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摘要
[目的]建立用于鉴别及测定1，3二甲基5吡唑酮（DP）的高效液相色谱（HPLC）方法。[方法]采用高效液相色谱仪定量测定DP，对其色谱条件进行优化。[结果]测定DP的最佳色谱条件如下：色谱柱DiamonsilC18 （2）（250.0 mm×4.6 mm×5 μm），甲醇和水为流动相，DAD检测器，检测波长为242 nm，流速为0.4 ml/min，柱温35 ℃。在上述条件下，DP得到很好的分离，在给定的浓度范围内呈现良好的线性相关（r2>0.999），精密度良好，回收率为98.74%，相对标准偏差为1.6%。[结论]该方法具有良好的灵敏度、回收率和重复性，可用于DP的鉴别及测定。
关键词1，3二甲基5吡唑酮；高效液相色谱；条件优化
中图分类号O652.63文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）14-093-03
Abstract [Objective] The aim was to establish a method of quantitative determination of 1，3dimethyl5pyrazolone by high performance liquid chromatography.[Method] The reversed phase high performance liquid chromatography （HPLC） was applied to identification and determination of DP.[Result] SHIMADZU SPD20A system equipped with on line degasser was used，Diamonsil reversed phaseC18（2） （250.0 mm×4.6 mm×5 μm） column as stationary phase，methyl alcohol and water as mobile phase.The flow rate was 0.4 ml/min； the column temperature was 35 ℃； and the detection wavelength was 242 nm.DP had a good resolution within 10 min.In the given concentration range，DP presented good linear correlation （r2>0.999）； the recovery rate was 98.74%，and the RSD of repeatability was 1.6%.[Conclusion] The sensitivity，recovery and repeatability of this method are good.This method can be used for the identification and determination of DP.
Key words 1，3dimethyl5pyrazolone； High performance liquid chromatography （HPLC）； Condition optimization
1，3二甲基5吡唑酮，即DP，其结构式见图1，它是合成医药、农药霸螨灵、除草剂吡唑特和染料等的重要中间体，用途广泛[1]。生产过程中实时检测DP的含量，对跟踪反应进程、控制产品质量意义重大，但目前对DP的测定方法少见报道。HPLC法以其高速、高效、高灵敏度等特点，在水质分析[2]、药物分析[3]、药品检验[4]、食品检测[5]以及蛋白质分离[6]、代谢组学研究[7]中发挥了巨大作用。笔者利用HPLC方法测定了DP含量，旨在为DP的鉴别及测定提供参考。
1.1材料
岛津高效液相色谱仪（SPD20A），配备二极管阵列检测器；1号柱DiamonsilC18（2）（250.0 mm×4.6 mm×5 μm），2号柱phemsorb ODS1 5u ID4.6 94030506，3号柱SymmetryC18（150.0 mm×4.6 mm×5 μm）。甲醇、乙腈均为色谱纯；磷酸、聚乙二醇、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、乙酸铵、三乙胺均为分析纯。试验用水为纯净水。DP由江苏剑牌农药有限公司提供。
1.2方法
1.2.1标准溶液的配制。DP样品储备液：称取0.04 g DP标样于50 ml容量瓶中，甲醇定容。
1.2.2色谱条件。
采用DiamonsilC18（2）色谱柱（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）；检测波长242 nm；流速0.4 ml/min；进样量20 μl；柱温35 ℃、溶剂甲醇；流动相为甲醇-水（3∶1，V/V）。
2结果与分析
2.1色谱条件的选择
为了使被测物质与杂质很好地分离测定，选择合适的色谱条件是必要的。其中影响高效液相色谱技术的因素包括流动相、检测波长、流速、柱温、固定相等[8-11]。
2.1.1流动相的选择。
在DiamonsilC18（2）色谱柱（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）、检测波长为250 nm、流速为0.5 ml/min、进样量为20 μl、柱温为35 ℃、溶剂为甲醇的条件下，对DP标样进行流动相甲醇+水的不同比例测试，结果见图2。综合考虑拖尾因子与分离度的影响，选取甲醇-水（3∶1，V/V）为最适流动相配比，该条件下拖尾因子在0.8左右，分离度在1.4左右，色谱见图3。
2.1.2检测波长的选择。
采用DAD二极管阵列检测器对DP标样进行紫外扫描发现，DP的紫外吸收波段为220～250 nm，且在227 nm波长处有最大吸收。因此，在该波段内选取不同检测波长对DP标样进行分离测试，结果见图4。 在检测波长为242 nm条件下，分离度虽比其他波长略小，但其响应值最大，样品峰形要比其他波长下好。因此选取检测波长为242 nm。
2.1.3流速的选择。
流动相流速的变化对以相对法定量的归一化法、内标法和标准加入法的定量分析结果无影响，而对标准曲线法的定量分析结果会产生影响。流速降到1.0 ml/min以下时，通常可以提高柱效。
2.1.5色谱柱的选择。
不同色谱柱的分离情况有显著差别。在波长为242 nm、进样量为20 μl、柱温为35 ℃、溶剂甲醇、流速为0.4 ml/min、流动相为甲醇-水（3∶1，V/V）的条件下，对DP标样进行不同的色谱柱条件测试。由表3可知，2号、3号柱条件下，虽然DP出峰时间短且分离度较1号柱大，但其拖尾因子较大，峰形较大，选取1号柱即DiamonsilC18（2）（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）作为定量检测DP的最佳色谱柱。
2.1.6流动相的优化。
为进一步改善峰形、提高分离度，尝试在流动相的水中加酸、碱或者盐。在DiamonsilC18（2）色谱柱（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）、波长为242 nm、进样量为20 μl、柱温为35 ℃、溶剂为甲醇、流速为0.4 ml/min、流动相为甲醇-水（3∶1，V/V）的条件下，在水相中添加不同物质对DP标样进行测试。由表4可知，在水中添加0.100%磷酸二氢钾、0.100%磷酸氢二钠、0.100%乙酸铵以及不同浓度的磷酸时，出峰时间并无显著变化，但其拖尾因子几乎都增大，分离度皆减小。添加三乙胺虽然显著提高了分离度，但会对色谱柱产生损坏。综合各方面考虑，流动相仍然为甲醇-水（3∶1，V/V），不添加其他物质。
综合以上试验测定，最终确定了测定DP的最佳色谱条件如下：色谱柱为DiamonsilC18 （2）（250.0 mm×4.6 mm×5 μm），甲醇-水（3∶1，V/V）为流动相，DAD检测器，检测波长为242 nm，流速为0.4 ml/min，柱温为35 ℃，在该条件下DP色谱见图5。
2.2分析方法试验
2.2.1线性关系验证。
用甲醇做溶剂，分别配制浓度为0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mg/ml标准品工作溶液，进样量20 μl，以质量浓度（mg/ml）为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归分析（图6），得到相关系数r2=0.993 1，表明DP在0.2～2.2 mg/ml浓度范围内线性关系良好，在该条件下可以很好地测定DP含量。
2.2.2精密度。
对同一样品连续进样6次，测得DP含量分别为89.82%、89.24%、89.97%、89.30%、89.51%和89.00%，平均含量为89.47%，标准偏差为0.367 9，相对标准偏差为0.41%，小于2.00%，表明该方法精密度良好。
2.2.3回收率。
由表5可知，DP的平均回收率为98.74%，相对标准偏差为1.60%，表明采用该方法测定DP含量的准确度较高。
3结论
试验建立了用于鉴别及测定DP的高效液相色谱方法。该方法简单易操作，DP得到很好的分离，在给定的浓度范围内呈现良好的线性相关（r2大于0.999），精密度良好（RSD小于2.00%），回收率为98.74%，相对标准偏差为1.60%，表明该方法具有良好的灵敏度、回收率和重复性，可用于DP的鉴别及测定。
43卷14期张立洁等高效液相色谱法定量测定1，3二甲基5吡唑酮的方法建立
参考文献
[1]
梅盛开，程渝祖，高忠潮.1，3二甲基5吡唑酮的合成研究[J].陕西化工，1985（2）：8-10.
[2] 刘益片.高效液相色谱技术在水质分析中的应用[J].化工管理，2013（12）：78-79.
[3] 刘慧明.高效液相色谱技术及其在药物分析中的应用[J].中国现代医生，2007（20）：155-156.
[4] 辛颖.高效液相色谱技术在药品检验中的应用及进展探讨[J].黑龙江科技信息，2012（31）：15.
[5] 单羽.高效液相色谱技术在食品检测中的应用[J].科技创新与应用，2014（8）：82.
[6] 高明霞，关霞，洪广峰，等.多维高效液相色谱技术在蛋白质分离研究中的进展[J].色谱，2009（5）：551-555.
[7] 谢跃生，潘桂湘，高秀梅，等.高效液相色谱技术在代谢组学研究中的应用[J].分析化学，2006（11）：1644-1648.
[8] 谢沐风.如何建立高效液相色谱法测定有关物质的方法[J].中国医药工业杂志，2007（1）：45-48.
[9] 赵轶男.高效液相色谱技术（HPLC）影响因素的选择[J].分析试验室，2007（S1）：340-341.
[10] 谢沐风，罗霞萍，陈亚美.如何建立HPLC法测定有关物质的方法[J].中国药品标准，2002（6）：6-8.
[11] 李青，谭红，袁鑫，等.高效液相色谱法测定核桃青皮中胡桃醌的含量[J].江苏农业科学，2014（1）：259-261.
[目的]建立用于鉴别及测定1，3二甲基5吡唑酮（DP）的高效液相色谱（HPLC）方法。[方法]采用高效液相色谱仪定量测定DP，对其色谱条件进行优化。[结果]测定DP的最佳色谱条件如下：色谱柱DiamonsilC18 （2）（250.0 mm×4.6 mm×5 μm），甲醇和水为流动相，DAD检测器，检测波长为242 nm，流速为0.4 ml/min，柱温35 ℃。在上述条件下，DP得到很好的分离，在给定的浓度范围内呈现良好的线性相关（r2>0.999），精密度良好，回收率为98.74%，相对标准偏差为1.6%。[结论]该方法具有良好的灵敏度、回收率和重复性，可用于DP的鉴别及测定。
关键词1，3二甲基5吡唑酮；高效液相色谱；条件优化
中图分类号O652.63文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）14-093-03
Abstract [Objective] The aim was to establish a method of quantitative determination of 1，3dimethyl5pyrazolone by high performance liquid chromatography.[Method] The reversed phase high performance liquid chromatography （HPLC） was applied to identification and determination of DP.[Result] SHIMADZU SPD20A system equipped with on line degasser was used，Diamonsil reversed phaseC18（2） （250.0 mm×4.6 mm×5 μm） column as stationary phase，methyl alcohol and water as mobile phase.The flow rate was 0.4 ml/min； the column temperature was 35 ℃； and the detection wavelength was 242 nm.DP had a good resolution within 10 min.In the given concentration range，DP presented good linear correlation （r2>0.999）； the recovery rate was 98.74%，and the RSD of repeatability was 1.6%.[Conclusion] The sensitivity，recovery and repeatability of this method are good.This method can be used for the identification and determination of DP.
Key words 1，3dimethyl5pyrazolone； High performance liquid chromatography （HPLC）； Condition optimization
1，3二甲基5吡唑酮，即DP，其结构式见图1，它是合成医药、农药霸螨灵、除草剂吡唑特和染料等的重要中间体，用途广泛[1]。生产过程中实时检测DP的含量，对跟踪反应进程、控制产品质量意义重大，但目前对DP的测定方法少见报道。HPLC法以其高速、高效、高灵敏度等特点，在水质分析[2]、药物分析[3]、药品检验[4]、食品检测[5]以及蛋白质分离[6]、代谢组学研究[7]中发挥了巨大作用。笔者利用HPLC方法测定了DP含量，旨在为DP的鉴别及测定提供参考。
1.1材料
岛津高效液相色谱仪（SPD20A），配备二极管阵列检测器；1号柱DiamonsilC18（2）（250.0 mm×4.6 mm×5 μm），2号柱phemsorb ODS1 5u ID4.6 94030506，3号柱SymmetryC18（150.0 mm×4.6 mm×5 μm）。甲醇、乙腈均为色谱纯；磷酸、聚乙二醇、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、乙酸铵、三乙胺均为分析纯。试验用水为纯净水。DP由江苏剑牌农药有限公司提供。
1.2方法
1.2.1标准溶液的配制。DP样品储备液：称取0.04 g DP标样于50 ml容量瓶中，甲醇定容。
1.2.2色谱条件。
采用DiamonsilC18（2）色谱柱（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）；检测波长242 nm；流速0.4 ml/min；进样量20 μl；柱温35 ℃、溶剂甲醇；流动相为甲醇-水（3∶1，V/V）。
2结果与分析
2.1色谱条件的选择
为了使被测物质与杂质很好地分离测定，选择合适的色谱条件是必要的。其中影响高效液相色谱技术的因素包括流动相、检测波长、流速、柱温、固定相等[8-11]。
2.1.1流动相的选择。
在DiamonsilC18（2）色谱柱（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）、检测波长为250 nm、流速为0.5 ml/min、进样量为20 μl、柱温为35 ℃、溶剂为甲醇的条件下，对DP标样进行流动相甲醇+水的不同比例测试，结果见图2。综合考虑拖尾因子与分离度的影响，选取甲醇-水（3∶1，V/V）为最适流动相配比，该条件下拖尾因子在0.8左右，分离度在1.4左右，色谱见图3。
2.1.2检测波长的选择。
采用DAD二极管阵列检测器对DP标样进行紫外扫描发现，DP的紫外吸收波段为220～250 nm，且在227 nm波长处有最大吸收。因此，在该波段内选取不同检测波长对DP标样进行分离测试，结果见图4。 在检测波长为242 nm条件下，分离度虽比其他波长略小，但其响应值最大，样品峰形要比其他波长下好。因此选取检测波长为242 nm。
2.1.3流速的选择。
流动相流速的变化对以相对法定量的归一化法、内标法和标准加入法的定量分析结果无影响，而对标准曲线法的定量分析结果会产生影响。流速降到1.0 ml/min以下时，通常可以提高柱效。
2.1.5色谱柱的选择。
不同色谱柱的分离情况有显著差别。在波长为242 nm、进样量为20 μl、柱温为35 ℃、溶剂甲醇、流速为0.4 ml/min、流动相为甲醇-水（3∶1，V/V）的条件下，对DP标样进行不同的色谱柱条件测试。由表3可知，2号、3号柱条件下，虽然DP出峰时间短且分离度较1号柱大，但其拖尾因子较大，峰形较大，选取1号柱即DiamonsilC18（2）（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）作为定量检测DP的最佳色谱柱。
2.1.6流动相的优化。
为进一步改善峰形、提高分离度，尝试在流动相的水中加酸、碱或者盐。在DiamonsilC18（2）色谱柱（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）、波长为242 nm、进样量为20 μl、柱温为35 ℃、溶剂为甲醇、流速为0.4 ml/min、流动相为甲醇-水（3∶1，V/V）的条件下，在水相中添加不同物质对DP标样进行测试。由表4可知，在水中添加0.100%磷酸二氢钾、0.100%磷酸氢二钠、0.100%乙酸铵以及不同浓度的磷酸时，出峰时间并无显著变化，但其拖尾因子几乎都增大，分离度皆减小。添加三乙胺虽然显著提高了分离度，但会对色谱柱产生损坏。综合各方面考虑，流动相仍然为甲醇-水（3∶1，V/V），不添加其他物质。
综合以上试验测定，最终确定了测定DP的最佳色谱条件如下：色谱柱为DiamonsilC18 （2）（250.0 mm×4.6 mm×5 μm），甲醇-水（3∶1，V/V）为流动相，DAD检测器，检测波长为242 nm，流速为0.4 ml/min，柱温为35 ℃，在该条件下DP色谱见图5。
2.2分析方法试验
2.2.1线性关系验证。
用甲醇做溶剂，分别配制浓度为0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mg/ml标准品工作溶液，进样量20 μl，以质量浓度（mg/ml）为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归分析（图6），得到相关系数r2=0.993 1，表明DP在0.2～2.2 mg/ml浓度范围内线性关系良好，在该条件下可以很好地测定DP含量。
2.2.2精密度。
对同一样品连续进样6次，测得DP含量分别为89.82%、89.24%、89.97%、89.30%、89.51%和89.00%，平均含量为89.47%，标准偏差为0.367 9，相对标准偏差为0.41%，小于2.00%，表明该方法精密度良好。
2.2.3回收率。
由表5可知，DP的平均回收率为98.74%，相对标准偏差为1.60%，表明采用该方法测定DP含量的准确度较高。
3结论
试验建立了用于鉴别及测定DP的高效液相色谱方法。该方法简单易操作，DP得到很好的分离，在给定的浓度范围内呈现良好的线性相关（r2大于0.999），精密度良好（RSD小于2.00%），回收率为98.74%，相对标准偏差为1.60%，表明该方法具有良好的灵敏度、回收率和重复性，可用于DP的鉴别及测定。
43卷14期张立洁等高效液相色谱法定量测定1，3二甲基5吡唑酮的方法建立
参考文献
[1]
梅盛开，程渝祖，高忠潮.1，3二甲基5吡唑酮的合成研究[J].陕西化工，1985（2）：8-10.
[2] 刘益片.高效液相色谱技术在水质分析中的应用[J].化工管理，2013（12）：78-79.
[3] 刘慧明.高效液相色谱技术及其在药物分析中的应用[J].中国现代医生，2007（20）：155-156.
[4] 辛颖.高效液相色谱技术在药品检验中的应用及进展探讨[J].黑龙江科技信息，2012（31）：15.
[5] 单羽.高效液相色谱技术在食品检测中的应用[J].科技创新与应用，2014（8）：82.
[6] 高明霞，关霞，洪广峰，等.多维高效液相色谱技术在蛋白质分离研究中的进展[J].色谱，2009（5）：551-555.
[7] 谢跃生，潘桂湘，高秀梅，等.高效液相色谱技术在代谢组学研究中的应用[J].分析化学，2006（11）：1644-1648.
[8] 谢沐风.如何建立高效液相色谱法测定有关物质的方法[J].中国医药工业杂志，2007（1）：45-48.
[9] 赵轶男.高效液相色谱技术（HPLC）影响因素的选择[J].分析试验室，2007（S1）：340-341.
[10] 谢沐风，罗霞萍，陈亚美.如何建立HPLC法测定有关物质的方法[J].中国药品标准，2002（6）：6-8.
[11] 李青，谭红，袁鑫，等.高效液相色谱法测定核桃青皮中胡桃醌的含量[J].江苏农业科学，2014（1）：259-261.