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摘要 [目的]明确发生在邯郸地区大名县辣椒大棚中的疫病病原菌。[方法]从辣椒大棚里采集辣椒疫病病樣，对病原菌进行分离与纯化，并通过形态学观察、ITS序列分析及致病力测定，对病原菌进行鉴定。[结果]辣椒疫病病原菌为辣椒疫霉（Phytophthora capsici）。[结论]该研究为当地辣椒疫病防治提供科学的理论依据。
关键词 辣椒;疫病;病原菌;分离;鉴定;辣椒疫霉
中图分类号 S436.418.1文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）04-0150-03
Abstract [Objective] The research aimed to identify the pathogen of pepper blight from Daming County of Handan area.[Method] Pepper disease samples were collected from greenhouses and the pathogen was isolated and purified.The pathogen of pepper blight was identified by comprehensive morphological characteristics，ITS DNA sequences analysis and pathogenicity test.[Result] The pathogen of pepper blight in Handan area was Phytophthora capsici.[Conclusion] The study provides a scientific theoretical basis for the prevention and control of local pepper blight.
Key words Pepper;Blight;Pathogen;Isolation;Identification;Phytophthora capsici
辣椒疫病是辣椒生产上的重要病害，目前已广泛分布于我国的辣椒种植区。辣椒在苗期、成株期都可感染疫病，而且在田间扩展迅速，常造成辣椒生产的毁灭性破坏[1]。辣椒疫病的病原为辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian），属于藻界卵菌门疫霉属，其寄主范围较广，可引起多种重要作物病害[2]。辣椒疫霉菌以卵孢子在土壤中越冬，环境适宜时卵孢子萌发产生游动孢子侵入寄主，经风、雨、水等传播，进行初侵染和再侵染[3]。为了明确邯郸地区辣椒疫病病原菌的分类特征及为害特点，有效地控制辣椒生产中疫病的发生危害，笔者对邯郸大名县大棚辣椒疫病的病原菌进行分离和鉴定。
1 材料与方法
1.1 试验材料 辣椒疫病病样采自河北省邯郸地区大名县大棚栽培辣椒的根。病原菌的致病力测定中供试辣椒品种为“瑞丰”“长健”“瑞朗”“尖椒1号”和“133”，采用常规育苗，长至1片真叶时选择大小一致的健壮辣椒苗，移栽于盛有适量营养土的盆中，日光温室内常规管理。选择8叶期长势一致的健康植株用做致病力测定。
1.2 试验方法
1.2.1 病原菌的分离和纯化。
病原菌的分离采用组织分离法[4]，将辣椒疫病病株根部的外表皮除去，取内部组织的病健交界处5 mm左右小块，在75%乙醇中浸渍30 s，再用0.1%升汞水溶液处理4 min，然后用无菌水清洗3次，置于选择性燕麦培养基平板上（含青霉素50 mg、五氯硝基苯50 mg、链霉素30 mg），25 ℃恒温培养。
将长出的菌丝转接到10% V8培养基上培养至菌丝长满平板后，向平板中倒入灭菌的自来水冲洗一遍，去除菌丝表面的营养物质，再加入灭菌的自来水至刚刚淹过菌丝面。置于日光灯下连续照光，经过48 h，菌落表面可产生大量孢子囊。加入少量灭菌自来水至产生大量孢子囊的培养基平板中，4 ℃冰箱放置10 min后，取出室温下放置30 min，刺激游动孢子的释放[5]。调节孢子悬浮液浓度到4×10倍显微镜下每视野1个孢子左右，用移液枪吸取孢子悬浮液50 μL在水琼脂平板上涂布均匀，12 h后低倍镜下检查、标记单个孢子的位置，用移植铲切取、移植含有单孢子的水琼脂块，转至10% V8培养基上培养，获得纯培养[6]。
1.2.2 病原菌的形态学鉴定。
在光学显微镜下观察病原菌菌丝隔膜的有无、孢子囊和游动孢子的形态特征。将病原菌接种到燕麦、玉米粉、10%V8、PDA培养基上，25 ℃培养3 d后，用直径6 mm打孔器沿菌落边缘打取菌饼，移至4种培养基平板中央，分别转接4皿，置于25 ℃培养。每隔24 h用十字交叉法测量菌落直径，4 d后观察病原菌在不同培养基上的菌落形态。
1.2.3 病原菌的分子生物学鉴定。
将纯化的病原菌接种到PDA培养基上，待其长出菌丝后，挑取0.1 g菌丝于1.5 mL 的离心管中，加液氮研磨至粉末。采用CTAB法提取DNA[7]。用真菌ITS区通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对提取物进行PCR扩增。25 μL PCR 反应体系包括10×PCR buffer（Mg2+ plus）2.5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，5 U/μL TaqDNA聚合酶0.3 μL，ITS1 和ITS4 引物（10 μmol/L）各1.0 μL，加ddH2O定容至25 μL。反应程序为：95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环;最后72 ℃延伸10 min。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。将测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行Blast对比分析，取相似性最高的序列和测定序列在ClustalX程序中进行完全比对。然后利用Mega 4.0软件以邻位相连（Neighbor-joining，NJ）算法构建系统发育树[8]。 1.2.4 病原菌的致病力测定。
采用活体刺茎接种[9]，将在PDA平板上25 ℃条件下培养7 d的辣椒疫霉菌菌株沿菌落边缘打成直径为6 mm的菌饼。用灭菌的解剖针刺伤供试辣椒（8叶期）的茎秆，然后将菌饼挑贴于伤口处，菌丝一面贴近伤口，用脱脂棉蘸水保湿24 h，24 h 后除去灭菌棉，以空白培养基块接种作为对照。每处理重复10次，接种后的辣椒置于人工气候培养箱内，25 ℃保湿培养，24 h 后开始测量病斑长度，每12 h 测量1 次，根据病斑长度评价各菌株致病力的差异。
2 结果与分析
2.1 病原菌的分离纯化 从辣椒疫病病样中分离的病组织块上均长出白色绒毛状的菌落，初步鉴定为同一菌株。将分离出的病原菌转接到10% V8培养基上，经过培养诱导，在显微镜下观察到了大量的孢子囊，对孢子囊进行刺激，释放出大量游动孢子。将孢子涂布在WA培养基上培养，共挑取出3个单孢子，将菌株保存到PDA斜面培养基并命名为Bz。
2.2 病原菌的形态特征
经显微镜观察，病原菌菌丝无隔膜，孢囊梗分枝不规则;孢子囊形状长椭圆形、卵圆形，大多数有1个乳突，大小为 （36.403～86.594） μm × （19.794～41.247） μm，长宽比为1.009～2.702（图1）。游动孢子肾形，带有鞭毛，游动孢子游动一段时间后停止游动。初步确定其为辣椒疫霉。
从图2可看出，病原菌在4种培养基上的培养性状不同。在燕麦培养基上的菌落呈圆形，绒毛状，气生菌丝很少，菌丝疏松、色白;在玉米粉培养基上的菌落接近圆形，棉絮状，气生菌丝较多，菌丝浓密、较厚，色白;在10%V8培养基上呈放射状生长，菌落圆形、气生菌丝很少，菌丝较疏松，色较浅;而在PDA培养基上的菌落呈圆形，花瓣状，气生菌丝较少，菌丝较浓密、较厚，色白。
从表1可看出，病原菌在4种培养基上的生长速率各不相同。病原菌在燕麦培养基上的生长最快，在玉米粉和10%V8培养基上的生长较快，在PDA培养基上的生长最慢。
2.3 病原菌的分子生物学鉴定
以提取的辣椒疫霉菌株Bz的DNA为模板，使用通用引物ITS1和ITS4进行扩增，并对扩增产物进行序列测定，获得长度为792 bp的特异性片段。将该片段序列在GenBank数据库中进行Blast比对，结果显示，该序列与已报道的辣椒疫霉菌（登录号：AJ854287.1）的序列相似性达99%。从GenBank数据库中选取代表疫霉属不同种的ITS序列，以Peronospora sparsa作为外群构建系统发育树，由图3聚类分析结果可知，菌株Bz与辣椒疫霉菌的rDNA-ITS聚在一起，而外群菌株Peronospora sparsa则以较远的亲缘关系处在系统发育树的外围。结合菌株的形态特征和培养性状，鉴定Bz为辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）。
2.4 病原菌的致病力测定
用辣椒疫霉菌株Bz接种5个辣椒品种的茎秆，在自然条件下培养3 d后，辣椒茎秆均出现褐色病斑，而对照未发病。菌株Bz对5个辣椒品种的致病力没有显著性差异，且致病力均强于标准菌株CT（表2）。之后病斑不断扩大导致病株萎蔫，症状与大棚自然发病症状一致。从接种的病组织中分离的病原菌与从大棚发病植株分离的病原菌形态一致，证明该致病菌为辣椒疫病的病原菌。
3 结论与讨论
该研究通过形态学和分子生物学鉴定方法，确定了发生在邯郸地区大名县辣椒大棚中的疫病病原菌为辣椒疫霉（Phytophthora capsici），通过致病力测定发现该病原菌可以侵染健康辣椒并导致辣椒疫病的发生。
发现辣椒疫霉菌在玉米粉和燕麦培养基上生长最佳;张世才等[11]发现辣椒疫霉菌在燕麦培养基上生长速度最快，但在V8培养基上产孢最多。该研究结果表明，辣椒疫霉菌在燕麦培养基上的生长最快，在10%V8培养基上产生大量孢子囊和游动孢子，这与前人的研究结果一致。传统疫霉属卵菌的鉴定主要依据其形态特征，但难于区分形态相似的种。研究发现，rDNA-ITS序列在疫霉属种内不同菌株间高度保守，而种间序列变异丰富，为卵菌的分类鉴定提供丰富的遗传信息[12]。因此，该研究根据形态学特征和ITS序列分析明确了邯郸大名县辣椒疫病的病原分类地位，为辣椒疫病的防治提供理论依据。该研究采用活体刺茎接种法进行致病力测定，结果表明，所分离的辣椒疫霉菌Bz接种到5个辣椒品种后均引起辣椒发病，显示菌株Bz为辣椒疫病的病原菌。
参考文献
[1] 姜國庆，丁和明.辣椒疫病的发生及防治技术[J].湖北植保，2014（1）：26，28.
[2] KAMOUN S，FURZER O，JONES J D，et al.The top 10 oomycete pathogens in molecular plant pathology [J].Molecular plant pathology，2015，16（4）：413-434.
[3] 曲丹丹，马莉莉，周海洋.辣椒疫病发病原因及综合防治措施[J].现代农业科技，2017（18）：90，92.
[4] 武玉环，章彦俊，张红杰，等.辣椒疫霉菌的分离纯化及室内药剂筛选[J].北方园艺，2013（8）：138-140.
[5] 郑小波.疫霉菌及其研究技术[M].北京：中国农业出版社，1997.
[6] 邱小燕，汤智鹏，张敏，等.一种适用于多数植物病原真菌的单孢分离方法[J].安徽农业科学，2011，39（9）：5263-5264.
[7] 杨叔青，胡栓红，杨志刚，等.不同地区辣椒疫霉菌生理小种的鉴定和生物学特性的研究[J].华业农学报，2015，30（2）：104-109.
[8] SAITOU N，NEI M.The neighborjoining method：A new method for reconstructing phylogenetic trees[J].Molecular biology and evolution，1987，4（4）：406-425.
[9] 李萍，江涛，高智谋，等.辣椒疫霉 （Phytophthora capsici） 对辣椒的致病力分化研究[J].植物病理学报，2012，42（4）：431-435.
[10] 徐作珽，李林，魏道君，等.大棚辣椒疫病菌的分离培养及药剂防治[J].植物保护，1999，25（2）：29-31.
[11] 张世才，熊艳，黄任中，等.重庆地区辣椒疫霉菌的分离培养及生理小种鉴定[J].植物保护，2015，41（3）：183-187.
[12] 程亮，温国泉，吴永官，等.广西南瓜疫病的病原分离与鉴定[J].西南农业学报，2014，27（6）：2398-2401.
关键词 辣椒;疫病;病原菌;分离;鉴定;辣椒疫霉
中图分类号 S436.418.1文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）04-0150-03
Abstract [Objective] The research aimed to identify the pathogen of pepper blight from Daming County of Handan area.[Method] Pepper disease samples were collected from greenhouses and the pathogen was isolated and purified.The pathogen of pepper blight was identified by comprehensive morphological characteristics，ITS DNA sequences analysis and pathogenicity test.[Result] The pathogen of pepper blight in Handan area was Phytophthora capsici.[Conclusion] The study provides a scientific theoretical basis for the prevention and control of local pepper blight.
Key words Pepper;Blight;Pathogen;Isolation;Identification;Phytophthora capsici
辣椒疫病是辣椒生产上的重要病害，目前已广泛分布于我国的辣椒种植区。辣椒在苗期、成株期都可感染疫病，而且在田间扩展迅速，常造成辣椒生产的毁灭性破坏[1]。辣椒疫病的病原为辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian），属于藻界卵菌门疫霉属，其寄主范围较广，可引起多种重要作物病害[2]。辣椒疫霉菌以卵孢子在土壤中越冬，环境适宜时卵孢子萌发产生游动孢子侵入寄主，经风、雨、水等传播，进行初侵染和再侵染[3]。为了明确邯郸地区辣椒疫病病原菌的分类特征及为害特点，有效地控制辣椒生产中疫病的发生危害，笔者对邯郸大名县大棚辣椒疫病的病原菌进行分离和鉴定。
1 材料与方法
1.1 试验材料 辣椒疫病病样采自河北省邯郸地区大名县大棚栽培辣椒的根。病原菌的致病力测定中供试辣椒品种为“瑞丰”“长健”“瑞朗”“尖椒1号”和“133”，采用常规育苗，长至1片真叶时选择大小一致的健壮辣椒苗，移栽于盛有适量营养土的盆中，日光温室内常规管理。选择8叶期长势一致的健康植株用做致病力测定。
1.2 试验方法
1.2.1 病原菌的分离和纯化。
病原菌的分离采用组织分离法[4]，将辣椒疫病病株根部的外表皮除去，取内部组织的病健交界处5 mm左右小块，在75%乙醇中浸渍30 s，再用0.1%升汞水溶液处理4 min，然后用无菌水清洗3次，置于选择性燕麦培养基平板上（含青霉素50 mg、五氯硝基苯50 mg、链霉素30 mg），25 ℃恒温培养。
将长出的菌丝转接到10% V8培养基上培养至菌丝长满平板后，向平板中倒入灭菌的自来水冲洗一遍，去除菌丝表面的营养物质，再加入灭菌的自来水至刚刚淹过菌丝面。置于日光灯下连续照光，经过48 h，菌落表面可产生大量孢子囊。加入少量灭菌自来水至产生大量孢子囊的培养基平板中，4 ℃冰箱放置10 min后，取出室温下放置30 min，刺激游动孢子的释放[5]。调节孢子悬浮液浓度到4×10倍显微镜下每视野1个孢子左右，用移液枪吸取孢子悬浮液50 μL在水琼脂平板上涂布均匀，12 h后低倍镜下检查、标记单个孢子的位置，用移植铲切取、移植含有单孢子的水琼脂块，转至10% V8培养基上培养，获得纯培养[6]。
1.2.2 病原菌的形态学鉴定。
在光学显微镜下观察病原菌菌丝隔膜的有无、孢子囊和游动孢子的形态特征。将病原菌接种到燕麦、玉米粉、10%V8、PDA培养基上，25 ℃培养3 d后，用直径6 mm打孔器沿菌落边缘打取菌饼，移至4种培养基平板中央，分别转接4皿，置于25 ℃培养。每隔24 h用十字交叉法测量菌落直径，4 d后观察病原菌在不同培养基上的菌落形态。
1.2.3 病原菌的分子生物学鉴定。
将纯化的病原菌接种到PDA培养基上，待其长出菌丝后，挑取0.1 g菌丝于1.5 mL 的离心管中，加液氮研磨至粉末。采用CTAB法提取DNA[7]。用真菌ITS区通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对提取物进行PCR扩增。25 μL PCR 反应体系包括10×PCR buffer（Mg2+ plus）2.5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，5 U/μL TaqDNA聚合酶0.3 μL，ITS1 和ITS4 引物（10 μmol/L）各1.0 μL，加ddH2O定容至25 μL。反应程序为：95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环;最后72 ℃延伸10 min。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。将测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行Blast对比分析，取相似性最高的序列和测定序列在ClustalX程序中进行完全比对。然后利用Mega 4.0软件以邻位相连（Neighbor-joining，NJ）算法构建系统发育树[8]。 1.2.4 病原菌的致病力测定。
采用活体刺茎接种[9]，将在PDA平板上25 ℃条件下培养7 d的辣椒疫霉菌菌株沿菌落边缘打成直径为6 mm的菌饼。用灭菌的解剖针刺伤供试辣椒（8叶期）的茎秆，然后将菌饼挑贴于伤口处，菌丝一面贴近伤口，用脱脂棉蘸水保湿24 h，24 h 后除去灭菌棉，以空白培养基块接种作为对照。每处理重复10次，接种后的辣椒置于人工气候培养箱内，25 ℃保湿培养，24 h 后开始测量病斑长度，每12 h 测量1 次，根据病斑长度评价各菌株致病力的差异。
2 结果与分析
2.1 病原菌的分离纯化 从辣椒疫病病样中分离的病组织块上均长出白色绒毛状的菌落，初步鉴定为同一菌株。将分离出的病原菌转接到10% V8培养基上，经过培养诱导，在显微镜下观察到了大量的孢子囊，对孢子囊进行刺激，释放出大量游动孢子。将孢子涂布在WA培养基上培养，共挑取出3个单孢子，将菌株保存到PDA斜面培养基并命名为Bz。
2.2 病原菌的形态特征
经显微镜观察，病原菌菌丝无隔膜，孢囊梗分枝不规则;孢子囊形状长椭圆形、卵圆形，大多数有1个乳突，大小为 （36.403～86.594） μm × （19.794～41.247） μm，长宽比为1.009～2.702（图1）。游动孢子肾形，带有鞭毛，游动孢子游动一段时间后停止游动。初步确定其为辣椒疫霉。
从图2可看出，病原菌在4种培养基上的培养性状不同。在燕麦培养基上的菌落呈圆形，绒毛状，气生菌丝很少，菌丝疏松、色白;在玉米粉培养基上的菌落接近圆形，棉絮状，气生菌丝较多，菌丝浓密、较厚，色白;在10%V8培养基上呈放射状生长，菌落圆形、气生菌丝很少，菌丝较疏松，色较浅;而在PDA培养基上的菌落呈圆形，花瓣状，气生菌丝较少，菌丝较浓密、较厚，色白。
从表1可看出，病原菌在4种培养基上的生长速率各不相同。病原菌在燕麦培养基上的生长最快，在玉米粉和10%V8培养基上的生长较快，在PDA培养基上的生长最慢。
2.3 病原菌的分子生物学鉴定
以提取的辣椒疫霉菌株Bz的DNA为模板，使用通用引物ITS1和ITS4进行扩增，并对扩增产物进行序列测定，获得长度为792 bp的特异性片段。将该片段序列在GenBank数据库中进行Blast比对，结果显示，该序列与已报道的辣椒疫霉菌（登录号：AJ854287.1）的序列相似性达99%。从GenBank数据库中选取代表疫霉属不同种的ITS序列，以Peronospora sparsa作为外群构建系统发育树，由图3聚类分析结果可知，菌株Bz与辣椒疫霉菌的rDNA-ITS聚在一起，而外群菌株Peronospora sparsa则以较远的亲缘关系处在系统发育树的外围。结合菌株的形态特征和培养性状，鉴定Bz为辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）。
2.4 病原菌的致病力测定
用辣椒疫霉菌株Bz接种5个辣椒品种的茎秆，在自然条件下培养3 d后，辣椒茎秆均出现褐色病斑，而对照未发病。菌株Bz对5个辣椒品种的致病力没有显著性差异，且致病力均强于标准菌株CT（表2）。之后病斑不断扩大导致病株萎蔫，症状与大棚自然发病症状一致。从接种的病组织中分离的病原菌与从大棚发病植株分离的病原菌形态一致，证明该致病菌为辣椒疫病的病原菌。
3 结论与讨论
该研究通过形态学和分子生物学鉴定方法，确定了发生在邯郸地区大名县辣椒大棚中的疫病病原菌为辣椒疫霉（Phytophthora capsici），通过致病力测定发现该病原菌可以侵染健康辣椒并导致辣椒疫病的发生。
发现辣椒疫霉菌在玉米粉和燕麦培养基上生长最佳;张世才等[11]发现辣椒疫霉菌在燕麦培养基上生长速度最快，但在V8培养基上产孢最多。该研究结果表明，辣椒疫霉菌在燕麦培养基上的生长最快，在10%V8培养基上产生大量孢子囊和游动孢子，这与前人的研究结果一致。传统疫霉属卵菌的鉴定主要依据其形态特征，但难于区分形态相似的种。研究发现，rDNA-ITS序列在疫霉属种内不同菌株间高度保守，而种间序列变异丰富，为卵菌的分类鉴定提供丰富的遗传信息[12]。因此，该研究根据形态学特征和ITS序列分析明确了邯郸大名县辣椒疫病的病原分类地位，为辣椒疫病的防治提供理论依据。该研究采用活体刺茎接种法进行致病力测定，结果表明，所分离的辣椒疫霉菌Bz接种到5个辣椒品种后均引起辣椒发病，显示菌株Bz为辣椒疫病的病原菌。
参考文献
[1] 姜國庆，丁和明.辣椒疫病的发生及防治技术[J].湖北植保，2014（1）：26，28.
[2] KAMOUN S，FURZER O，JONES J D，et al.The top 10 oomycete pathogens in molecular plant pathology [J].Molecular plant pathology，2015，16（4）：413-434.
[3] 曲丹丹，马莉莉，周海洋.辣椒疫病发病原因及综合防治措施[J].现代农业科技，2017（18）：90，92.
[4] 武玉环，章彦俊，张红杰，等.辣椒疫霉菌的分离纯化及室内药剂筛选[J].北方园艺，2013（8）：138-140.
[5] 郑小波.疫霉菌及其研究技术[M].北京：中国农业出版社，1997.
[6] 邱小燕，汤智鹏，张敏，等.一种适用于多数植物病原真菌的单孢分离方法[J].安徽农业科学，2011，39（9）：5263-5264.
[7] 杨叔青，胡栓红，杨志刚，等.不同地区辣椒疫霉菌生理小种的鉴定和生物学特性的研究[J].华业农学报，2015，30（2）：104-109.
[8] SAITOU N，NEI M.The neighborjoining method：A new method for reconstructing phylogenetic trees[J].Molecular biology and evolution，1987，4（4）：406-425.
[9] 李萍，江涛，高智谋，等.辣椒疫霉 （Phytophthora capsici） 对辣椒的致病力分化研究[J].植物病理学报，2012，42（4）：431-435.
[10] 徐作珽，李林，魏道君，等.大棚辣椒疫病菌的分离培养及药剂防治[J].植物保护，1999，25（2）：29-31.
[11] 张世才，熊艳，黄任中，等.重庆地区辣椒疫霉菌的分离培养及生理小种鉴定[J].植物保护，2015，41（3）：183-187.
[12] 程亮，温国泉，吴永官，等.广西南瓜疫病的病原分离与鉴定[J].西南农业学报，2014，27（6）：2398-2401.