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摘要：为找到一种高效、环保、具备工业化潜力的无患子皂苷提取新方法，先采用加热回流法提取无患子中的皂苷，通过单因素试验研究了提取溶剂类型、溶剂体积分数、提取温度、提取时间、料液比等因素对皂苷得率的影响。在此基础上，采用超声辅助提取，选取提取温度、提取时间、料液比3个关键因素进行正交试验，确定出最具工业化潜力的无患子皂苷提取参数为：乙醇体积分数为60%、料液比1∶7、提取温度50 ℃、提取时间1 h，在此条件下无患子皂苷的得率为21.56%，比加热回流法高44.02%，且提取时间更短、提取温度更低。研究表明，超声辅助加热回流法是一种具有工业化潜力的无患子皂苷提取新工艺。
关键词：无患子皂苷;加热回流法;超声辅助提取;得率;正交试验
中图分类号：S 789文献标识码：A文章编号：1672-7312（2021）03-0275-06
Study on the New Technology of Ultrasonicassisted
Reflux Extraction of Sapindus SaponinsZHAO Lu1，2，ZHANG Lei1
（1.School of Geological and Environmental，Xi’an University of Science and Technology，Xi’an 710054，China;
2.Office of International Exchange and Cooperation，Xi’an University of Science and Technology，Xi’an 710054，China）Abstract：In order to find a new efficient，environmentalfriendly extraction technology with industrialization potential for Sapindus saponins，reflux method was firstly explored.The effect of solvent type，solvent volume fraction，extraction temperature，extraction time and solidliquid ratio on Sapindus saponins yield was studied by single factor experiment.On this basis，orthogonal experiment of three selected key factors of extraction temperature，extraction time and solidliquid ratio was conducted to determine the optimal condition for Sapindus saponins extraction by ultrasonicassisted reflux extraction method.The yield of Sapindus saponins was 21.56% under the optimal condition of ethanol volume fraction of 60%，solidliquid ratio of 1∶7，extraction temperature of 50 ℃ and extraction time of 1 h，which was 44.02% higher than that of reflux extraction method.，and the extraction time was shorter and the extraction temperature was lower.Ultrasonicassisted reflux extraction is a new technology for Sapindus saponin extraction with industrial potential.
Key words：sapindus saponins;reflux method;ultrasonicassisted extraction;yield;orthogonal experiment
0引言
近年来，以无患子皂苷为代表的天然表面活性剂因表面活性好、可完全降解、毒性低、生物相容性好、来源广泛、可适应某些极端条件等优点＼[1-2＼]，被国内外大量学者认为具有替代化学表面活性剂的潜力＼[3＼]。无患子树（sapindus mukurossi geartn）是一种广泛分布于我国长江流域以南各地的植物，果皮中通常含有大量皂苷，皂苷质量分数可达7～27 wt%＼[4＼]。皂苷主要以苷元作为疏水基团通过醚键或脂键连接在亲水糖链上，这样的双亲结构为皂苷提供了较高的表面活性，使皂苷成为一种天然的非离子表面活性剂＼[5＼]，被广泛应用于日化、制药、环境修复等多个领域，并取得了较好的效果＼[6-7＼]。
第3期赵璐等：超声辅助加热回流法提取无患子皂苷新工艺的研究找到一种高效、经济的提取方法是无患子皂苷大规模工业化应用的关键技术和前提。溶剂提取法是目前皂苷提取最常用的方法之一＼[8＼]，利用甲醇、乙醇等溶剂对不同溶解度的各项成分进行分步提取，具有操作简单、成本低等优点，但是皂苷得率较低＼[9＼]，因此，常用超临界CO2萃取＼[10＼]、亚临界水萃取＼[11＼]、微波辅助提取＼[12＼]、减压提取＼[13＼]等外界环境辅助的方法提高皂苷得率。DAHMOUNE等人＼[14＼]采用响应面分析法获得了微波辅助提取法的最优工艺，在此条件下得到的皂苷得率比传统溶剂提取法高7.82倍。BITENCOURT等人＼[15＼]研究了超临界提取工艺顺序对得率的影响，根据溶剂极性确定提取顺序的原则，确定了按超临界CO2-超临界CO2/乙醇混合物-乙醇-水的顺序依次提取的规律，指出超临界CO2/乙醇混合是提高皂苷得率的关键。王维坚＼[16＼]等人研究了超声法提取人参总皂苷的最佳工艺，且通过与回流法对比，证明超声法的提取效果更好。ELHAG等＼[17＼]用連续提取法从东革阿里的根中提取皂苷，利用超声辅助-水提法的提取时间为5.5～10 min，远小于水提法20～25 min的提取时间，提取效率大幅度提高。其中，超声辅助提取是最常用的方法之一，它利用超声作用对溶剂产生的强冲击、微射流，促进有效成分与溶剂之间的固-液传质，同时强度适中、热效应低，可以保护有效成分的活性，提高有效成分的提取率，因此，成为天然产物活性组分提取工艺的研究热点，然而该方法在无患子皂苷提取中的应用还较少。 文中将以无患子果皮为原料，采用超声辅助-加热回流法提取皂苷，在单因素试验基础上选取提取温度、温度时间、料液比3个关键因素进行正交试验，以期找到一种高效、环保、具备工业化潜力的无患子皂苷提取方法。
1实验原料及方法
1.1实验材料
无患子果皮：安国市仟曹御颜坊中药材有限公司;无水乙醇：分析纯级，天津富宇精细化工有限公司;甲醇：分析纯级，天津市大茂化学试剂厂;丙酮：分析纯级，天津富宇精细化工有限公司;香草醛：分析纯级，天津市科密欧化学试剂有限公司;浓硫酸：分析纯级，天津市富宇精细化工有限公司;冰醋酸：分析纯级，天津市富宇精细化工有限公司;齐墩果酸标准品：上海麦克林生物化学有限公司;溴化钾：光谱纯级，上海麦克林生物化学有限公司;实验用水为去离子水。
1.2实验方法
1.2.1无患子皂苷含量的测定
由于无患子果皮中含有的皂苷主要为齐墩果酸三萜皂苷，目前研究均以齐墩果酸作为无患子皂苷含量评价的标准品。文中通过绘制标准品的浓度-质量标准曲线来测定样品中的皂苷含量。
齐墩果酸标准曲线的测定：称取干燥的齐墩果酸标准品2.5 mg加入无水乙醇使其定容到25 mL，得到0.1 mg/mL齐墩果酸标准溶液。准备8支干燥洁净的10 mL具塞试管，移取0.1 mg/mL齐墩果酸标准溶液0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8，2.1 mL分别加入其中，将试管置于80℃真空干燥箱中使溶剂完全挥发，然后向每只试管依次加入0.2 mL的5%香草醛-冰醋酸显色溶液和0.8 mL浓硫酸，摇匀后在60℃恒温水浴锅（W501型，上海申顺生物科技有限公司）中加热15 min，显色停止后立即将试管置于冰水中3 min，待冷却后再向每只试管加入5 mL冰醋酸，摇晃均匀后，用紫外分光光度计（UV-5，瑞士梅特勒-托利多公司）在400～600 nm扫描光谱，确定最大吸收波长，在该波长下测定溶液吸光度的值。用加入0 mL齐墩果酸标准溶液的试管做参照对比。5%的香草醛-冰醋酸溶液需要现配现用。称取一定量的本实验得到的无患子皂苷提取物，溶解于无水乙醇中，用25 mL的容量瓶定容，配制成无患子皂苷的测试溶液，用移液管精确称取0.1 mL测试溶液至比色管，用香草醛-浓硫酸显色法测定样品溶液的吸光度，并根据标准曲线计算皂苷含量和皂苷提取率。
1.2.2无患子提取工艺研究
将市购的无患子果壳用清水洗净后烘干，用粉碎机粉碎到粉末状过筛（100目标准筛），称取一定量的无患子果皮粉末与溶剂混匀在不同条件下提取，得到的提取液经0.45 μm滤膜过滤后在离心机中（6-16S型，德国Sigma公司）以5 000 r/min的转速离心10 min，取出上清液再进行旋转蒸发（RE-2000A型，上海亚荣公司）得到膏状浓缩物，置于冰箱中冷藏可结晶得到固态的皂苷提取物，提取流程如图1所示。
1）常规溶剂加热回流提取：考察不同提取溶剂种类（水、乙醇、甲醇、丙酮）、提取溶剂体积分数（15%、30%、45%、60%、75%、100%），提取温度（30、40、50、60、70、80 ℃）、提取时间（0.5、1、1.5、2、3、4 h）、料液比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶0、1∶15∶1∶20）对皂苷得率的影响。
2）超声辅助加热回流提取：在单因素的基础上，采用恒温超声波提取机（VS-65UE型，无锡沃信仪器有限公司）产生的超声辅助提取，选定超声功率为100 W（无患子皂苷超声辅助提取及洗涤性能研究），选取提取温度、提取时间和料液比3个因素通过正交试验法，以皂苷得率为目标函数优化工艺。
2实验结果与分析
2.1无患子皂苷总含量的测定
由于齐墩果酸型五环三萜皂苷没有共轭体系，因此需要通过三萜皂苷在硫酸、高氯酸等Lewis酸作用下，经过脱水、双键位移、缩合等一系列反应产生有色或荧光物质来进行定量＼[7＼]。无患子皂苷提取物和香草醛进行显色反应后，在540 nm波长处有较大吸收峰（图2），因此将540 nm选为吸光度测试波长，测定不同质量齐墩果酸对应吸光度的值，拟合得到标准曲线（图3），进行线性回归后得到方程：y=0.005 9 x+0.062 57（R2=0.992 1），说明齐墩果酸在30～210 μg范围内，与吸光度呈现良好的线性关系，可作为齐墩果酸型皂苷含量评价的标准曲线。
2.2无患子皂苷提取工艺研究
2.2.1加热回流法提取皂苷工艺
1）提取溶剂对无患子皂苷含量的影响。溶剂的种类直接影响其穿透无患子细胞的能力，进而影响皂苷的提取率。皂苷类化合物分子具有双亲结构，可用水或甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂提取。分别取40 mL去离子水、100%乙醇、100%甲醇、100%丙酮与4.0 g无患子果皮粉末按1∶10的料液比混合均匀，在60 ℃条件下提取2 h，无患子皂苷的得率如图4所示。可以看出，与3种有机溶剂提取无患子皂苷的得率相较，用水提取皂苷的得率最低，仅为6.51±1.04%。在3种有机溶剂中，甲醇作为溶剂提取的无患子皂苷得率最高，达到13.48±0.83%，这与金秋等人的研究结果一致＼[17＼]。然而由于甲醇具有毒性，并且溶解度高，在无患子提取过程中一些单糖、蛋白质、氨基酸等杂质也会被提取出来，降低了提取物中的皂苷纯度，不宜用于大规模工业化生产。用乙醇提取无患子皂苷的得率为10.91±1.34%，稍低于甲醇的得率，考虑到提取物的纯度、生产过程及产品的安全性等因素，后续实验将选择乙醇作为无患子皂苷的提取溶剂。
2）乙醇体积分数对无患子皂苷含量的影响。乙醇的体积分数决定了无患子果皮细胞内外的渗透压大小，影响细胞内物质的渗出和皂苷得率。分别取40 mL体积分数为15%、30%、45%、60%、80%，100%的乙醇与4.0 g无患子果皮的粉末按1：10的料液比混合均匀，在60 ℃条件下提取2 h，无患子皂苷的得率如图5所示。在乙醇体积分数为15%～90%的范围内，随乙醇体积分数的增加，无患子皂苷的得率先增大后減小。当乙醇体积分数由15%增大到60%时，无患子皂苷的得率也由6.02±0.39%增加到14.97±0.55%，达到皂苷得率的最大值。而后，随乙醇体积分数由60%继续增大到90%时，皂苷得率逐渐减小。这可能是因为部分皂苷类化合物是水溶性物质，当乙醇体积分数过高时，一些杂质溶出增多，与水溶性皂苷竞争溶剂，导致皂苷溶出减少，使皂苷的得率下降。因此，选择体积分数为60%的乙醇作为提取溶剂，进一步优化提取条件。 3）提取温度对无患子皂苷含量的影响。温度会影响乙醇分子和无患子果皮中各类物质的运动速度和扩散速度，进而影响皂苷的得率。取40 mL体积分数为60%的乙醇溶液与4.0 g无患子果皮粉末按1∶10的料液比混合均匀，分别在30、40、50、60、70、80 ℃条件下提取2 h，得到无患子皂苷的得率如图6所示。由图可以看到，在30～60 ℃范围内，皂苷得率随温度的上升快速增加，由7.66±0.73%增至15.32±0.29%。这是因为无患子皂苷易溶于乙醇，随着温度升高，无患子果皮中各物质分子运动更激烈，扩散的速度也更快，有助于皂苷迁移溶出。当提取温度由60 ℃升至70 ℃时，皂苷提取率略有上升，变化不明显。超过70 ℃后，随温度上升，皂苷得率开始下降。这可能是因为温度过高破坏了无患子皂苷的活性成分，造成部分皂苷水解，生成副产物，皂苷提取率下降，影响提取物纯度及后续的利用＼[18＼]。可以看到，在30～80 ℃的范围内，随提取温度的升高，无患子皂苷得率先增加后减少。为了降低能耗，并保证无患子皂苷得率较高，在工业化提取无患子皂苷时可将提取温度设定在60 ℃。
4）提取时间对无患子皂苷含量的影响。提取时间决定了无患子果皮与溶剂的相互作用是否充分，从而影响无患子皂苷得率。取40 mL体积分数为60%的乙醇溶液与4.0 g无患子果皮粉末按1∶10的料液比混合均匀，在60 ℃条件下分别提取0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 h，无患子皂苷得率如图7所示。可以看到，随着提取时间由0.5 h增加至2.0 h，无患子皂苷的得率从6.94±0.38%迅速增加到14.97±0.55%，增幅达115.71%。而当提取时间继续增加2 h达到4.0 h時，皂苷得率增至16.37±0.85%，但增幅仅为9.35%。在0.5～4 h范围内，随提取时间的增长，无患子皂苷的得率先快速增加后趋于稳定。这是因为，随着提取时间的增加，无患子果皮中的各物质组分会逐渐扩散到溶剂中，当溶于溶剂中的组分逐步溶解到达一定浓度后，其扩散速度变缓，物质的量趋于平衡＼[19＼]。在实验中，提取时间达到2.0 h就基本能完全提取无患子中的皂苷成分，再增加提取时间不仅在工业化生产时增加能耗，还有可能使更多杂质析出，影响皂苷质量，因此将提取时间设定为2.0 h。
5）料液比对无患子皂苷含量的影响。料液比是皂苷提取过程中影响提取率的重要因素。如果料液比太小则对皂苷提取不足，料液比太大会造成提取液后处理的工作量大，且增加成本，因此必须选择合适的料液比提取皂苷。分别取体积分数为60%的乙醇溶液16、24、32、40、60、80 mL与4.0 g无患子果皮粉末按1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15、1∶20的料液比混合均匀，在60 ℃条件下提取2 h，得到料液比与无患子皂苷得率的关系如图8所示。在料液比为1∶4～1∶20的范围内，随着溶剂的增加，无患子皂苷的得率先增加后减小。无患子皂苷的提取是依靠固-液浓度差作为推动力，在料液比为1∶4～1∶10范围内，随提取溶剂占比的增加，溶剂量越大，物质与溶剂之间浓度差就越大，推动力就越大，越有利于皂苷的传质速率＼[20＼]，因此皂苷的提取率由8.77±1.26%增加了近一倍，达到1497±0.55%。然而，在料液比由1∶10继续增大到1∶20的过程中，溶剂量过大，不利于皂苷与乙醇间充分循环交换＼[21＼]，此外，还会有其它杂质析出进入体系，使浸提液黏度增大，扩散速度变慢，导致皂苷类化合物难溶出，因此，皂苷的提取率逐渐降低。因此，在料液比为1∶10，即提取溶剂乙醇的量为无患子果皮粉末质量的10倍时有利于无患子皂苷提取的工业化应用。
通过单因素实验，得到采取常规加热回流法提取皂苷时，适用于工业化应用的工艺条件为：取无患子果皮粉末与体积分数为60%的乙醇以料液比1∶10混合，在60 ℃条件下提取2 h，可以得到无患子皂苷的得率为14.97%，该得率较低，不适于工业化生产。
2.2.2超声辅助加热回流提取工艺的研究
超声波可以提供能量，将强烈的震动能传递给无患子粉末和溶剂，粉碎无患子细胞，加快胞内物质的释放，提高皂苷得率。因此，在前期实验的基础上，采用超声辅助的方法，分别选取提取时间0.75 h、1.0 h、2.0 h，料液比1∶3、1∶7、1∶10，提取温度40 ℃、50 ℃、60 ℃进行L9（34）正交试验，直观分析和方差分析结果见表1。
由表1可以看到，借助超声辅助加热回流法提取的皂苷得率（13.13%～21.56%）比常规加热回流法提取的皂苷得率（5.57%～14.97%）有显著提高。按照极值分析，各因素对无患子皂苷得率的影响从大到小排序为：提取时间（A）>提取温度（C）>料液比（B）。以得率为目标函数时，各因素应选择具有较大K值的水平，各因素最佳水平为A2B3C3，即最佳工艺条件为：提取时间1.0 h，提取温度50 ℃，料液比为1∶10。由于料液比对皂苷得率影响最小，为了降低提取成本，最终选择料液比1∶7作为提取条件，在此条件下无患子皂苷的得率为21.56%，比常规加热回流法工业化条件下提取的皂苷得率提高了44.02%。
3.结论
1）采用加热回流法提取无患子中皂苷时，在单因素实验中，随乙醇体积分数（15%～100%）、提取温度（30 ℃～90 ℃）、料液比（1∶4～1∶20）的增大，皂苷得率先升高再下降。随提取时间（0.5～4.0 h）的增加，皂苷得率持续增加。综合考虑皂苷得率及成本，最终确定加热回流法提取皂苷的工艺参数为：无患子果皮粉末与体积分数为60%的乙醇以料液比1∶10混合，在60℃条件下提取2 h，此时无患子皂苷的得率为14.97%。
2）采用超声辅助加热回流法提取时，通过正交试验发现：3个实验因素按照对得率的影响的主次关系为：提取时间>提取温度>料液比，最具工业化应用潜力的工艺条件为：无患子果皮粉末与体积分数为60%的乙醇以料液比1：7混合，在50 ℃下提取1 h，在此条件下无患子皂苷的得率为21.56%，与加热回流法相比提高了44.02%。 3）超声辅助加热回流法不仅可以通过强度适中的超声作用产生能量有效促进皂苷和乙醇之间的固-液传质，还能够缩短提取时间、降低提取温度、节省溶剂，且该工艺设备简单能耗小，是一种具有工业化潜力的无患子皂苷提取新方法。
参考文献：
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中图分类号：S 789文献标识码：A文章编号：1672-7312（2021）03-0275-06
Study on the New Technology of Ultrasonicassisted
Reflux Extraction of Sapindus SaponinsZHAO Lu1，2，ZHANG Lei1
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2.Office of International Exchange and Cooperation，Xi’an University of Science and Technology，Xi’an 710054，China）Abstract：In order to find a new efficient，environmentalfriendly extraction technology with industrialization potential for Sapindus saponins，reflux method was firstly explored.The effect of solvent type，solvent volume fraction，extraction temperature，extraction time and solidliquid ratio on Sapindus saponins yield was studied by single factor experiment.On this basis，orthogonal experiment of three selected key factors of extraction temperature，extraction time and solidliquid ratio was conducted to determine the optimal condition for Sapindus saponins extraction by ultrasonicassisted reflux extraction method.The yield of Sapindus saponins was 21.56% under the optimal condition of ethanol volume fraction of 60%，solidliquid ratio of 1∶7，extraction temperature of 50 ℃ and extraction time of 1 h，which was 44.02% higher than that of reflux extraction method.，and the extraction time was shorter and the extraction temperature was lower.Ultrasonicassisted reflux extraction is a new technology for Sapindus saponin extraction with industrial potential.
Key words：sapindus saponins;reflux method;ultrasonicassisted extraction;yield;orthogonal experiment
0引言
近年来，以无患子皂苷为代表的天然表面活性剂因表面活性好、可完全降解、毒性低、生物相容性好、来源广泛、可适应某些极端条件等优点＼[1-2＼]，被国内外大量学者认为具有替代化学表面活性剂的潜力＼[3＼]。无患子树（sapindus mukurossi geartn）是一种广泛分布于我国长江流域以南各地的植物，果皮中通常含有大量皂苷，皂苷质量分数可达7～27 wt%＼[4＼]。皂苷主要以苷元作为疏水基团通过醚键或脂键连接在亲水糖链上，这样的双亲结构为皂苷提供了较高的表面活性，使皂苷成为一种天然的非离子表面活性剂＼[5＼]，被广泛应用于日化、制药、环境修复等多个领域，并取得了较好的效果＼[6-7＼]。
第3期赵璐等：超声辅助加热回流法提取无患子皂苷新工艺的研究找到一种高效、经济的提取方法是无患子皂苷大规模工业化应用的关键技术和前提。溶剂提取法是目前皂苷提取最常用的方法之一＼[8＼]，利用甲醇、乙醇等溶剂对不同溶解度的各项成分进行分步提取，具有操作简单、成本低等优点，但是皂苷得率较低＼[9＼]，因此，常用超临界CO2萃取＼[10＼]、亚临界水萃取＼[11＼]、微波辅助提取＼[12＼]、减压提取＼[13＼]等外界环境辅助的方法提高皂苷得率。DAHMOUNE等人＼[14＼]采用响应面分析法获得了微波辅助提取法的最优工艺，在此条件下得到的皂苷得率比传统溶剂提取法高7.82倍。BITENCOURT等人＼[15＼]研究了超临界提取工艺顺序对得率的影响，根据溶剂极性确定提取顺序的原则，确定了按超临界CO2-超临界CO2/乙醇混合物-乙醇-水的顺序依次提取的规律，指出超临界CO2/乙醇混合是提高皂苷得率的关键。王维坚＼[16＼]等人研究了超声法提取人参总皂苷的最佳工艺，且通过与回流法对比，证明超声法的提取效果更好。ELHAG等＼[17＼]用連续提取法从东革阿里的根中提取皂苷，利用超声辅助-水提法的提取时间为5.5～10 min，远小于水提法20～25 min的提取时间，提取效率大幅度提高。其中，超声辅助提取是最常用的方法之一，它利用超声作用对溶剂产生的强冲击、微射流，促进有效成分与溶剂之间的固-液传质，同时强度适中、热效应低，可以保护有效成分的活性，提高有效成分的提取率，因此，成为天然产物活性组分提取工艺的研究热点，然而该方法在无患子皂苷提取中的应用还较少。 文中将以无患子果皮为原料，采用超声辅助-加热回流法提取皂苷，在单因素试验基础上选取提取温度、温度时间、料液比3个关键因素进行正交试验，以期找到一种高效、环保、具备工业化潜力的无患子皂苷提取方法。
1实验原料及方法
1.1实验材料
无患子果皮：安国市仟曹御颜坊中药材有限公司;无水乙醇：分析纯级，天津富宇精细化工有限公司;甲醇：分析纯级，天津市大茂化学试剂厂;丙酮：分析纯级，天津富宇精细化工有限公司;香草醛：分析纯级，天津市科密欧化学试剂有限公司;浓硫酸：分析纯级，天津市富宇精细化工有限公司;冰醋酸：分析纯级，天津市富宇精细化工有限公司;齐墩果酸标准品：上海麦克林生物化学有限公司;溴化钾：光谱纯级，上海麦克林生物化学有限公司;实验用水为去离子水。
1.2实验方法
1.2.1无患子皂苷含量的测定
由于无患子果皮中含有的皂苷主要为齐墩果酸三萜皂苷，目前研究均以齐墩果酸作为无患子皂苷含量评价的标准品。文中通过绘制标准品的浓度-质量标准曲线来测定样品中的皂苷含量。
齐墩果酸标准曲线的测定：称取干燥的齐墩果酸标准品2.5 mg加入无水乙醇使其定容到25 mL，得到0.1 mg/mL齐墩果酸标准溶液。准备8支干燥洁净的10 mL具塞试管，移取0.1 mg/mL齐墩果酸标准溶液0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8，2.1 mL分别加入其中，将试管置于80℃真空干燥箱中使溶剂完全挥发，然后向每只试管依次加入0.2 mL的5%香草醛-冰醋酸显色溶液和0.8 mL浓硫酸，摇匀后在60℃恒温水浴锅（W501型，上海申顺生物科技有限公司）中加热15 min，显色停止后立即将试管置于冰水中3 min，待冷却后再向每只试管加入5 mL冰醋酸，摇晃均匀后，用紫外分光光度计（UV-5，瑞士梅特勒-托利多公司）在400～600 nm扫描光谱，确定最大吸收波长，在该波长下测定溶液吸光度的值。用加入0 mL齐墩果酸标准溶液的试管做参照对比。5%的香草醛-冰醋酸溶液需要现配现用。称取一定量的本实验得到的无患子皂苷提取物，溶解于无水乙醇中，用25 mL的容量瓶定容，配制成无患子皂苷的测试溶液，用移液管精确称取0.1 mL测试溶液至比色管，用香草醛-浓硫酸显色法测定样品溶液的吸光度，并根据标准曲线计算皂苷含量和皂苷提取率。
1.2.2无患子提取工艺研究
将市购的无患子果壳用清水洗净后烘干，用粉碎机粉碎到粉末状过筛（100目标准筛），称取一定量的无患子果皮粉末与溶剂混匀在不同条件下提取，得到的提取液经0.45 μm滤膜过滤后在离心机中（6-16S型，德国Sigma公司）以5 000 r/min的转速离心10 min，取出上清液再进行旋转蒸发（RE-2000A型，上海亚荣公司）得到膏状浓缩物，置于冰箱中冷藏可结晶得到固态的皂苷提取物，提取流程如图1所示。
1）常规溶剂加热回流提取：考察不同提取溶剂种类（水、乙醇、甲醇、丙酮）、提取溶剂体积分数（15%、30%、45%、60%、75%、100%），提取温度（30、40、50、60、70、80 ℃）、提取时间（0.5、1、1.5、2、3、4 h）、料液比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶0、1∶15∶1∶20）对皂苷得率的影响。
2）超声辅助加热回流提取：在单因素的基础上，采用恒温超声波提取机（VS-65UE型，无锡沃信仪器有限公司）产生的超声辅助提取，选定超声功率为100 W（无患子皂苷超声辅助提取及洗涤性能研究），选取提取温度、提取时间和料液比3个因素通过正交试验法，以皂苷得率为目标函数优化工艺。
2实验结果与分析
2.1无患子皂苷总含量的测定
由于齐墩果酸型五环三萜皂苷没有共轭体系，因此需要通过三萜皂苷在硫酸、高氯酸等Lewis酸作用下，经过脱水、双键位移、缩合等一系列反应产生有色或荧光物质来进行定量＼[7＼]。无患子皂苷提取物和香草醛进行显色反应后，在540 nm波长处有较大吸收峰（图2），因此将540 nm选为吸光度测试波长，测定不同质量齐墩果酸对应吸光度的值，拟合得到标准曲线（图3），进行线性回归后得到方程：y=0.005 9 x+0.062 57（R2=0.992 1），说明齐墩果酸在30～210 μg范围内，与吸光度呈现良好的线性关系，可作为齐墩果酸型皂苷含量评价的标准曲线。
2.2无患子皂苷提取工艺研究
2.2.1加热回流法提取皂苷工艺
1）提取溶剂对无患子皂苷含量的影响。溶剂的种类直接影响其穿透无患子细胞的能力，进而影响皂苷的提取率。皂苷类化合物分子具有双亲结构，可用水或甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂提取。分别取40 mL去离子水、100%乙醇、100%甲醇、100%丙酮与4.0 g无患子果皮粉末按1∶10的料液比混合均匀，在60 ℃条件下提取2 h，无患子皂苷的得率如图4所示。可以看出，与3种有机溶剂提取无患子皂苷的得率相较，用水提取皂苷的得率最低，仅为6.51±1.04%。在3种有机溶剂中，甲醇作为溶剂提取的无患子皂苷得率最高，达到13.48±0.83%，这与金秋等人的研究结果一致＼[17＼]。然而由于甲醇具有毒性，并且溶解度高，在无患子提取过程中一些单糖、蛋白质、氨基酸等杂质也会被提取出来，降低了提取物中的皂苷纯度，不宜用于大规模工业化生产。用乙醇提取无患子皂苷的得率为10.91±1.34%，稍低于甲醇的得率，考虑到提取物的纯度、生产过程及产品的安全性等因素，后续实验将选择乙醇作为无患子皂苷的提取溶剂。
2）乙醇体积分数对无患子皂苷含量的影响。乙醇的体积分数决定了无患子果皮细胞内外的渗透压大小，影响细胞内物质的渗出和皂苷得率。分别取40 mL体积分数为15%、30%、45%、60%、80%，100%的乙醇与4.0 g无患子果皮的粉末按1：10的料液比混合均匀，在60 ℃条件下提取2 h，无患子皂苷的得率如图5所示。在乙醇体积分数为15%～90%的范围内，随乙醇体积分数的增加，无患子皂苷的得率先增大后減小。当乙醇体积分数由15%增大到60%时，无患子皂苷的得率也由6.02±0.39%增加到14.97±0.55%，达到皂苷得率的最大值。而后，随乙醇体积分数由60%继续增大到90%时，皂苷得率逐渐减小。这可能是因为部分皂苷类化合物是水溶性物质，当乙醇体积分数过高时，一些杂质溶出增多，与水溶性皂苷竞争溶剂，导致皂苷溶出减少，使皂苷的得率下降。因此，选择体积分数为60%的乙醇作为提取溶剂，进一步优化提取条件。 3）提取温度对无患子皂苷含量的影响。温度会影响乙醇分子和无患子果皮中各类物质的运动速度和扩散速度，进而影响皂苷的得率。取40 mL体积分数为60%的乙醇溶液与4.0 g无患子果皮粉末按1∶10的料液比混合均匀，分别在30、40、50、60、70、80 ℃条件下提取2 h，得到无患子皂苷的得率如图6所示。由图可以看到，在30～60 ℃范围内，皂苷得率随温度的上升快速增加，由7.66±0.73%增至15.32±0.29%。这是因为无患子皂苷易溶于乙醇，随着温度升高，无患子果皮中各物质分子运动更激烈，扩散的速度也更快，有助于皂苷迁移溶出。当提取温度由60 ℃升至70 ℃时，皂苷提取率略有上升，变化不明显。超过70 ℃后，随温度上升，皂苷得率开始下降。这可能是因为温度过高破坏了无患子皂苷的活性成分，造成部分皂苷水解，生成副产物，皂苷提取率下降，影响提取物纯度及后续的利用＼[18＼]。可以看到，在30～80 ℃的范围内，随提取温度的升高，无患子皂苷得率先增加后减少。为了降低能耗，并保证无患子皂苷得率较高，在工业化提取无患子皂苷时可将提取温度设定在60 ℃。
4）提取时间对无患子皂苷含量的影响。提取时间决定了无患子果皮与溶剂的相互作用是否充分，从而影响无患子皂苷得率。取40 mL体积分数为60%的乙醇溶液与4.0 g无患子果皮粉末按1∶10的料液比混合均匀，在60 ℃条件下分别提取0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 h，无患子皂苷得率如图7所示。可以看到，随着提取时间由0.5 h增加至2.0 h，无患子皂苷的得率从6.94±0.38%迅速增加到14.97±0.55%，增幅达115.71%。而当提取时间继续增加2 h达到4.0 h時，皂苷得率增至16.37±0.85%，但增幅仅为9.35%。在0.5～4 h范围内，随提取时间的增长，无患子皂苷的得率先快速增加后趋于稳定。这是因为，随着提取时间的增加，无患子果皮中的各物质组分会逐渐扩散到溶剂中，当溶于溶剂中的组分逐步溶解到达一定浓度后，其扩散速度变缓，物质的量趋于平衡＼[19＼]。在实验中，提取时间达到2.0 h就基本能完全提取无患子中的皂苷成分，再增加提取时间不仅在工业化生产时增加能耗，还有可能使更多杂质析出，影响皂苷质量，因此将提取时间设定为2.0 h。
5）料液比对无患子皂苷含量的影响。料液比是皂苷提取过程中影响提取率的重要因素。如果料液比太小则对皂苷提取不足，料液比太大会造成提取液后处理的工作量大，且增加成本，因此必须选择合适的料液比提取皂苷。分别取体积分数为60%的乙醇溶液16、24、32、40、60、80 mL与4.0 g无患子果皮粉末按1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15、1∶20的料液比混合均匀，在60 ℃条件下提取2 h，得到料液比与无患子皂苷得率的关系如图8所示。在料液比为1∶4～1∶20的范围内，随着溶剂的增加，无患子皂苷的得率先增加后减小。无患子皂苷的提取是依靠固-液浓度差作为推动力，在料液比为1∶4～1∶10范围内，随提取溶剂占比的增加，溶剂量越大，物质与溶剂之间浓度差就越大，推动力就越大，越有利于皂苷的传质速率＼[20＼]，因此皂苷的提取率由8.77±1.26%增加了近一倍，达到1497±0.55%。然而，在料液比由1∶10继续增大到1∶20的过程中，溶剂量过大，不利于皂苷与乙醇间充分循环交换＼[21＼]，此外，还会有其它杂质析出进入体系，使浸提液黏度增大，扩散速度变慢，导致皂苷类化合物难溶出，因此，皂苷的提取率逐渐降低。因此，在料液比为1∶10，即提取溶剂乙醇的量为无患子果皮粉末质量的10倍时有利于无患子皂苷提取的工业化应用。
通过单因素实验，得到采取常规加热回流法提取皂苷时，适用于工业化应用的工艺条件为：取无患子果皮粉末与体积分数为60%的乙醇以料液比1∶10混合，在60 ℃条件下提取2 h，可以得到无患子皂苷的得率为14.97%，该得率较低，不适于工业化生产。
2.2.2超声辅助加热回流提取工艺的研究
超声波可以提供能量，将强烈的震动能传递给无患子粉末和溶剂，粉碎无患子细胞，加快胞内物质的释放，提高皂苷得率。因此，在前期实验的基础上，采用超声辅助的方法，分别选取提取时间0.75 h、1.0 h、2.0 h，料液比1∶3、1∶7、1∶10，提取温度40 ℃、50 ℃、60 ℃进行L9（34）正交试验，直观分析和方差分析结果见表1。
由表1可以看到，借助超声辅助加热回流法提取的皂苷得率（13.13%～21.56%）比常规加热回流法提取的皂苷得率（5.57%～14.97%）有显著提高。按照极值分析，各因素对无患子皂苷得率的影响从大到小排序为：提取时间（A）>提取温度（C）>料液比（B）。以得率为目标函数时，各因素应选择具有较大K值的水平，各因素最佳水平为A2B3C3，即最佳工艺条件为：提取时间1.0 h，提取温度50 ℃，料液比为1∶10。由于料液比对皂苷得率影响最小，为了降低提取成本，最终选择料液比1∶7作为提取条件，在此条件下无患子皂苷的得率为21.56%，比常规加热回流法工业化条件下提取的皂苷得率提高了44.02%。
3.结论
1）采用加热回流法提取无患子中皂苷时，在单因素实验中，随乙醇体积分数（15%～100%）、提取温度（30 ℃～90 ℃）、料液比（1∶4～1∶20）的增大，皂苷得率先升高再下降。随提取时间（0.5～4.0 h）的增加，皂苷得率持续增加。综合考虑皂苷得率及成本，最终确定加热回流法提取皂苷的工艺参数为：无患子果皮粉末与体积分数为60%的乙醇以料液比1∶10混合，在60℃条件下提取2 h，此时无患子皂苷的得率为14.97%。
2）采用超声辅助加热回流法提取时，通过正交试验发现：3个实验因素按照对得率的影响的主次关系为：提取时间>提取温度>料液比，最具工业化应用潜力的工艺条件为：无患子果皮粉末与体积分数为60%的乙醇以料液比1：7混合，在50 ℃下提取1 h，在此条件下无患子皂苷的得率为21.56%，与加热回流法相比提高了44.02%。 3）超声辅助加热回流法不仅可以通过强度适中的超声作用产生能量有效促进皂苷和乙醇之间的固-液传质，还能够缩短提取时间、降低提取温度、节省溶剂，且该工艺设备简单能耗小，是一种具有工业化潜力的无患子皂苷提取新方法。
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