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摘 要 在桑果汁中添加250 mg/L DMDC，检测其在4 ℃贮藏期间污染菌和营养品质的变化。结果表明，新鲜桑果汁中添加250 mg/L DMDC后，果汁中的菌落总数、乳酸菌数、酵母菌数以及霉菌数均呈线性快速下降，在添加DMDC 12 h后，各种菌群的数量不再显著减少（p>0.05）。添加250 mg/L DMDC的桑果汁在4 ℃下贮藏时间能延长至30 d左右，并且在30 d贮藏期内，桑果汁的色差、pH、总滴定酸和可溶性固形物含量没有发生显著变化，而桑果汁中的2种花色苷含量（芸香苷和矢车菊素）、总酚含量、DPPH自由基清除力和α-葡萄糖苷酶抑制率则出现明显波动。
关键词 二甲基二碳酸盐（DMDC）；桑果汁；杀菌；品质
中图分类号 S663.9 文献标识码 A
Abstract Dimethyl Dicarbonate（DMDC）， as an antibacterial（ISN 242）， was approved to use in the fruit juice by the food additives standards of China. In this paper， changes in the microorganisms and quality attributes of mulberry juice during storage at 4 ℃ was investigated as added with 250 mg/L of DMDC. Results found that the counts of total bacteria， lactic acid bacteria， molds and yeasts significantly declined as DMDC was added to mulberry juice， and no further reductions of microbial counts were observed after 12 h of adding DMDC. And the counts of total bacteria， lactic acid bacteria， molds and yeasts significantly declined as DMDC was added to mulberry juice， and no further reductions of microbial counts were observed after 12 h. The storage times of mulberry juice added with 250 mg/L of DMDC can extend to about 30 d during storage at 4 ℃. Moreover， all the value of color， pH， titration acid， and total soluble solid showed no significant changes during 30 d storage at 4 ℃ as added with 250 mg/L of DMDC， and the content of anthocyanidin and total phenols， DPPH radical scavenging activity and α-glucosidase inhibitory activity showed a significant fluctuation.
Key words Dimethyl dicarbonate； Mulberry juice； Inactivation； Quality
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.032
桑果属浆果类水果，其在果实的成熟期特别容易受到微生物污染，鲜榨桑果汁中含有大量的腐败微生物[1]。对于偏远地区的果农而言，在没有热巴氏杀菌设备和冷藏的条件下，桑果汁在长途运输过程中很容易发生腐败变质。此外，由于桑果汁成熟期比较集中，使得小规模果汁加工企业难以有足够的热巴氏杀菌设备来处理大批量桑果汁，而新鲜桑果汁即使在低温冷藏条件下，其微生物货架期一般也不超过3～5 d。因此，一些安全、方便、高效的防腐剂越来越受到果汁加工企业的青睐[2]。
二甲基二碳酸盐（Dimethyl dicarbonate，DMDC），又名维果灵，是中国食品添加剂使用标准中允许使用（最大添加量250 mg/L）的果汁饮料防腐剂（INS号242），其防腐作用为杀灭果汁饮料中的微生物，对微生物的致死作用跟菌体内关键酶蛋白被DMDC修饰失活密切相关[3-4]。在常温甚至低温下，DMDC对果汁饮料中的很多污染菌（特别是酵母菌）具有较强的杀灭能力。研究发现，DMDC添加到果汁饮料中后，能迅速与果汁中微生物菌体的酶蛋白发生反应，并且DMDC在水中也能自发水解，自身在果酒或果汁饮料中无任何残留，并且也没有发现其它对动物或人体有害的物质生成，没有任何异味物质生成，是一种很有潜力的果汁饮料非热杀菌技术[5]。Fisher 等研究了不同温度下DMDC对苹果汁中大肠杆菌的杀菌效果，结果发现，苹果汁经250 mg/L 的DMDC在4 ℃处理3 d后，能使大肠杆菌降低3.1个对数单位，在10 ℃处理9 d后，能降低3.8个对数单位，在25 ℃处理3 d后不能检出大肠杆菌[6]。Basaran-Akgul 等[7]也发现苹果汁添加250 mg/L 的DMDC在室温下处理6 h后能使大肠杆菌下降5个对数单位以上。目前，尚未见关于DMDC处理对新鲜桑果汁中污染菌和营养品质方面的报道，因此，本文主要研究DMDC处理对桑果汁的杀菌效果及其品质影响，并进一步分析DMDC处理后，桑果汁在低温贮藏期间残留菌和营养品质的变化，以期为DMDC在桑果汁保藏中的应用提供参考。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料 完全成熟的桑果采摘自广东省宝桑园食品有限公司桑果种植基地。
1.1.2 试剂 二甲基二碳酸盐购自德国朗盛公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）购于西安沃尔森生物技术有限公司；Trolox购于阿拉丁试剂有限公司；福林酚试剂由国药集团化学试剂有限公司生产；PCA琼脂、孟加拉红琼脂和MRS琼脂购自广东环凯微生物科技有限公司；其它化学试剂均为国产分析纯。
1.1.3 主要设备 WF-A2000打浆机，美的有限公司；PB-10型PH计，德国Sartorius公司；SPX-250B-Z型生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2FD型无菌操作台，苏净集团苏州安康空气技术有限公司；Biofuge Stratos Sorvall型台式高速冷冻离心机，美国Thermo Fisher Scientific公司；UV1800型紫外分光光度计，日本岛津公司；YXQ-LS-5OS型立式蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HWS24型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；阿贝折光仪，英国Stanley公司；UltraScan VIS型全自动色差仪，美国HunterLab公司；Agilent-1200高效液相色谱，美国安捷伦公司。
1.2 方法
1.2.1 桑果汁制备 新鲜桑果采用打浆机处理后，过100目滤布，获得的桑果汁置于4 ℃冰箱中冷藏待用。
1.2.2 DMDC杀菌处理 将1 L新鲜桑果汁（4 ℃）置于无菌操作台上，加入250 mg/L DMDC并用玻璃棒猛烈地搅拌1 min。然后快速分装于50 mL灭菌的带盖PET塑料瓶中，将其置于4 ℃冰箱内冷藏。每隔一段时间进行间隙取样，并立即进行微生物和理化品质分析。
1.2.3 微生物分析 样品中的各种微生物采用稀释倒平板方式进行平板计数[5]。其中：菌落总数的计数采用PCA琼脂，在37 ℃生化培养箱中培养2～3 d后分析其菌落总数；酵母和霉菌的计数采用孟加拉红琼脂，在30 ℃的生化培养箱中培养2～3 d后分析其菌落总数；乳酸菌的计数采用MRS琼脂，在30 ℃的厌氧培养箱中培养2～3 d后分析其菌落总数。结果以每mL桑果汁中菌落数的常用对数值表示。
1.2.4 理化品质分析
（1）pH、总滴定酸和可溶性固形物。测定方法参考果汁行业标准SB/T 10203-1994进行测定。pH采用德国Sartorius PB-10型pH计测定；总酸采用直接滴定法，总酸度以柠檬酸计；可溶性固形物采用英国Stanley公司的阿贝折光仪直接测定（0Brix）。
（2）色差分析。采用UltraScan VIS型全自动色差仪（反射模式）对桑果汁样品的色泽进行测定，以未处理的桑果汁（新鲜桑果汁）为色差测定参比样，色差结果以L*、a*、b*和△E*表示[8]。
（3）抗坏血酸和花色苷含量的HPLC分析。抗坏血酸和花色苷含量的HPLC分析方法参照相关文献[9-10]。在测定抗坏血酸时，桑果汁样品与等体积的0.6%偏磷酸混合，离心去除沉淀，滤液过0.22 μm滤膜后直接上机分析。抗坏血酸的分离采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱温25 ℃，流动相为0.1%（NH4）2HPO4，流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL，采用UV-可见光检测器检测，其检测波长为254 nm。在测定花色苷时，桑果汁样品与等体积的酸性甲醇（含1%盐酸）混合，离心去除沉淀，滤液经流动相稀释后过0.22 μm滤膜待上机分析。花色苷的分离采用Waters XBridgeTM C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温25 ℃，采用1.0 mL/min的流速进行梯度洗脱（溶剂A：10%甲酸水溶液；溶剂B：乙腈），梯度洗脱的程序：0～7 min， 溶剂B从6%升至9%；7～18 min，溶剂B从9%升至11%；18～30 min，溶剂B从11%升至30%；30～34 min，溶剂B从30%降至6%；6%的溶剂B后运行5 min。进样量为10 μL，采用UV-可见光检测器检测，其检测波长为560 nm。
（4）总酚含量测定。采用福林酚法测定[11]。
（5）抗氧化性测定。桑果汁的抗氧化性采用DPPH 清除力表示。DPPH清除力的测定参照相关文献[11]，略加改进。以95%乙醇为溶剂，配制成浓度为130 μmol/L的DPPH溶液；移取20 μL待测的桑果汁样品于10 mL试管中，补加蒸馏水至1 mL，加入5 mL DPPH溶液（130 μmol/L），使总体积为6 mL，摇匀；室温放置30 min后倒入比色皿，记录517 nm吸光度为A样品（用5 mL 95%乙醇与1 mL样品溶液调零，以扣除试样本身颜色的影响）；向5 mL DPPH液中加入1 mL蒸馏水，记录吸光度为A空白。结果以样品的DPPH自由基清除率（%）表示。
DPPH自由基清除率=（A空白-A样品）/A空白×100%。
（6）α-葡萄糖苷酶抑制率。α-葡萄糖苷酶抑制率测定方法参照董华强等[12]的方法，略加改进。取50 μL适宜稀释度的桑果汁于96孔无菌细胞板中，加入100 μL 1 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液（pH6.9，
0.1 mmol/L磷酸缓冲液配制），反应10 min（25 ℃）后，继续添加50 μL的5 mmol/L硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pH6.9，0.1 mmol/L磷酸缓冲液配制），混合均匀后，立即用酶标仪测定405 nm下的吸光度，以50 μL的0.1 mmol/L磷酸缓冲液（pH6.9）作空白对照。
α-葡萄糖苷酶抑制率=（1-A样品/A空白）×100%。 1.3 数据分析
采用Microcal Origin 7.5（美国Microcal公司）软件制图，并用SPSS11.5软件对数据进行方差分析（ANOVA）。每项指标重复3次，数值以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 添加DMDC对桑果汁微生物的影响
新鲜桑果汁的初始菌落总数和酵母菌数已经高达6个对数以上（图1），未添加DMDC的新鲜桑果汁（对照组）在4 ℃低温贮藏期间，酵母菌群快速生长，2～3 d后就有明显的酒味，失去进一步加工的意义。桑果汁添加250 mg/L DMDC后在4 ℃贮藏期间菌落总数、乳酸菌数、酵母菌数、霉菌数的变化情况见图1。由图1可知，新鲜的桑果汁中添加250 mg/L DMDC后，菌落总数、乳酸菌数、酵母菌数以及霉菌数均呈线性快速下降，特别是酵母菌。添加DMDC 12 h后，酵母菌已经被完全杀灭，菌落总数、乳酸菌数和霉菌数分别下降至3.77、3.63和2.72 Lg（CFU/mL），但是随着时间的进一步延长，果汁中各种污染菌的数量并没有进一步下降。有研究表明，DMDC对微生物的致死作用跟菌体内关键酶蛋白被DMDC修饰失活密切相关。DMDC添加到果汁中后，除了与污染菌反应外，其自身还能发生水解，DMDC在4 ℃果汁中其半衰期只有6～8 h，DMDC分解后就不具有杀菌或抑菌作用[4-5]。添加250 mg/L DMDC的桑果汁在其后2个月的4℃低温贮藏期间，并没有发现残留的酵母菌、菌落总数和乳酸菌数出现明显的增加。但残留的霉菌则表现出缓慢增长趋势，且在贮藏30 d后已达到桑果汁初始霉菌数，由于残留霉菌的进一步生长，贮藏30～40 d后果汁中出现肉眼可见絮状的霉菌丝，为避免霉菌生长对后续桑果汁加工品质的影响，添加DMDC的桑果汁在低温下贮藏时间建议不超过30 d。
2.2 添加DMDC对桑果汁品质的影响
桑果汁（4 ℃）中添加250 mg/L DMDC 12 h后，果汁中主要营养品质的变化。与对照组相比，添加250 mg/L DMDC 12 h后，桑果汁的pH、总滴定酸、可溶性固形物含量、总酚含量、α-葡萄糖苷酶抑制活力和总抗氧化活力（DPPH清除力）没有发生显著变化（p>0.05）（表1）。桑果汁中主要含有2种花色苷（芸香苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷），但是添加250 mg/L DMDC 12 h后，2种花色苷的含量均下降30%以上，而未添加DMDC的对照组在4 ℃贮藏12 h后2种花色苷的含量变化不显著。另外，添加250 mg/L DMDC 12 h后，桑果汁的L*（亮度），a*（红绿）和b*（黄蓝）值有轻微的下降，△E*的值为1.84，这可能跟添加DMDC后桑果汁中花色苷含量下降有关。花色苷是由花青素配基（苷元）与糖通过糖苷键结合而成的一类多酚类化合物，是桑果汁存在的主要天然色素。天然花青素配基的基本结构为3，5，7-三羟基-2-苯基苯并吡喃，桑果汁中添加DMDC后其花色苷含量下降可能与DMDC能与花色苷中的活性基团发生化学反应有关[4]。另外，本研究中桑果汁中VC的含量低于检测限，这可能与桑果的成熟度和环境因素有关。一些研究结果表明，桑果在生长期间，随着成熟度的提高，VC含量会快速下降[13]；桑果在榨汁期间，桑果中存在的VC氧化酶也能导致VC的氧化[13]。
前面的研究表明，向桑果汁中添加250 mg/L DMDC后能有效杀灭新鲜桑果汁中的污染微生物，能将桑果汁在低温贮藏的时间延长至30 d。在30 d的贮藏期内（4 ℃），添加250 mg/L DMDC桑果汁的L*（亮度），a*（红绿）、b*（黄蓝）值、pH、总滴定酸和可溶性固形物含量没有发生显著变化（p>0.05），而总酚含量呈现明显的下降趋势（图2），这可能跟低温贮藏期间酚类物质的氧化和降解有关[14]；矢车菊素和芸香苷的含量均呈现先上升后降低的趋势（图2），这可能是由于花色苷的DMDC修饰物不稳定，能自发水解生成花色苷；α-葡萄糖苷酶抑制活力和总抗氧化活力（DPPH清除力）也均呈现明显的波动（图3），但α-葡萄糖苷酶抑制活力总体没有发生显著变化，而总抗氧化活力（DPPH清除力）则下降了10.1%（图3）。
3 讨论与结论
向桑果汁中添加250 mg/L DMDC能有效的降低果汁中污染微生物菌群的数量，抑制桑果汁的腐败，能将桑果汁在低温贮藏的时间延长至30 d，可以作为一种短期保藏桑果汁加工原料的方法，能有效缓解小型果汁加工企业在桑果集中成熟期间热巴氏杀菌设备的生产压力。本研究发现，添加DMDC的桑果汁在低温贮藏期间主要是残留的霉菌生长，因此，可以通过控制桑果汁的氧溶解量（比如将处理后桑果汁灌入密封的复合铝塑袋中）来抑制霉菌的生长，进一步延长DMDC处理桑果汁的保藏期。
DMDC虽然具有很强的化学反应活性，但本研究发现，添加250 mg/L DMDC到桑果汁中后，仅仅桑果汁中的2种花色苷（芸香苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷）含量降30%以上，而桑果汁的pH、总滴定酸、可溶性固形物含量、总酚含量、α-葡萄糖苷酶抑制活力和总抗氧化活力（DPPH清除力）没有发生显著变化（p>0.05），并且桑果汁的色泽（紫红色）也没有发生肉眼可见的减弱。在30 d的贮藏期内（4 ℃），添加250 mg/L DMDC桑果汁的L*（亮度），a*（红绿）、b*（黄蓝）值、pH、总滴定酸和可溶性固形物含量也没有发生显著变化（p>0.05），进一步说明添加250 mg/L DMDC的桑果汁在4 ℃贮藏30 d内其残留的微生物生长非常缓慢，几乎没有消耗果汁中的营养物质。
α-葡萄糖苷酶抑制活力和抗氧化活性是评价桑果汁品质的2个重要指标。一些研究结果表明，桑果汁中的α-葡萄糖苷酶抑制活力和总抗氧化力跟桑果汁中的多酚类物质相关，并且多酚类物质的化学结构也对两者的活力会有明显影响[14-15]。本研究发现，4 ℃，30 d的贮藏期内，添加250 mg/L DMDC桑果汁的矢车菊素与芸香苷含量、α-葡萄糖苷酶抑制活力和总抗氧化力（DPPH清除力）均呈现明显的波动，这可能跟花色苷的DMDC修饰物不稳定，能自发水解生成花色苷有关，后续实验还需对其进行深入研究。另外，多酚类物质在低温贮藏期间降解也对α-葡萄糖苷酶抑制活力和抗氧化活性有明显的影响[14]。 参考文献
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关键词 二甲基二碳酸盐（DMDC）；桑果汁；杀菌；品质
中图分类号 S663.9 文献标识码 A
Abstract Dimethyl Dicarbonate（DMDC）， as an antibacterial（ISN 242）， was approved to use in the fruit juice by the food additives standards of China. In this paper， changes in the microorganisms and quality attributes of mulberry juice during storage at 4 ℃ was investigated as added with 250 mg/L of DMDC. Results found that the counts of total bacteria， lactic acid bacteria， molds and yeasts significantly declined as DMDC was added to mulberry juice， and no further reductions of microbial counts were observed after 12 h of adding DMDC. And the counts of total bacteria， lactic acid bacteria， molds and yeasts significantly declined as DMDC was added to mulberry juice， and no further reductions of microbial counts were observed after 12 h. The storage times of mulberry juice added with 250 mg/L of DMDC can extend to about 30 d during storage at 4 ℃. Moreover， all the value of color， pH， titration acid， and total soluble solid showed no significant changes during 30 d storage at 4 ℃ as added with 250 mg/L of DMDC， and the content of anthocyanidin and total phenols， DPPH radical scavenging activity and α-glucosidase inhibitory activity showed a significant fluctuation.
Key words Dimethyl dicarbonate； Mulberry juice； Inactivation； Quality
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.032
桑果属浆果类水果，其在果实的成熟期特别容易受到微生物污染，鲜榨桑果汁中含有大量的腐败微生物[1]。对于偏远地区的果农而言，在没有热巴氏杀菌设备和冷藏的条件下，桑果汁在长途运输过程中很容易发生腐败变质。此外，由于桑果汁成熟期比较集中，使得小规模果汁加工企业难以有足够的热巴氏杀菌设备来处理大批量桑果汁，而新鲜桑果汁即使在低温冷藏条件下，其微生物货架期一般也不超过3～5 d。因此，一些安全、方便、高效的防腐剂越来越受到果汁加工企业的青睐[2]。
二甲基二碳酸盐（Dimethyl dicarbonate，DMDC），又名维果灵，是中国食品添加剂使用标准中允许使用（最大添加量250 mg/L）的果汁饮料防腐剂（INS号242），其防腐作用为杀灭果汁饮料中的微生物，对微生物的致死作用跟菌体内关键酶蛋白被DMDC修饰失活密切相关[3-4]。在常温甚至低温下，DMDC对果汁饮料中的很多污染菌（特别是酵母菌）具有较强的杀灭能力。研究发现，DMDC添加到果汁饮料中后，能迅速与果汁中微生物菌体的酶蛋白发生反应，并且DMDC在水中也能自发水解，自身在果酒或果汁饮料中无任何残留，并且也没有发现其它对动物或人体有害的物质生成，没有任何异味物质生成，是一种很有潜力的果汁饮料非热杀菌技术[5]。Fisher 等研究了不同温度下DMDC对苹果汁中大肠杆菌的杀菌效果，结果发现，苹果汁经250 mg/L 的DMDC在4 ℃处理3 d后，能使大肠杆菌降低3.1个对数单位，在10 ℃处理9 d后，能降低3.8个对数单位，在25 ℃处理3 d后不能检出大肠杆菌[6]。Basaran-Akgul 等[7]也发现苹果汁添加250 mg/L 的DMDC在室温下处理6 h后能使大肠杆菌下降5个对数单位以上。目前，尚未见关于DMDC处理对新鲜桑果汁中污染菌和营养品质方面的报道，因此，本文主要研究DMDC处理对桑果汁的杀菌效果及其品质影响，并进一步分析DMDC处理后，桑果汁在低温贮藏期间残留菌和营养品质的变化，以期为DMDC在桑果汁保藏中的应用提供参考。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料 完全成熟的桑果采摘自广东省宝桑园食品有限公司桑果种植基地。
1.1.2 试剂 二甲基二碳酸盐购自德国朗盛公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）购于西安沃尔森生物技术有限公司；Trolox购于阿拉丁试剂有限公司；福林酚试剂由国药集团化学试剂有限公司生产；PCA琼脂、孟加拉红琼脂和MRS琼脂购自广东环凯微生物科技有限公司；其它化学试剂均为国产分析纯。
1.1.3 主要设备 WF-A2000打浆机，美的有限公司；PB-10型PH计，德国Sartorius公司；SPX-250B-Z型生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2FD型无菌操作台，苏净集团苏州安康空气技术有限公司；Biofuge Stratos Sorvall型台式高速冷冻离心机，美国Thermo Fisher Scientific公司；UV1800型紫外分光光度计，日本岛津公司；YXQ-LS-5OS型立式蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HWS24型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；阿贝折光仪，英国Stanley公司；UltraScan VIS型全自动色差仪，美国HunterLab公司；Agilent-1200高效液相色谱，美国安捷伦公司。
1.2 方法
1.2.1 桑果汁制备 新鲜桑果采用打浆机处理后，过100目滤布，获得的桑果汁置于4 ℃冰箱中冷藏待用。
1.2.2 DMDC杀菌处理 将1 L新鲜桑果汁（4 ℃）置于无菌操作台上，加入250 mg/L DMDC并用玻璃棒猛烈地搅拌1 min。然后快速分装于50 mL灭菌的带盖PET塑料瓶中，将其置于4 ℃冰箱内冷藏。每隔一段时间进行间隙取样，并立即进行微生物和理化品质分析。
1.2.3 微生物分析 样品中的各种微生物采用稀释倒平板方式进行平板计数[5]。其中：菌落总数的计数采用PCA琼脂，在37 ℃生化培养箱中培养2～3 d后分析其菌落总数；酵母和霉菌的计数采用孟加拉红琼脂，在30 ℃的生化培养箱中培养2～3 d后分析其菌落总数；乳酸菌的计数采用MRS琼脂，在30 ℃的厌氧培养箱中培养2～3 d后分析其菌落总数。结果以每mL桑果汁中菌落数的常用对数值表示。
1.2.4 理化品质分析
（1）pH、总滴定酸和可溶性固形物。测定方法参考果汁行业标准SB/T 10203-1994进行测定。pH采用德国Sartorius PB-10型pH计测定；总酸采用直接滴定法，总酸度以柠檬酸计；可溶性固形物采用英国Stanley公司的阿贝折光仪直接测定（0Brix）。
（2）色差分析。采用UltraScan VIS型全自动色差仪（反射模式）对桑果汁样品的色泽进行测定，以未处理的桑果汁（新鲜桑果汁）为色差测定参比样，色差结果以L*、a*、b*和△E*表示[8]。
（3）抗坏血酸和花色苷含量的HPLC分析。抗坏血酸和花色苷含量的HPLC分析方法参照相关文献[9-10]。在测定抗坏血酸时，桑果汁样品与等体积的0.6%偏磷酸混合，离心去除沉淀，滤液过0.22 μm滤膜后直接上机分析。抗坏血酸的分离采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱温25 ℃，流动相为0.1%（NH4）2HPO4，流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL，采用UV-可见光检测器检测，其检测波长为254 nm。在测定花色苷时，桑果汁样品与等体积的酸性甲醇（含1%盐酸）混合，离心去除沉淀，滤液经流动相稀释后过0.22 μm滤膜待上机分析。花色苷的分离采用Waters XBridgeTM C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温25 ℃，采用1.0 mL/min的流速进行梯度洗脱（溶剂A：10%甲酸水溶液；溶剂B：乙腈），梯度洗脱的程序：0～7 min， 溶剂B从6%升至9%；7～18 min，溶剂B从9%升至11%；18～30 min，溶剂B从11%升至30%；30～34 min，溶剂B从30%降至6%；6%的溶剂B后运行5 min。进样量为10 μL，采用UV-可见光检测器检测，其检测波长为560 nm。
（4）总酚含量测定。采用福林酚法测定[11]。
（5）抗氧化性测定。桑果汁的抗氧化性采用DPPH 清除力表示。DPPH清除力的测定参照相关文献[11]，略加改进。以95%乙醇为溶剂，配制成浓度为130 μmol/L的DPPH溶液；移取20 μL待测的桑果汁样品于10 mL试管中，补加蒸馏水至1 mL，加入5 mL DPPH溶液（130 μmol/L），使总体积为6 mL，摇匀；室温放置30 min后倒入比色皿，记录517 nm吸光度为A样品（用5 mL 95%乙醇与1 mL样品溶液调零，以扣除试样本身颜色的影响）；向5 mL DPPH液中加入1 mL蒸馏水，记录吸光度为A空白。结果以样品的DPPH自由基清除率（%）表示。
DPPH自由基清除率=（A空白-A样品）/A空白×100%。
（6）α-葡萄糖苷酶抑制率。α-葡萄糖苷酶抑制率测定方法参照董华强等[12]的方法，略加改进。取50 μL适宜稀释度的桑果汁于96孔无菌细胞板中，加入100 μL 1 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液（pH6.9，
0.1 mmol/L磷酸缓冲液配制），反应10 min（25 ℃）后，继续添加50 μL的5 mmol/L硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pH6.9，0.1 mmol/L磷酸缓冲液配制），混合均匀后，立即用酶标仪测定405 nm下的吸光度，以50 μL的0.1 mmol/L磷酸缓冲液（pH6.9）作空白对照。
α-葡萄糖苷酶抑制率=（1-A样品/A空白）×100%。 1.3 数据分析
采用Microcal Origin 7.5（美国Microcal公司）软件制图，并用SPSS11.5软件对数据进行方差分析（ANOVA）。每项指标重复3次，数值以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 添加DMDC对桑果汁微生物的影响
新鲜桑果汁的初始菌落总数和酵母菌数已经高达6个对数以上（图1），未添加DMDC的新鲜桑果汁（对照组）在4 ℃低温贮藏期间，酵母菌群快速生长，2～3 d后就有明显的酒味，失去进一步加工的意义。桑果汁添加250 mg/L DMDC后在4 ℃贮藏期间菌落总数、乳酸菌数、酵母菌数、霉菌数的变化情况见图1。由图1可知，新鲜的桑果汁中添加250 mg/L DMDC后，菌落总数、乳酸菌数、酵母菌数以及霉菌数均呈线性快速下降，特别是酵母菌。添加DMDC 12 h后，酵母菌已经被完全杀灭，菌落总数、乳酸菌数和霉菌数分别下降至3.77、3.63和2.72 Lg（CFU/mL），但是随着时间的进一步延长，果汁中各种污染菌的数量并没有进一步下降。有研究表明，DMDC对微生物的致死作用跟菌体内关键酶蛋白被DMDC修饰失活密切相关。DMDC添加到果汁中后，除了与污染菌反应外，其自身还能发生水解，DMDC在4 ℃果汁中其半衰期只有6～8 h，DMDC分解后就不具有杀菌或抑菌作用[4-5]。添加250 mg/L DMDC的桑果汁在其后2个月的4℃低温贮藏期间，并没有发现残留的酵母菌、菌落总数和乳酸菌数出现明显的增加。但残留的霉菌则表现出缓慢增长趋势，且在贮藏30 d后已达到桑果汁初始霉菌数，由于残留霉菌的进一步生长，贮藏30～40 d后果汁中出现肉眼可见絮状的霉菌丝，为避免霉菌生长对后续桑果汁加工品质的影响，添加DMDC的桑果汁在低温下贮藏时间建议不超过30 d。
2.2 添加DMDC对桑果汁品质的影响
桑果汁（4 ℃）中添加250 mg/L DMDC 12 h后，果汁中主要营养品质的变化。与对照组相比，添加250 mg/L DMDC 12 h后，桑果汁的pH、总滴定酸、可溶性固形物含量、总酚含量、α-葡萄糖苷酶抑制活力和总抗氧化活力（DPPH清除力）没有发生显著变化（p>0.05）（表1）。桑果汁中主要含有2种花色苷（芸香苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷），但是添加250 mg/L DMDC 12 h后，2种花色苷的含量均下降30%以上，而未添加DMDC的对照组在4 ℃贮藏12 h后2种花色苷的含量变化不显著。另外，添加250 mg/L DMDC 12 h后，桑果汁的L*（亮度），a*（红绿）和b*（黄蓝）值有轻微的下降，△E*的值为1.84，这可能跟添加DMDC后桑果汁中花色苷含量下降有关。花色苷是由花青素配基（苷元）与糖通过糖苷键结合而成的一类多酚类化合物，是桑果汁存在的主要天然色素。天然花青素配基的基本结构为3，5，7-三羟基-2-苯基苯并吡喃，桑果汁中添加DMDC后其花色苷含量下降可能与DMDC能与花色苷中的活性基团发生化学反应有关[4]。另外，本研究中桑果汁中VC的含量低于检测限，这可能与桑果的成熟度和环境因素有关。一些研究结果表明，桑果在生长期间，随着成熟度的提高，VC含量会快速下降[13]；桑果在榨汁期间，桑果中存在的VC氧化酶也能导致VC的氧化[13]。
前面的研究表明，向桑果汁中添加250 mg/L DMDC后能有效杀灭新鲜桑果汁中的污染微生物，能将桑果汁在低温贮藏的时间延长至30 d。在30 d的贮藏期内（4 ℃），添加250 mg/L DMDC桑果汁的L*（亮度），a*（红绿）、b*（黄蓝）值、pH、总滴定酸和可溶性固形物含量没有发生显著变化（p>0.05），而总酚含量呈现明显的下降趋势（图2），这可能跟低温贮藏期间酚类物质的氧化和降解有关[14]；矢车菊素和芸香苷的含量均呈现先上升后降低的趋势（图2），这可能是由于花色苷的DMDC修饰物不稳定，能自发水解生成花色苷；α-葡萄糖苷酶抑制活力和总抗氧化活力（DPPH清除力）也均呈现明显的波动（图3），但α-葡萄糖苷酶抑制活力总体没有发生显著变化，而总抗氧化活力（DPPH清除力）则下降了10.1%（图3）。
3 讨论与结论
向桑果汁中添加250 mg/L DMDC能有效的降低果汁中污染微生物菌群的数量，抑制桑果汁的腐败，能将桑果汁在低温贮藏的时间延长至30 d，可以作为一种短期保藏桑果汁加工原料的方法，能有效缓解小型果汁加工企业在桑果集中成熟期间热巴氏杀菌设备的生产压力。本研究发现，添加DMDC的桑果汁在低温贮藏期间主要是残留的霉菌生长，因此，可以通过控制桑果汁的氧溶解量（比如将处理后桑果汁灌入密封的复合铝塑袋中）来抑制霉菌的生长，进一步延长DMDC处理桑果汁的保藏期。
DMDC虽然具有很强的化学反应活性，但本研究发现，添加250 mg/L DMDC到桑果汁中后，仅仅桑果汁中的2种花色苷（芸香苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷）含量降30%以上，而桑果汁的pH、总滴定酸、可溶性固形物含量、总酚含量、α-葡萄糖苷酶抑制活力和总抗氧化活力（DPPH清除力）没有发生显著变化（p>0.05），并且桑果汁的色泽（紫红色）也没有发生肉眼可见的减弱。在30 d的贮藏期内（4 ℃），添加250 mg/L DMDC桑果汁的L*（亮度），a*（红绿）、b*（黄蓝）值、pH、总滴定酸和可溶性固形物含量也没有发生显著变化（p>0.05），进一步说明添加250 mg/L DMDC的桑果汁在4 ℃贮藏30 d内其残留的微生物生长非常缓慢，几乎没有消耗果汁中的营养物质。
α-葡萄糖苷酶抑制活力和抗氧化活性是评价桑果汁品质的2个重要指标。一些研究结果表明，桑果汁中的α-葡萄糖苷酶抑制活力和总抗氧化力跟桑果汁中的多酚类物质相关，并且多酚类物质的化学结构也对两者的活力会有明显影响[14-15]。本研究发现，4 ℃，30 d的贮藏期内，添加250 mg/L DMDC桑果汁的矢车菊素与芸香苷含量、α-葡萄糖苷酶抑制活力和总抗氧化力（DPPH清除力）均呈现明显的波动，这可能跟花色苷的DMDC修饰物不稳定，能自发水解生成花色苷有关，后续实验还需对其进行深入研究。另外，多酚类物质在低温贮藏期间降解也对α-葡萄糖苷酶抑制活力和抗氧化活性有明显的影响[14]。 参考文献
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