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摘要 [目的]对紫海胆肠道曲霉菌Aspergillus sp. HDf2的次生代谢产物进行抗海洋生物污损活性研究。[方法]采用摇瓶液体发酵，运用柱层析等方法， 从发酵液中分离、纯化获得4个γ丁烯酸内酯类单体化合物（-）-spiculisporic acid、spiculisporic acids B–D和1个secospiculisporic acid B，并且对其进行了抗藤壶幼虫附着活性测试。[结果]化合物spiculisporic acid B和secospiculisporic acid B在浓度为25 mg/L时均具有抗藤壶幼虫附着活性，其中化合物secospiculisporic acid B活性最强，其他化合物无活性。[结论]该研究首次报道它具有抗生物污损活性。
关键词 曲霉菌；海洋真菌；次生代谢产物；抗污损；藤壶
中图分类号 S917.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）25-08492-02
Abstract [Objective] Antifouling activity of the secondary metabolites from the sea urchin （Anthocidaris crassispina） associated fungus Aspergillus sp. HDf2 was investigated. [Method] Four γbutenolide derivatives， including （-）-spiculisporic acid， spiculisporic acids B–D， and one secospiculisporic acid B， were isolated from the filtrate of the fermented culture broth by chromatographic methods. Their antilarval settlement activity against barnacle Balanus amphitrite were tested.
[Result] Only two compounds， spiculisporic acid B and secospiculisporic acid B， were active against the larval settlement of Balanus amphitrite under 25 mg/L， in which secospiculisporic acid B showed the strongest activity. [Conclusion] The antifouling acitivity of these compounds were reported here for the first time.
Key words Aspergillus sp.； Marine fungus； Secondary metabolites； Antifouling； Balanus amphitrite
在人类开发利用海洋的历史进程中，海洋生物污损一直是困扰海洋运输、海洋工程和海洋渔业的重大难题之一，如加速污损生物附着基材的腐蚀、堵塞滨海发电厂和舰船的冷却水管道、增加船体粗糙度、堵塞海水养殖网箱网眼导致水流不畅，进而影响养殖产量和质量[1]。天然产物已被证明是有前途的环保型抗污损剂[2-4]。海洋真菌能够产生结构与活性多样的天然产物，诸如抗菌、抗肿瘤、抗病毒的萜类和聚酮类化合物[5-8]。前人已从海绵、珊瑚和海藻中分离得到许多具有强抗污损活性的天然产物[2，9]，而目前对于海洋真菌抗海洋污损生物的次生代谢产物的研究相对较少。由于真菌代谢产物丰富，活性多样，它可能产生具有抗污损活性的代谢产物。笔者前期从一株紫海胆肠道真菌Aspergillus sp. HDf2 的代谢产物中分离、鉴定了一系列具有抗菌活性的新型刺孢青霉素类化合物[8，10]，其结构与具有抗多种海洋生物污损活性的丁烯酸内酯类化合物如5octylfuran2（5H）one类似[11-12]。根据它们的结构特征，推断该类新型刺孢青霉素类化合物可能也具有抗海洋生物污损活性。笔者从该菌中分离富集该类型化合物（图1），对其抗藤壶幼虫附着活性进行报道。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
仪器与试剂。减压浓缩使用旋转蒸发仪EYELA N1000；高分辨质谱由Agilent 6210 TOF LCMS质谱仪测定；化合物1H和13CNMR数据由Bruker DRX500核磁共振波谱仪测定，以TMS为内标；层析柱硅胶（200～300目）和薄层层析硅胶（GF254）均为青岛海洋化工厂出品；Sephadex LH20和ODS反相硅胶分别购自瑞士GE Healthcare BioSciences和日本YMC公司；HPLC实验中使用色谱试剂购自美国Tedia Company Inc.。其余试验使用试剂均为分析纯。
1.1.2
培养基。真菌培养与保存用培养基为麦芽培养基（MEA）平板，即麦芽20 g、蔗糖20 g、蛋白胨1 g、琼脂条20 g、水1 000 ml。麦芽沸水煮30 min后，过滤，定容，分装。发酵培养基为液体MEA。
1.1.3
菌株。真菌Aspergillus sp. HDf2是笔者先前从我国海南琼海海岸采集的紫海胆肠道中分离、纯化得到[8]。
1.2 方法
1.2.1
菌株的发酵。Aspergillus sp. HDf2经MEA平板活化，培养条件为28 ℃，暗培养7 d，之后取菌块直接接种于液体MEA培养基中，每瓶液体培养基400 ml，共接种40瓶三角烧瓶（1 000 ml），于三层摇床上培养13 d（140 r/min，28 ℃）。 1.2.3
化合物抗藤壶幼虫附着活性测试。 藤壶无节幼虫在28 ℃下用硅藻Chaetoceros gracilis Schutt喂养，约4 d后发育至金星幼虫阶段。将金星幼虫过滤并保存在0.22 μm滤膜过滤的海水中，同时将幼虫放置在4 ℃冰箱中过夜待用。在活性测试中，化合物用DMSO配制成0、5、25 mg/L浓度。将24孔板中每个孔放置1 ml待测溶液，然后将15只藤壶幼虫轻轻地转移至每个含有待测溶液的孔中进行测试。将1 μl DMSO加到1 ml过滤海水中，同时每个孔放15只幼虫作为阴性对照组。将测试板放置于28 ℃培养箱中，暗培养48 h。在培养结束后，将24孔板放置在显微镜下观察，记录游动、附着和死亡的幼虫。附着的幼虫个数与总幼虫个数的比值就是附着率。每个样品在每个浓度下测试，3次重复。
2 结果与分析
从紫海胆肠道真菌Aspergillus sp. HDf2的发酵产物中分离纯化得到5个单体化合物，即（-）-spiculisporic acid，spiculisporic acid B，spiculisporic acid C，spiculisporic acid D和secospiculisporic acid B。在抗藤壶幼虫附着活性测试中，发现它们在浓度为25 mg/L时，藤壶幼虫的附着率分别为0.903 089、0.826 389、0.959 091、0.903 030和0.798 718，p值（指与对照的显著性差异值）分别为0.692 668、0.044 253、0.244 331、0.713 679和0.024 303，其中spiculisporic acid B和secospiculisporic acid B的p值分别为0.044 253和0.024 303，均小于0.05，与对照存在0.05水平显著性差异，二者均具有抗藤壶幼虫附着活性，其中secospiculisporic acid B活性最强，而（-）-spiculisporic acid，spiculisporic acid C和spiculisporic acid D无活性。secospiculisporic acid B的化学结构与其他化合物的结构主要区别在于其为内酯开环化合物，可能该开环结构有助于其抗藤壶幼虫附着活性。这与前期抗金黄色葡萄球菌活性结果不同。在20 mg/ml浓度下，它们均具有弱抗菌活性，表明内酯开环与闭环不影响其抗菌活性，但影响其抗菌活性强度。前人研究结果显示，该类化合物的活性与内酯环存在相关关系，即活性成分主要是内酯开环类化合物[13-14]。这与该研究结果存在差异。前期根据其结构推断该类化合物具有抗海洋生物污损活性，而研究结果只显示紫
海胆肠道真菌Aspergillus sp. HDf2的发酵产物spiculisporic acid B和secospiculisporic acid B具有抗污损活性，其他化合物无活性。这可能是由于丁烯酸内酯类化合物如5octylfuran2（5H）one[11-12]内酯环中的α，β不饱和双键对抗海洋生物污损活性具有重要贡献。海洋污损生物还有苔藓虫、海藻等。下一步工作将扩大活性化合物抗污损生物范围，期望能获得抗海洋生物污损活性侯选化合物，应用于海洋运输、海洋工程及海洋渔业，减少海洋污损生物对人类经济活动产生的严重影响。
参考文献
[1] 黄宗国，蔡如星.海洋污损生物及其防除[M].北京：海洋出版社，1984.
[2] FUSETANI N.Biofouling and antifouling[J].Nat Prod Rep，2004，21（1）：94-104.
[3] FUSETANI N.Antifouling marine natural products[J].Nat Prod Rep，2011，28（2）：400-410.
[4] HAN Z，SUN J，ZHANG Y，et al.iTRAQbased proteomic profiling of the barnacle Balanus amphitrite in response to the antifouling compound meleagrin[J].J Proteome Res，2013，12（5）：2090-2100.
[5] RATEB M E，EBEL R.Secondary metabolites of fungi from marine habitats[J].Nat Prod Rep，2011，28（2）：290-344.
[6] LI D，XU Y，SHAO C L，et al.Antibacterial bisabolanetype sesquiterpenoids from the spongederived fungus Aspergillus sp.[J].Mar Drugs，2012，10（1）：234-241.
[7] WANG J F，LIU P P，WANG Y，et al.Antimicrobial aromatic polyketides from gorgonianassociated fungus，Penicillium commune 518[J].Chin J Chem，2012，30（6）：1236-1242.
[8] WANG R，LIU T M，SHEN M H，et al.Spiculisporic acids BD，three new γbutenolide derivatives from a sea urchinderived fungus Aspergillus sp.HDf2[J].Molecules，2012，17（11）：13175-13182. [9] ARMSTRONG E，BOYD K G，BURGESS J G.Prevention of marine biofouling using natural compounds from marine organisms[J].Biotechnol Annu Rev，2000，6：221-241.
[10] WANG R，FU Z D，HE X N，et al.New secondary metabolites produced by the marinederived fungus Aspergillus sp.HDf2[J].Chin J Tropical Agriculture，2014，in press.
[11] ZHANG Y F，ZHANG H M，HE L S，et al.Butenolide inhibits marine fouling by altering the primary metabolism of three target organisms[J].ACS Chem Biol，2012，7：1049-1058.
[12] XU Y，HE H P，SCHULZ S，et al.Potent antifouling compounds produced by marine Streptomyces[J].Bioresource Technol，2010，101：1331-1336.
[13] PEKDEMIR T，TOKUNAGA S，ISHIGAMI Y，et al.Removal of cadmium or lead from polluted water by biological amphiphiles[J].J Surfactants Deterg，2000，3（1）：43-46.
[14] BROWN S P，GOODWIN N C，MACMILLAN D W C.The first enantioselective organocatalytic MukaiyamaMichael reaction：a direct method for the synthesis of enantioenriched γbutenolide architecture[J].J Am Chem Soc，2003，125（5）：1192-1194.
关键词 曲霉菌；海洋真菌；次生代谢产物；抗污损；藤壶
中图分类号 S917.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）25-08492-02
Abstract [Objective] Antifouling activity of the secondary metabolites from the sea urchin （Anthocidaris crassispina） associated fungus Aspergillus sp. HDf2 was investigated. [Method] Four γbutenolide derivatives， including （-）-spiculisporic acid， spiculisporic acids B–D， and one secospiculisporic acid B， were isolated from the filtrate of the fermented culture broth by chromatographic methods. Their antilarval settlement activity against barnacle Balanus amphitrite were tested.
[Result] Only two compounds， spiculisporic acid B and secospiculisporic acid B， were active against the larval settlement of Balanus amphitrite under 25 mg/L， in which secospiculisporic acid B showed the strongest activity. [Conclusion] The antifouling acitivity of these compounds were reported here for the first time.
Key words Aspergillus sp.； Marine fungus； Secondary metabolites； Antifouling； Balanus amphitrite
在人类开发利用海洋的历史进程中，海洋生物污损一直是困扰海洋运输、海洋工程和海洋渔业的重大难题之一，如加速污损生物附着基材的腐蚀、堵塞滨海发电厂和舰船的冷却水管道、增加船体粗糙度、堵塞海水养殖网箱网眼导致水流不畅，进而影响养殖产量和质量[1]。天然产物已被证明是有前途的环保型抗污损剂[2-4]。海洋真菌能够产生结构与活性多样的天然产物，诸如抗菌、抗肿瘤、抗病毒的萜类和聚酮类化合物[5-8]。前人已从海绵、珊瑚和海藻中分离得到许多具有强抗污损活性的天然产物[2，9]，而目前对于海洋真菌抗海洋污损生物的次生代谢产物的研究相对较少。由于真菌代谢产物丰富，活性多样，它可能产生具有抗污损活性的代谢产物。笔者前期从一株紫海胆肠道真菌Aspergillus sp. HDf2 的代谢产物中分离、鉴定了一系列具有抗菌活性的新型刺孢青霉素类化合物[8，10]，其结构与具有抗多种海洋生物污损活性的丁烯酸内酯类化合物如5octylfuran2（5H）one类似[11-12]。根据它们的结构特征，推断该类新型刺孢青霉素类化合物可能也具有抗海洋生物污损活性。笔者从该菌中分离富集该类型化合物（图1），对其抗藤壶幼虫附着活性进行报道。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
仪器与试剂。减压浓缩使用旋转蒸发仪EYELA N1000；高分辨质谱由Agilent 6210 TOF LCMS质谱仪测定；化合物1H和13CNMR数据由Bruker DRX500核磁共振波谱仪测定，以TMS为内标；层析柱硅胶（200～300目）和薄层层析硅胶（GF254）均为青岛海洋化工厂出品；Sephadex LH20和ODS反相硅胶分别购自瑞士GE Healthcare BioSciences和日本YMC公司；HPLC实验中使用色谱试剂购自美国Tedia Company Inc.。其余试验使用试剂均为分析纯。
1.1.2
培养基。真菌培养与保存用培养基为麦芽培养基（MEA）平板，即麦芽20 g、蔗糖20 g、蛋白胨1 g、琼脂条20 g、水1 000 ml。麦芽沸水煮30 min后，过滤，定容，分装。发酵培养基为液体MEA。
1.1.3
菌株。真菌Aspergillus sp. HDf2是笔者先前从我国海南琼海海岸采集的紫海胆肠道中分离、纯化得到[8]。
1.2 方法
1.2.1
菌株的发酵。Aspergillus sp. HDf2经MEA平板活化，培养条件为28 ℃，暗培养7 d，之后取菌块直接接种于液体MEA培养基中，每瓶液体培养基400 ml，共接种40瓶三角烧瓶（1 000 ml），于三层摇床上培养13 d（140 r/min，28 ℃）。 1.2.3
化合物抗藤壶幼虫附着活性测试。 藤壶无节幼虫在28 ℃下用硅藻Chaetoceros gracilis Schutt喂养，约4 d后发育至金星幼虫阶段。将金星幼虫过滤并保存在0.22 μm滤膜过滤的海水中，同时将幼虫放置在4 ℃冰箱中过夜待用。在活性测试中，化合物用DMSO配制成0、5、25 mg/L浓度。将24孔板中每个孔放置1 ml待测溶液，然后将15只藤壶幼虫轻轻地转移至每个含有待测溶液的孔中进行测试。将1 μl DMSO加到1 ml过滤海水中，同时每个孔放15只幼虫作为阴性对照组。将测试板放置于28 ℃培养箱中，暗培养48 h。在培养结束后，将24孔板放置在显微镜下观察，记录游动、附着和死亡的幼虫。附着的幼虫个数与总幼虫个数的比值就是附着率。每个样品在每个浓度下测试，3次重复。
2 结果与分析
从紫海胆肠道真菌Aspergillus sp. HDf2的发酵产物中分离纯化得到5个单体化合物，即（-）-spiculisporic acid，spiculisporic acid B，spiculisporic acid C，spiculisporic acid D和secospiculisporic acid B。在抗藤壶幼虫附着活性测试中，发现它们在浓度为25 mg/L时，藤壶幼虫的附着率分别为0.903 089、0.826 389、0.959 091、0.903 030和0.798 718，p值（指与对照的显著性差异值）分别为0.692 668、0.044 253、0.244 331、0.713 679和0.024 303，其中spiculisporic acid B和secospiculisporic acid B的p值分别为0.044 253和0.024 303，均小于0.05，与对照存在0.05水平显著性差异，二者均具有抗藤壶幼虫附着活性，其中secospiculisporic acid B活性最强，而（-）-spiculisporic acid，spiculisporic acid C和spiculisporic acid D无活性。secospiculisporic acid B的化学结构与其他化合物的结构主要区别在于其为内酯开环化合物，可能该开环结构有助于其抗藤壶幼虫附着活性。这与前期抗金黄色葡萄球菌活性结果不同。在20 mg/ml浓度下，它们均具有弱抗菌活性，表明内酯开环与闭环不影响其抗菌活性，但影响其抗菌活性强度。前人研究结果显示，该类化合物的活性与内酯环存在相关关系，即活性成分主要是内酯开环类化合物[13-14]。这与该研究结果存在差异。前期根据其结构推断该类化合物具有抗海洋生物污损活性，而研究结果只显示紫
海胆肠道真菌Aspergillus sp. HDf2的发酵产物spiculisporic acid B和secospiculisporic acid B具有抗污损活性，其他化合物无活性。这可能是由于丁烯酸内酯类化合物如5octylfuran2（5H）one[11-12]内酯环中的α，β不饱和双键对抗海洋生物污损活性具有重要贡献。海洋污损生物还有苔藓虫、海藻等。下一步工作将扩大活性化合物抗污损生物范围，期望能获得抗海洋生物污损活性侯选化合物，应用于海洋运输、海洋工程及海洋渔业，减少海洋污损生物对人类经济活动产生的严重影响。
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[8] WANG R，LIU T M，SHEN M H，et al.Spiculisporic acids BD，three new γbutenolide derivatives from a sea urchinderived fungus Aspergillus sp.HDf2[J].Molecules，2012，17（11）：13175-13182. [9] ARMSTRONG E，BOYD K G，BURGESS J G.Prevention of marine biofouling using natural compounds from marine organisms[J].Biotechnol Annu Rev，2000，6：221-241.
[10] WANG R，FU Z D，HE X N，et al.New secondary metabolites produced by the marinederived fungus Aspergillus sp.HDf2[J].Chin J Tropical Agriculture，2014，in press.
[11] ZHANG Y F，ZHANG H M，HE L S，et al.Butenolide inhibits marine fouling by altering the primary metabolism of three target organisms[J].ACS Chem Biol，2012，7：1049-1058.
[12] XU Y，HE H P，SCHULZ S，et al.Potent antifouling compounds produced by marine Streptomyces[J].Bioresource Technol，2010，101：1331-1336.
[13] PEKDEMIR T，TOKUNAGA S，ISHIGAMI Y，et al.Removal of cadmium or lead from polluted water by biological amphiphiles[J].J Surfactants Deterg，2000，3（1）：43-46.
[14] BROWN S P，GOODWIN N C，MACMILLAN D W C.The first enantioselective organocatalytic MukaiyamaMichael reaction：a direct method for the synthesis of enantioenriched γbutenolide architecture[J].J Am Chem Soc，2003，125（5）：1192-1194.