【摘 要】
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内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Endo-β-N-acetylglucosaminidase,ENGase,EC3.2.1.96)是糖蛋白去糖基化重要的工具酶,其可以切割糖蛋白上N-连接的聚糖.本研究基于粪肠球菌(En
【机 构】
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西北农林科技大学生命科学学院,杨凌,712100西北农林科技大学生命科学学院,杨凌712100;广州市从化区从化中学,广州510900;
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内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Endo-β-N-acetylglucosaminidase,ENGase,EC3.2.1.96)是糖蛋白去糖基化重要的工具酶,其可以切割糖蛋白上N-连接的聚糖.本研究基于粪肠球菌(Enterococcus aecalis)基因组数据,通过PCR扩增ENGase基因endoE (endoglycosidase E),并以同源重组方式构建表达载体pET-28a-endoE,实现了EndoE在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 Star (DE3)中的高效表达,并对EndoE去糖化的催化特性等进行了较为系统的分析.研究结果显示,重组EndoE在大肠杆菌中以可溶形式表达,经钴离子螯合层析与阴离子交换层析可获得高纯度的目标蛋白,产量为45.6 mg/L.去糖基化活性分析表明,重组EndoE能去除天然及变性核糖核苷酸酶B(ribonuclease B,RNase B)、鸡卵白蛋白(ovalbumin,Ova)和免疫球蛋白G (immune globulin G,IgG) N-连接的糖基侧链.基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱证实了EndoE对RNase B N-连接糖链的水解活性.EndoE在20～50℃和pH 4.0～6.0的范围内均具有良好的水解活性,并对100 mmol/L二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)、1 mol/L NaC1和2％ Triton X-100具有耐受性.EndoE较已报道的粪肠球菌来源的ENGase具有更为广泛的底物作用范围,是蛋白质糖基化分析中有潜在应用价值的工具酶.
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