【摘 要】
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目的 构建小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)基因特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体并检测其表达.方法 参照siRNA模板设计原则,设计并合成3对针对caspase12不同位点的siRNA
【机 构】
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上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科,中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室
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目的 构建小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)基因特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体并检测其表达.方法 参照siRNA模板设计原则,设计并合成3对针对caspase12不同位点的siRNA,分别在脂质体介导下转染小鼠肝癌细胞株Hepal-6,24 h收集细胞;RT-PCR分析不同位点siRNA对靶基因mRNA表达的抑制,筛选出抑制效率最高的位点;将此位点siRNA模板序列插入质粒pRNAT-H1.1Neo中,PCR分析及基因测序进行鉴定;构建成功的重组质粒转染Hepal-6细胞48 h和72 h后,实时荧光定量PCR分析caspase-12 mRNA表达;Western印迹检测Caspase-12的表达.数据行t检验.结果 RT-PCR分析表明,第一对siRNA(siRNA*1)对caspase-12基因表达的抑制效率最高;重组质粒pRNAT H1.1Neo-caspase12(pRNAT-casp12)经PCR分析及测序表明,siRNA*1模板序列成功插入预计位点,且序列正确;pRNAT-casp12转染Hepal-6细胞48 h和72 h后,与空质粒对照组相比,caspase-12 mRNA水平分别下降72.5%和59.5%(P＜0.05);pRNAT-casp12转染后,caspase-12酶原表达量在24、48和72 h分别下调17.1%、37.3%和60.1%,48 h和72 h的抑制率比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建小鼠caspase-12特异性siRNA真核表达载体,它对小鼠肝癌细胞caspase-12基因的表达具有显著和特异的抑制作用.
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