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[摘要]目的：研究青蒿琥酯（ART）抑制增生性瘢痕成纤维细胞的果蝇抗皮肤生长因子原体3（Smad3）的表达。方法：原代培养人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞，以浓度为0，75，150，300，600μmol/L ART分别干预24h。荧光定量RT-PCR法检测其Smad3 mRNA的表达，Western blot法检测其Smad3蛋白表达。结果：各浓度ART作用于成纤维细胞后，荧光定量RT-PCR法检测发现Smad3 mRNA表达下调，与空白对照组比较，差异有统计学差异（P<0.01）。Western blot法检测发现各干预组Smad3蛋白表达下调，与空白对照组比较，差异均有统计学差异（P<0.01）。结论：ART能下调人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞Smad3的mRNA及蛋白水平，通过抑制Smad3的表达从而减少胶原合成可能是ART抑制增生性瘢痕的机制之一。
[关键词]增生性瘢痕；成纤维细胞；青蒿琥酯；Smad3
[中图分类号]R619+.6 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）04-0295-04
皮肤增生性瘢痕是临床上常见的疾病，常不同程度地影响患者的容貌和功能，治疗棘手。在创伤愈合过程中，由多种原因所致的以成纤维细胞为主的细胞成分过度增殖、多种致纤维化因子过度表达、以胶原为主的细胞外基质过度沉积及降解减少，导致增生性瘢痕的形成[1]。
本课题组前期实验将青蒿琥酯作用于增生性瘢痕成纤维细胞，观察发现在一定剂量内可以明显抑制成纤维细胞的增生，并诱导其凋亡[2]；通过兔耳瘢痕模型同样证实其有明显的抑制瘢痕增生作用[3]。本研究通过体外培养人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞，采用不同浓度的青蒿琥酯干预，检测其对成纤维细胞Smad3的基因及其蛋白的表达的影响，进一步探讨青蒿琥酯对皮肤增生性瘢痕的抑制作用及其可能机制。
1 材料和方法
1.1试剂和仪器：青蒿琥酯（纯度99.99%，桂林南药股份公司），DMEM培养基、胎牛血清（美国Gibco公司），TS-100F型荧光倒置相差显微镜（日本Nikon公司），NanoDrop 2000超微量分光光度（Thermo公司）、Step-one plus型PCR扩增仪（美国ABI公司），RNA提取试剂盒RNAiso Plus、PCR引物、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），鼠抗人Smad3单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）， 鼠抗人β-actin单克隆抗体（上海康成公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 标本来源：无菌条件下切取4例广西医科大学第一附属医院烧伤整形外科增生性瘢痕病例标本（经临床及病理证实），病程3～6月，取材前经患者知情同意。纳入标准为近2年内未接受瘢痕治疗，无系统疾病者。
1.2.2 原代培养：采用组织块法原代培养增生性瘢痕成纤维细胞[4]，培养液为含20%胎牛血清DMEM培养基，倒置显微镜观察细胞的形态，按1：3反复传代纯化成纤维细胞，实验使用第3～5代细胞。
1.2.3 荧光定量RT-PCR法测定Smad3的mRNA表达：按5×105/ml的细胞密度接种于25cm2培养瓶中，培养24h后，换用含药培养基，干预24h，提取各组细胞总RNA，NanoDrop 2000 测定RNA浓度，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录后进行SYBR标记荧光定量PCR。委托TAKARA公司引物设计及合成引物，并于NCBI数据库进行BLAST验证，引物序列为：目的基因Smad3上游引物5'-CCAGGGCTTTGA GGCTGTCTA-3'，下游引物5'-GCAAAGGCCCATTCAG GTG-3'（143bp）；选择GAPDH作为内参，GAPDH 上游引物5'-GCACCGTCAAGGC TGAGAAC-3'，下游引物5'-TGGTG AAGACGCCAGTGGA-3'（138bp）。按试剂盒说明书进行扩增，反应体系为SYBR R Premix Ex TaqTM 10μl，上游引物 0.4μl，下游引物 0.4μl，ROX 0.4μl，去离子水6.8μl，cDNA 2μl，总共20μl；扩增条件为95℃预变性30s→95℃变性5s→60℃退火、延伸30 s，共40个循环。2-△△Ct法表示Smad3的相对表达量。△Ct=Ct（目的基因）-Ct（内参基因），△△Ct=△Ct（干预组）-△Ct（空白对照组）。
1.2.4 Western blot法检测Smad3的蛋白表达：采用上述不同浓度的青蒿琥酯干预后，冰上裂解细胞，离心收集总蛋白，常规Western blot电泳、转膜及抗体孵育（一抗稀释比例为1：500，4℃过夜），ECL化学发光及显影、定影。Image J软件分析比较Smad3条带与内参β-actin条带灰度值比值。
1.2.5 统计分析：应用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多样本间比较采用完全随机设计单因素方差分析SNK-q检验，取P<0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 增生性瘢痕成纤维细胞原代培养形态学观察：培养5～7天可见组织块周围有细小呈长梭状贴壁细胞爬出（图1A），之后梭形细胞增殖迅速，15～20天可长满25cm2培养瓶（图1B），经传代3次后即可获得呈旋涡状的较纯的成纤维细胞（图1C）。
2.2 青蒿琥酯对Smad3 mRNA表达的影响：Smad3基因和内参基因GAPDH的各曲线如图显示（图2A，图2B），扩增曲线的基线平整，指数区明显，单峰溶解曲线证明扩增产物单一，说明所建立的实时荧光定量PCR方法检测Smad3具有较好的敏感性和准确性。2-△△Ct法分析发现各干预组Smad3的表达明显低于空白对照组，差异具有统计学意义（P<0.01）。ART 300μmol/L与ART 600μmol/L组两两比较无统计学差异（P>0.05），其余各ART组间两两比较差异有统计学意义（P<0.01）（表1）。 2.3 青蒿琥酯对Smad3蛋白的表达的影响：免疫印迹法检测成纤维细胞Smad3蛋白表达相对灰度值结果显示，各干预组Smad3蛋白表达明显下降，与空白对照组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。ART 75μmol/L组与ART 150μmol/L组两两比较差异无统计学差异（P>0.05），余各ART组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.01）。结果见图3，表2。
3 讨论
皮肤增生性瘢痕是临床常见的难治性纤维化疾病，其特征为成纤维细胞过度增生和细胞外基质异常堆积。治疗增生性性瘢痕常用的措施主要包括：手术切除、冷冻、激光、放疗、瘢痕内注射药物等[1]。中药对增生性瘢痕的防治有着久远的历史，对其机制也有独特的认识，认为它主要有气血壅滞、经络痹阻所致，治疗上主要是活血化瘀、软坚散结为主。在目前缺乏更有效的抗增生性瘢痕药物的情况下，将相对低毒的中药应用于预防增生性瘢痕，不失为一种选择[5]。青蒿琥酯是青蒿素的水溶性衍生物，研究表明，青蒿琥酯可抑制恶性肿瘤细胞的增殖，并促进其凋亡[6]，且对多种纤维化疾病均有抑制作用[7]。
转化生长因子β1（transformation growth factor-β1，TGF-β1）是目前已知的最强的促增生性瘢痕形成因子[8]。TGF-β1主要通过膜受体经胞内信号分子将信号从细胞浆转导到细胞核内而发挥作用。Smad蛋白家族是TGF-β受体家族（TGF-βR）的底物，当TGF-β与其胞膜受体形成配体-受体复合物时，可以磷酸化丝氨酸/苏氨酸相关激酶，激活Smads蛋白向细胞核内发出信号，介导核内靶基因的调节。Smads蛋白分子根据其功能和特征的不同分为受体调节型（Smad1，Smad2，Smad3等）、共同通路型（Smad4）、抑制型（Smad6， Smad7）[9]。作为受体调节型Smads的一员，Smad3在与瘢痕发生发展相关的TGF-β1信号传导通路中发挥关键作用；TGF-β1通过激活Smad3信号通路，促进成纤维细胞的增殖、趋化以及加快胞外基质的沉积，抑制该通路则可以发挥抑制瘢痕的作用[10]。
本实验采用青蒿琥酯作用于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞，将Smad3作为青蒿琥酯作用于成纤维细胞后的检测因子，发现Smad3在基因及蛋白水平均随药物浓度增加表达降低，并在一定浓度范围内具有浓度依赖性。因此我们推测，青蒿琥酯可能通过抑制增生性瘢痕组织中Smad3的表达，导致Smad3介导的、由TGF-β1与受体结合产生的信号从细胞质转导到核内的作用减弱，从而使纤维细胞合成胶原蛋白减少，避免过量纤维组织形成，进而抑制瘢痕增生进程。本研究有助于明确中药抗瘢痕增生的机制，为开发利用中药治疗增生性瘢痕提供了一定的依据。
[参考文献]
[1]Gauglitz GG， Korting HC， Pavicic T， et al. Hypertrophic Scarring and Keloids： Pathomechanisms and Current and Emerging Treatment Strategies[J].Mol Med，2011，17（1-2）：113-125.
[2]农晓琳，陈洪，陈石海，等.青蒿素、青蒿琥酯抗皮肤瘢痕的研究[J].中华皮肤科杂志，2009，42（6）：421-424.
[3]农晓琳，陈洪，陈石海，等.青蒿素、青蒿琥酯抗皮肤瘢痕的体外实验研究[J].广西医科大学学报，2009，26（2）：202-5.
[4]司徒镇强，吴军正.细胞培养[M].西安： 世界图书出版公司， 2007：58-59.
[5]胡丽，李伟.增生性瘢痕的发病机理和预防进展[J].中国美容医学，2013（05）：607-610.
[6]Li-Weber M.Targeting apoptosis pathways in cancer by Chinese medicine[J].Cancer Lett，2013，332（2）：304-312.
[7]陈翔，农晓琳.青蒿琥酯治疗病理性瘢痕与纤维化疾病机制[J].医药导报，2013（05）：633-636.
[8]Penn JW，Grobbelaar AO， Rolfe KJ. The role of the TGF-β family in wound healing， burns and scarring：a review[J].Int J Burn Trauma，2012，2（1）：18-28.
[9]李荟元，鲁开化，郭树忠.新编瘢痕学[M].西安：第四军医大学出版社，2003：201-204.
[10]Hsu YC，Chen MJ，Yu YM，et al.Suppression of TGF-beta1/SMAD pathway and extracellular matrix production in primary keloid fibroblasts by curcuminoids： its potential therapeutic use in the chemoprevention of keloid[J].Arch Dermatol Res，2010，302（10）：717-724.
[收稿日期]2013-11-25 [修回日期]2014-01-22
编辑/张惠娟
[关键词]增生性瘢痕；成纤维细胞；青蒿琥酯；Smad3
[中图分类号]R619+.6 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）04-0295-04
皮肤增生性瘢痕是临床上常见的疾病，常不同程度地影响患者的容貌和功能，治疗棘手。在创伤愈合过程中，由多种原因所致的以成纤维细胞为主的细胞成分过度增殖、多种致纤维化因子过度表达、以胶原为主的细胞外基质过度沉积及降解减少，导致增生性瘢痕的形成[1]。
本课题组前期实验将青蒿琥酯作用于增生性瘢痕成纤维细胞，观察发现在一定剂量内可以明显抑制成纤维细胞的增生，并诱导其凋亡[2]；通过兔耳瘢痕模型同样证实其有明显的抑制瘢痕增生作用[3]。本研究通过体外培养人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞，采用不同浓度的青蒿琥酯干预，检测其对成纤维细胞Smad3的基因及其蛋白的表达的影响，进一步探讨青蒿琥酯对皮肤增生性瘢痕的抑制作用及其可能机制。
1 材料和方法
1.1试剂和仪器：青蒿琥酯（纯度99.99%，桂林南药股份公司），DMEM培养基、胎牛血清（美国Gibco公司），TS-100F型荧光倒置相差显微镜（日本Nikon公司），NanoDrop 2000超微量分光光度（Thermo公司）、Step-one plus型PCR扩增仪（美国ABI公司），RNA提取试剂盒RNAiso Plus、PCR引物、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），鼠抗人Smad3单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）， 鼠抗人β-actin单克隆抗体（上海康成公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 标本来源：无菌条件下切取4例广西医科大学第一附属医院烧伤整形外科增生性瘢痕病例标本（经临床及病理证实），病程3～6月，取材前经患者知情同意。纳入标准为近2年内未接受瘢痕治疗，无系统疾病者。
1.2.2 原代培养：采用组织块法原代培养增生性瘢痕成纤维细胞[4]，培养液为含20%胎牛血清DMEM培养基，倒置显微镜观察细胞的形态，按1：3反复传代纯化成纤维细胞，实验使用第3～5代细胞。
1.2.3 荧光定量RT-PCR法测定Smad3的mRNA表达：按5×105/ml的细胞密度接种于25cm2培养瓶中，培养24h后，换用含药培养基，干预24h，提取各组细胞总RNA，NanoDrop 2000 测定RNA浓度，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录后进行SYBR标记荧光定量PCR。委托TAKARA公司引物设计及合成引物，并于NCBI数据库进行BLAST验证，引物序列为：目的基因Smad3上游引物5'-CCAGGGCTTTGA GGCTGTCTA-3'，下游引物5'-GCAAAGGCCCATTCAG GTG-3'（143bp）；选择GAPDH作为内参，GAPDH 上游引物5'-GCACCGTCAAGGC TGAGAAC-3'，下游引物5'-TGGTG AAGACGCCAGTGGA-3'（138bp）。按试剂盒说明书进行扩增，反应体系为SYBR R Premix Ex TaqTM 10μl，上游引物 0.4μl，下游引物 0.4μl，ROX 0.4μl，去离子水6.8μl，cDNA 2μl，总共20μl；扩增条件为95℃预变性30s→95℃变性5s→60℃退火、延伸30 s，共40个循环。2-△△Ct法表示Smad3的相对表达量。△Ct=Ct（目的基因）-Ct（内参基因），△△Ct=△Ct（干预组）-△Ct（空白对照组）。
1.2.4 Western blot法检测Smad3的蛋白表达：采用上述不同浓度的青蒿琥酯干预后，冰上裂解细胞，离心收集总蛋白，常规Western blot电泳、转膜及抗体孵育（一抗稀释比例为1：500，4℃过夜），ECL化学发光及显影、定影。Image J软件分析比较Smad3条带与内参β-actin条带灰度值比值。
1.2.5 统计分析：应用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多样本间比较采用完全随机设计单因素方差分析SNK-q检验，取P<0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 增生性瘢痕成纤维细胞原代培养形态学观察：培养5～7天可见组织块周围有细小呈长梭状贴壁细胞爬出（图1A），之后梭形细胞增殖迅速，15～20天可长满25cm2培养瓶（图1B），经传代3次后即可获得呈旋涡状的较纯的成纤维细胞（图1C）。
2.2 青蒿琥酯对Smad3 mRNA表达的影响：Smad3基因和内参基因GAPDH的各曲线如图显示（图2A，图2B），扩增曲线的基线平整，指数区明显，单峰溶解曲线证明扩增产物单一，说明所建立的实时荧光定量PCR方法检测Smad3具有较好的敏感性和准确性。2-△△Ct法分析发现各干预组Smad3的表达明显低于空白对照组，差异具有统计学意义（P<0.01）。ART 300μmol/L与ART 600μmol/L组两两比较无统计学差异（P>0.05），其余各ART组间两两比较差异有统计学意义（P<0.01）（表1）。 2.3 青蒿琥酯对Smad3蛋白的表达的影响：免疫印迹法检测成纤维细胞Smad3蛋白表达相对灰度值结果显示，各干预组Smad3蛋白表达明显下降，与空白对照组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。ART 75μmol/L组与ART 150μmol/L组两两比较差异无统计学差异（P>0.05），余各ART组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.01）。结果见图3，表2。
3 讨论
皮肤增生性瘢痕是临床常见的难治性纤维化疾病，其特征为成纤维细胞过度增生和细胞外基质异常堆积。治疗增生性性瘢痕常用的措施主要包括：手术切除、冷冻、激光、放疗、瘢痕内注射药物等[1]。中药对增生性瘢痕的防治有着久远的历史，对其机制也有独特的认识，认为它主要有气血壅滞、经络痹阻所致，治疗上主要是活血化瘀、软坚散结为主。在目前缺乏更有效的抗增生性瘢痕药物的情况下，将相对低毒的中药应用于预防增生性瘢痕，不失为一种选择[5]。青蒿琥酯是青蒿素的水溶性衍生物，研究表明，青蒿琥酯可抑制恶性肿瘤细胞的增殖，并促进其凋亡[6]，且对多种纤维化疾病均有抑制作用[7]。
转化生长因子β1（transformation growth factor-β1，TGF-β1）是目前已知的最强的促增生性瘢痕形成因子[8]。TGF-β1主要通过膜受体经胞内信号分子将信号从细胞浆转导到细胞核内而发挥作用。Smad蛋白家族是TGF-β受体家族（TGF-βR）的底物，当TGF-β与其胞膜受体形成配体-受体复合物时，可以磷酸化丝氨酸/苏氨酸相关激酶，激活Smads蛋白向细胞核内发出信号，介导核内靶基因的调节。Smads蛋白分子根据其功能和特征的不同分为受体调节型（Smad1，Smad2，Smad3等）、共同通路型（Smad4）、抑制型（Smad6， Smad7）[9]。作为受体调节型Smads的一员，Smad3在与瘢痕发生发展相关的TGF-β1信号传导通路中发挥关键作用；TGF-β1通过激活Smad3信号通路，促进成纤维细胞的增殖、趋化以及加快胞外基质的沉积，抑制该通路则可以发挥抑制瘢痕的作用[10]。
本实验采用青蒿琥酯作用于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞，将Smad3作为青蒿琥酯作用于成纤维细胞后的检测因子，发现Smad3在基因及蛋白水平均随药物浓度增加表达降低，并在一定浓度范围内具有浓度依赖性。因此我们推测，青蒿琥酯可能通过抑制增生性瘢痕组织中Smad3的表达，导致Smad3介导的、由TGF-β1与受体结合产生的信号从细胞质转导到核内的作用减弱，从而使纤维细胞合成胶原蛋白减少，避免过量纤维组织形成，进而抑制瘢痕增生进程。本研究有助于明确中药抗瘢痕增生的机制，为开发利用中药治疗增生性瘢痕提供了一定的依据。
[参考文献]
[1]Gauglitz GG， Korting HC， Pavicic T， et al. Hypertrophic Scarring and Keloids： Pathomechanisms and Current and Emerging Treatment Strategies[J].Mol Med，2011，17（1-2）：113-125.
[2]农晓琳，陈洪，陈石海，等.青蒿素、青蒿琥酯抗皮肤瘢痕的研究[J].中华皮肤科杂志，2009，42（6）：421-424.
[3]农晓琳，陈洪，陈石海，等.青蒿素、青蒿琥酯抗皮肤瘢痕的体外实验研究[J].广西医科大学学报，2009，26（2）：202-5.
[4]司徒镇强，吴军正.细胞培养[M].西安： 世界图书出版公司， 2007：58-59.
[5]胡丽，李伟.增生性瘢痕的发病机理和预防进展[J].中国美容医学，2013（05）：607-610.
[6]Li-Weber M.Targeting apoptosis pathways in cancer by Chinese medicine[J].Cancer Lett，2013，332（2）：304-312.
[7]陈翔，农晓琳.青蒿琥酯治疗病理性瘢痕与纤维化疾病机制[J].医药导报，2013（05）：633-636.
[8]Penn JW，Grobbelaar AO， Rolfe KJ. The role of the TGF-β family in wound healing， burns and scarring：a review[J].Int J Burn Trauma，2012，2（1）：18-28.
[9]李荟元，鲁开化，郭树忠.新编瘢痕学[M].西安：第四军医大学出版社，2003：201-204.
[10]Hsu YC，Chen MJ，Yu YM，et al.Suppression of TGF-beta1/SMAD pathway and extracellular matrix production in primary keloid fibroblasts by curcuminoids： its potential therapeutic use in the chemoprevention of keloid[J].Arch Dermatol Res，2010，302（10）：717-724.
[收稿日期]2013-11-25 [修回日期]2014-01-22
编辑/张惠娟