对葛根素对含量测定方法报道的文献较多，总结起来一般通过紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法对大豆异黄酮类提取物进行实验，以测定其异黄酮的含量[1-7]。我们为了更好地对一个产品进行评价以及更好的把握好质量关，故对葛粉中大豆苷元的含量测定方法进行更深入的实验，得到了令人满意的结果。
1仪器与试剂的选取
在这次实验中我们选取了Waters Alliance 2690高效液相色谱仪和DAD紫外检测器。大豆苷元对照品是中国药品生物制品检定所供给的，其纯度在98%以上。除了乙腈为色谱纯，实验中采用的其他溶剂均为分析纯，使用纯净水，过Millipore0.22μm的滤膜。五种葛粉样品都是市场在售的产品。
2色谱条件色谱柱
色谱柱Agilent zorbax SB-C18（4.6 mm×150mm，5μm），柱温设定 25 ℃；流速为1mL·min-1；流动相通过流动相A（0.1%甲酸）及流动相B（乙腈）按以下梯度实施洗脱：初状态为10%B相，0-18min内流动相B增至22%，18-25min内流动相B保持22%，25-43min内流动相B增至30%，43-45min内流动相B降至10%，保持5分钟；检测的波长258nm；理论塔板数以大豆苷元算高于2000。色谱图见图1。
3溶液的制备
3.1取一定量的大豆苷元对照品，称取过程要保证精准度，然后将甲醇加入制备成大豆苷元0.06 mg·mL-1的溶液，这就是我们实验中要用到的对照品溶液。
3.2依次精密称取样品细粉0.5g，将甲醇25ml加入，称重后进行三十分钟的超声处理，将其置于室温，再称重，缺失的重量用甲醇给予补足，使其充分均匀混合，再用0.45μm的微孔滤膜进行过滤，这就是我们实验中要用到的供试品溶液。
4方法与结果的分析
4.1分别将2.0，4.0，8.0，10.0，15.0μL，20.0μL的对照品溶液依次注入到液相色谱仪中，然后测量峰面积。峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，计算出的回归方程为Y=1.068×107 X-1.992×105，r=0.9998。这就说明大豆苷元在2.06-20.6μg范围内具备良好的线性关系。
4.2稳定性试验取供试品溶液10μL，吸取过程保证精准，每2小时.进样1次，6次之后测量峰面积，数据显示大豆苷元的RSD为1.03%，这也就说明12h内测定有稳定的结果。
4.3精密度实验取对照品溶液10μL，吸取过程保证精准，注入液相色谱仪然后测量峰面积，数据显示大豆苷元的RSD为（n=5）0.89%，这也就说明仪器十分精密。
4.4最低检测限和定量限将信噪比3：1作为标准测得大豆苷元的最低检测限为0.35μg。以信噪比10：1时的进样量作为定量限，测得大豆苷元的定量限为0.89μg。
4.5重复性实验将同一样品取出5份，用样品处理法依次测定6种成分的含量。结果大豆苷元的RSD为0.93%，实验数据说明该方法有良好的重复性。
4.6回收率试验此试验我们用的是加样回收率的方法。现有明确含量的样品，我们分别精确地取出共9份，平均分为三组，按高、中、低3个水平依次精确地加入一定量对照品，然后进行供试品溶液制备的操作，数据显示大豆苷元的回收率是97.29%（RSD 1.37%）。这也就说明通过这种方法对大豆苷元成分进行测量，有良好的回收率。
4.7样品测定按上文中提到的方法进行样品溶液的制备并测定，5种葛粉类保健食品（样品都是市售含葛粉产品，依次编号1，2，3，4，5）样品的测定结果，见表1。
5讨论
5.1研究发现，大豆苷元对照品溶液的最大吸收波长处于260±1nm，258nm处吸收值达到最高，故我们选取258nm为检测波长。
5.2提取方法的选择根据相关的文献提出再与大豆异黄酮自身的性质特点相结合，对超声提取和回流提取进行了对比，结果显示二者提取效率并无大的差异，而且超声提取方法更为简易，所以将其作为我们最终的选取。在考量了甲醇、乙醇、70%甲醇、50%甲醇和70%乙醇之后，我们发现甲醇提取效率最为突出，因此将甲醇作为提取溶剂的最终选择。
5.3这次的实验主要是为了探究葛粉类保健食品中大豆苷元功效成分含量的测量方法，为该类产品的质量掌控划定统一标准。由实验结果看来，由不同商家生产的同类产品大豆苷元的含量有着极大的差距，这也就反映出现在市场上此类产品的质量参差不齐的情况。此外，含量测定方法学实验结果显示，采用这种方法进行实验操作起来简单且测定结果精确，重复性较好，可将此方法在葛粉类的保健食品的质量掌控上多多加以应用。
参考文献
[1]Xu X，Wang H，Murphy PA，et al.Neither background diet nor type of soy food affects short-term isoflavone bioavailability in women.J Nutr，2000，130：798.
[2]Ekasin Anupongsanugool，Supanimit Teekachunhatean，Noppamas Rojanasthien，et al.Pharmacokinetics of isoflavones，daidzein and genistein，after ingestion of soy beverage compared with soy extract capsules in postmenopausal Thai women.BMC Clin.Pharm，2005，5：2.
[3]Adlercreutz H，Mazur W.Phyto-oestrogens and western diseases.Ann.Med，1997，29：95.
[4]Akiyama T，Ishida J，Nakagawa S，et al.Genistein，a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases.J Biol Chem，1987，262：5592.
[5]Wang H，Murphy PA，Isoflavone composition of American and Japanese soybeans in Iowa：effects of variety，crop year，and location.J Agri Food Chem，1994，42：1674.
[6]刘延敏，潘海宇，吴振刚.紫外分光光度法检测保健食品中大豆异黄酮的含量.第四军医大学学报，2006，27（2）：185
[7]王岙，于文海，杨明远，等.高效液相色谱法测定保健食品中大豆异黄酮.中国卫生检验杂志，2006，16（3）：23.
【关键词】RP-HPLC；大豆苷元；含量测定，葛粉
大豆异黄酮作为主要的植物雌激素，它有着和雌激素一样的功效，它不仅可以降低乳腺癌、前列腺癌的发病率，减轻更年期因雌激素缺乏而导致的停经期综合症和骨质疏松症，而且它还可以延缓衰老、预防心血管等多种疾病。大豆异黄酮引起国内外越来越多的注意和研讨，在我国，市场上出现很多含大豆异黄酮类成分的提取物、这些保健食品有的进口有的国产名目不一，质量也良莠不齐。我国的中药葛根和甘葛藤中含有葛根素、大豆苷元等大豆异黄酮类成分，该类药食同源的中药常加工成葛粉用于保健食品，具有很好的保健作用和市场价值。现在对葛根素对含量测定方法报道的文献较多，总结起来一般通过紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法对大豆异黄酮类提取物进行实验，以测定其异黄酮的含量[1-7]。我们为了更好地对一个产品进行评价以及更好的把握好质量关，故对葛粉中大豆苷元的含量测定方法进行更深入的实验，得到了令人满意的结果。
1仪器与试剂的选取
在这次实验中我们选取了Waters Alliance 2690高效液相色谱仪和DAD紫外检测器。大豆苷元对照品是中国药品生物制品检定所供给的，其纯度在98%以上。除了乙腈为色谱纯，实验中采用的其他溶剂均为分析纯，使用纯净水，过Millipore0.22μm的滤膜。五种葛粉样品都是市场在售的产品。
2色谱条件色谱柱
色谱柱Agilent zorbax SB-C18（4.6 mm×150mm，5μm），柱温设定 25 ℃；流速为1mL·min-1；流动相通过流动相A（0.1%甲酸）及流动相B（乙腈）按以下梯度实施洗脱：初状态为10%B相，0-18min内流动相B增至22%，18-25min内流动相B保持22%，25-43min内流动相B增至30%，43-45min内流动相B降至10%，保持5分钟；检测的波长258nm；理论塔板数以大豆苷元算高于2000。色谱图见图1。
3溶液的制备
3.1取一定量的大豆苷元对照品，称取过程要保证精准度，然后将甲醇加入制备成大豆苷元0.06 mg·mL-1的溶液，这就是我们实验中要用到的对照品溶液。
3.2依次精密称取样品细粉0.5g，将甲醇25ml加入，称重后进行三十分钟的超声处理，将其置于室温，再称重，缺失的重量用甲醇给予补足，使其充分均匀混合，再用0.45μm的微孔滤膜进行过滤，这就是我们实验中要用到的供试品溶液。
4方法与结果的分析
4.1分别将2.0，4.0，8.0，10.0，15.0μL，20.0μL的对照品溶液依次注入到液相色谱仪中，然后测量峰面积。峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，计算出的回归方程为Y=1.068×107 X-1.992×105，r=0.9998。这就说明大豆苷元在2.06-20.6μg范围内具备良好的线性关系。
4.2稳定性试验取供试品溶液10μL，吸取过程保证精准，每2小时.进样1次，6次之后测量峰面积，数据显示大豆苷元的RSD为1.03%，这也就说明12h内测定有稳定的结果。
4.3精密度实验取对照品溶液10μL，吸取过程保证精准，注入液相色谱仪然后测量峰面积，数据显示大豆苷元的RSD为（n=5）0.89%，这也就说明仪器十分精密。
4.4最低检测限和定量限将信噪比3：1作为标准测得大豆苷元的最低检测限为0.35μg。以信噪比10：1时的进样量作为定量限，测得大豆苷元的定量限为0.89μg。
4.5重复性实验将同一样品取出5份，用样品处理法依次测定6种成分的含量。结果大豆苷元的RSD为0.93%，实验数据说明该方法有良好的重复性。
4.6回收率试验此试验我们用的是加样回收率的方法。现有明确含量的样品，我们分别精确地取出共9份，平均分为三组，按高、中、低3个水平依次精确地加入一定量对照品，然后进行供试品溶液制备的操作，数据显示大豆苷元的回收率是97.29%（RSD 1.37%）。这也就说明通过这种方法对大豆苷元成分进行测量，有良好的回收率。
4.7样品测定按上文中提到的方法进行样品溶液的制备并测定，5种葛粉类保健食品（样品都是市售含葛粉产品，依次编号1，2，3，4，5）样品的测定结果，见表1。
5讨论
5.1研究发现，大豆苷元对照品溶液的最大吸收波长处于260±1nm，258nm处吸收值达到最高，故我们选取258nm为检测波长。
5.2提取方法的选择根据相关的文献提出再与大豆异黄酮自身的性质特点相结合，对超声提取和回流提取进行了对比，结果显示二者提取效率并无大的差异，而且超声提取方法更为简易，所以将其作为我们最终的选取。在考量了甲醇、乙醇、70%甲醇、50%甲醇和70%乙醇之后，我们发现甲醇提取效率最为突出，因此将甲醇作为提取溶剂的最终选择。
5.3这次的实验主要是为了探究葛粉类保健食品中大豆苷元功效成分含量的测量方法，为该类产品的质量掌控划定统一标准。由实验结果看来，由不同商家生产的同类产品大豆苷元的含量有着极大的差距，这也就反映出现在市场上此类产品的质量参差不齐的情况。此外，含量测定方法学实验结果显示，采用这种方法进行实验操作起来简单且测定结果精确，重复性较好，可将此方法在葛粉类的保健食品的质量掌控上多多加以应用。
参考文献
[1]Xu X，Wang H，Murphy PA，et al.Neither background diet nor type of soy food affects short-term isoflavone bioavailability in women.J Nutr，2000，130：798.
[2]Ekasin Anupongsanugool，Supanimit Teekachunhatean，Noppamas Rojanasthien，et al.Pharmacokinetics of isoflavones，daidzein and genistein，after ingestion of soy beverage compared with soy extract capsules in postmenopausal Thai women.BMC Clin.Pharm，2005，5：2.
[3]Adlercreutz H，Mazur W.Phyto-oestrogens and western diseases.Ann.Med，1997，29：95.
[4]Akiyama T，Ishida J，Nakagawa S，et al.Genistein，a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases.J Biol Chem，1987，262：5592.
[5]Wang H，Murphy PA，Isoflavone composition of American and Japanese soybeans in Iowa：effects of variety，crop year，and location.J Agri Food Chem，1994，42：1674.
[6]刘延敏，潘海宇，吴振刚.紫外分光光度法检测保健食品中大豆异黄酮的含量.第四军医大学学报，2006，27（2）：185
[7]王岙，于文海，杨明远，等.高效液相色谱法测定保健食品中大豆异黄酮.中国卫生检验杂志，2006，16（3）：23.