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[摘要]目的探讨S100A2在多发性骨髓瘤（MM）病人骨髓单个核细胞中的表达及临床意义。方法选取2013年3月-2016年12月在我院初診的MM病人62例，选取同期因单纯性贫血治疗的35例病人作为对照组。MM病人分别于入院后和4个大疗程结束时，对照组于入院时，采用实时荧光定量PCR技术检测骨髓单个核细胞中S100A2的表达。结果MM病人骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量为1.29±0.12，对照组为2.30±0.17，差异有统计学意义（t=34.127，P<0.01）。MM病人骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量与国际分期系统（ISS）分期、骨质破坏和髓外浸润有关（t=4.659～50.312，P<0.01）。缓解组MM病人治疗前和治疗后骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量均高于未缓解组，差异有统计学意义（t=5.289、8.559，P<0.01）；两组病人治疗后骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量均高于治疗前，差异有统计学意义（t=9.687、5.052，P<0.01）。结论S100A2在MM病人骨髓单个核细胞中呈低表达，且其表达与MM发生、进展、浸润及治疗效果有关。
[关键词]多发性骨髓瘤；S100蛋白质类；骨髓
多发性骨髓瘤（MM）作为起源于骨髓内浆细胞的常见血液系统恶性肿瘤，好发于中老年人群，以浆细胞大量克隆性增殖为主要特点，多数病人会出现破坏性溶骨病变和（或）骨质疏松，严重威胁病人生存质量甚至生命。目前，MM尚没有特效的治疗手段，随着新型化疗药物的出现及联合化疗的应用，MM病人生存质量得到很大改善，但多数病人最终会出现化疗耐药而影响预后。因此，深入探讨MM发病机制并在基因水平寻找新的治疗方向已成为临床研究的重点。S100作为主要的钙离子结合蛋白家族亚类，在调控细胞分化、细胞周期、细胞结构、细胞外基质分泌及钙稳态等过程中发挥重要作用。S100A2是S100家族重要成员，不仅参与调控多项生理病理过程，而且在肿瘤发生及进展中发挥重要作用。本研究拟检测MM病人骨髓单个核细胞中S100A2的表达，分析其与MM临床病理特征之间的关系，以期为MM发病机制研究提供参考资料。
1资料与方法
1.1一般资料
选取2013年3月-2016年12月在我院初诊的MM病人62例，男37例，女25例；年龄38～81岁，平均（60.6±8.7）岁。MM均符合《中国多发性骨髓瘤诊治指南（2013年修订）》中的诊断标准。按照国际分期系统（ISS）标准分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期17例，Ⅲ期31例；免疫分型IgG型31例，IgA型17例，轻链型14例。选取同期因单纯性贫血治疗的35例病人作为对照组，均排除血液系统肿瘤，其中男21例，女14例；年龄36～79岁，平均（59.2±8.3）岁。两组病人性别、年龄差异无统计学意义。本研究获得医院伦理委员会批准，病人或家属均签署知情同意书。
1.2方法
1.2.1治疗方法所有MM病人均接受补充营养、纠正水电解质紊乱等常规治疗，并进行VAD方案化疗：长春新碱0.4 mg+多柔比星9 mg/㎡，连续静滴4 d，地塞米松40 mg/d口服，4 d作为1个小疗程，28 d作为1个大疗程。4个大疗程后，采用国际骨髓瘤工作组（IMWG）制定的疗效标准将病人分为缓解组（达到部分缓解及以上）和未缓解组（未达到部分缓解）。
1.2.2骨髓单个核细胞中S100A2表达的实时荧光定量PCR检测
MM病人分别于入院后和4个大疗程结束时，对照组于入院时，分别采集其骨髓2 mL，置于EDTA抗凝管中，加人PBS液1～2 mL稀释，混合均匀，将等量淋巴细胞分离液（美国TBD公司）缓慢加人，静置后收集单个核细胞，保存于一80℃冰箱备用。取单个核细胞，室温下解冻，加入细胞裂解液，用Trizol总RNA提取试剂盒（美国Invitrogen公司）提取单个核细胞中总RNA，洗涤后电泳，应用紫外线分光光度计检测总RNA纯度，以A200/A280在1.80～2.30内为合格。根据反转录试剂盒（荷兰Qiagen公司）说明书将总RNA逆转录为cDNA。在冰上配制反应体系，每个样品设3个平行反应复孔。应用PCR试剂盒（荷兰Qiagen公司）进行引物扩增。S100A2引物序列：上游为5'-GTGCTGAAG-TGTTGACTGAAGGG-3'，下游为5'-GGCAGGAGAATGGCGTGAA-3'；GAPDH引物序列：5'-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3'。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃30 s，60℃30 s，76℃30 s，共循环36次。以GAPDH为内参照，采用2方法计算两组骨髓单个核细胞中S100A2的相对表达量。
1.2.3统计学处理应用SPSS 21.0软件进行统计学处理，计量资料数据以x±s表示，两组间比较采用t检验，同组病人治疗前后比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1MM组和对照组骨髓单个核细胞中S100A2表达比较
MM病人骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量为1.29±0.12，对照组为2.30±0.17，差异有统计学意义（t=34.127，P<0.01）。
2.2 MM病人骨髓单个核细胞中S100A2表达与临床病理特征的关系
MM骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量与病人年龄、性别、免疫分型、免疫表型无关（P>0.05），而与ISS分期、骨质破坏和髓外浸润有关（t=4.659～50.312，Pd0.01）。见表1。
2.3不同疗效MM病人治疗前后骨髓单个核细胞中S100A2表达变化 缓解组MM病人治疗前和治疗后骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量均高于未缓解组，差异有显著性（t=5.289、8.559，P<0.01）；两组病人治疗后骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量均高于治疗前，差异有统计学意义（t=9.687、5.052，P%0.01）。见表2。
3讨论
MM为最常见的发生于骨的淋巴造血系统的恶性肿瘤，其发病机制尚未完全清楚。研究表明，MM病人中超过90%发生溶骨性骨疾病，常伴有高钙血症及骨相关事件。S100蛋白家族是重要的钙结合蛋白，与钙离子有高度的亲和力，可通过与钙离子结合，在细胞生长、代谢、迁移等多种生物学功能中发挥重要作用，同时，与多种恶性肿瘤的发生及进展关系密切。有研究表明，S100A6在MM病人骨髓组织中呈高表达，与MM发生、进展及髓外转移有关。S100A2也是S100蛋白家族重要成员，由两个EF-手型结构组成，可与钙离子结合而参与一系列生理病理过程，在多种恶性肿瘤组织中表达异常，且与肿瘤增殖、分化、浸润、转移及预后密切相关。S100A2在调控肿瘤发生时具有两面性，在肝癌、胃癌等恶性肿瘤中发挥抑癌因子功能，而在胰腺癌、肺癌等恶性肿瘤中起促癌因子作用。本研究结果显示，MM病人骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量显著低于对照组，说明S100A2在MM中呈低表达，提示S100A2可能发挥抑癌因子功能而参与MM发病过程。
本文研究结果显示，MM病人骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量与ISS分期有关，随着ISS分期增加S100A2表达逐渐降低，而ISS分期是反映MM病人病情进展的主要指标，这进一步说明S100A可能作为抑癌基因参与了MM进展过程。本文结果显示，发生骨质破坏的MM病人骨髓单个核细胞中S100A2表达量较无骨质破坏病人降低，说明S100A2与MM发生骨质破坏有关。MM作为一种骨髓中浆细胞增生异常所致疾病，一般情况下病变仅局限在骨髓，但少数情况下会累及软组织，发生髓外病变。有研究表明，S100A2在肿瘤浸润、转移中发挥重要作用。本研究结果显示，髓外浸润病人骨髓单个核细胞中S100A2表达量较无髓外浸润病人降低，说明S100A2与MM病人髓外浸润密切相关，可能参与了髓外病变的发生。本研究结果还显示，缓解组MM病人治疗前和治疗后骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量均显著高于未缓解组，两组病人治疗后骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相對表达量均显著高于治疗前，说明骨髓单个核细胞中S100A2表达与病人治疗效果密切相关，有望成为指导治疗的生物学指标。
综上所述，S100A2在MM病人骨髓单个核细胞中呈低表达，且其表达与MM发生、进展、浸润及治疗效果有关，S100A2有望成为评估MM病人病情及治疗效果新的生物学指标。
[关键词]多发性骨髓瘤；S100蛋白质类；骨髓
多发性骨髓瘤（MM）作为起源于骨髓内浆细胞的常见血液系统恶性肿瘤，好发于中老年人群，以浆细胞大量克隆性增殖为主要特点，多数病人会出现破坏性溶骨病变和（或）骨质疏松，严重威胁病人生存质量甚至生命。目前，MM尚没有特效的治疗手段，随着新型化疗药物的出现及联合化疗的应用，MM病人生存质量得到很大改善，但多数病人最终会出现化疗耐药而影响预后。因此，深入探讨MM发病机制并在基因水平寻找新的治疗方向已成为临床研究的重点。S100作为主要的钙离子结合蛋白家族亚类，在调控细胞分化、细胞周期、细胞结构、细胞外基质分泌及钙稳态等过程中发挥重要作用。S100A2是S100家族重要成员，不仅参与调控多项生理病理过程，而且在肿瘤发生及进展中发挥重要作用。本研究拟检测MM病人骨髓单个核细胞中S100A2的表达，分析其与MM临床病理特征之间的关系，以期为MM发病机制研究提供参考资料。
1资料与方法
1.1一般资料
选取2013年3月-2016年12月在我院初诊的MM病人62例，男37例，女25例；年龄38～81岁，平均（60.6±8.7）岁。MM均符合《中国多发性骨髓瘤诊治指南（2013年修订）》中的诊断标准。按照国际分期系统（ISS）标准分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期17例，Ⅲ期31例；免疫分型IgG型31例，IgA型17例，轻链型14例。选取同期因单纯性贫血治疗的35例病人作为对照组，均排除血液系统肿瘤，其中男21例，女14例；年龄36～79岁，平均（59.2±8.3）岁。两组病人性别、年龄差异无统计学意义。本研究获得医院伦理委员会批准，病人或家属均签署知情同意书。
1.2方法
1.2.1治疗方法所有MM病人均接受补充营养、纠正水电解质紊乱等常规治疗，并进行VAD方案化疗：长春新碱0.4 mg+多柔比星9 mg/㎡，连续静滴4 d，地塞米松40 mg/d口服，4 d作为1个小疗程，28 d作为1个大疗程。4个大疗程后，采用国际骨髓瘤工作组（IMWG）制定的疗效标准将病人分为缓解组（达到部分缓解及以上）和未缓解组（未达到部分缓解）。
1.2.2骨髓单个核细胞中S100A2表达的实时荧光定量PCR检测
MM病人分别于入院后和4个大疗程结束时，对照组于入院时，分别采集其骨髓2 mL，置于EDTA抗凝管中，加人PBS液1～2 mL稀释，混合均匀，将等量淋巴细胞分离液（美国TBD公司）缓慢加人，静置后收集单个核细胞，保存于一80℃冰箱备用。取单个核细胞，室温下解冻，加入细胞裂解液，用Trizol总RNA提取试剂盒（美国Invitrogen公司）提取单个核细胞中总RNA，洗涤后电泳，应用紫外线分光光度计检测总RNA纯度，以A200/A280在1.80～2.30内为合格。根据反转录试剂盒（荷兰Qiagen公司）说明书将总RNA逆转录为cDNA。在冰上配制反应体系，每个样品设3个平行反应复孔。应用PCR试剂盒（荷兰Qiagen公司）进行引物扩增。S100A2引物序列：上游为5'-GTGCTGAAG-TGTTGACTGAAGGG-3'，下游为5'-GGCAGGAGAATGGCGTGAA-3'；GAPDH引物序列：5'-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3'。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃30 s，60℃30 s，76℃30 s，共循环36次。以GAPDH为内参照，采用2方法计算两组骨髓单个核细胞中S100A2的相对表达量。
1.2.3统计学处理应用SPSS 21.0软件进行统计学处理，计量资料数据以x±s表示，两组间比较采用t检验，同组病人治疗前后比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1MM组和对照组骨髓单个核细胞中S100A2表达比较
MM病人骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量为1.29±0.12，对照组为2.30±0.17，差异有统计学意义（t=34.127，P<0.01）。
2.2 MM病人骨髓单个核细胞中S100A2表达与临床病理特征的关系
MM骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量与病人年龄、性别、免疫分型、免疫表型无关（P>0.05），而与ISS分期、骨质破坏和髓外浸润有关（t=4.659～50.312，Pd0.01）。见表1。
2.3不同疗效MM病人治疗前后骨髓单个核细胞中S100A2表达变化 缓解组MM病人治疗前和治疗后骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量均高于未缓解组，差异有显著性（t=5.289、8.559，P<0.01）；两组病人治疗后骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量均高于治疗前，差异有统计学意义（t=9.687、5.052，P%0.01）。见表2。
3讨论
MM为最常见的发生于骨的淋巴造血系统的恶性肿瘤，其发病机制尚未完全清楚。研究表明，MM病人中超过90%发生溶骨性骨疾病，常伴有高钙血症及骨相关事件。S100蛋白家族是重要的钙结合蛋白，与钙离子有高度的亲和力，可通过与钙离子结合，在细胞生长、代谢、迁移等多种生物学功能中发挥重要作用，同时，与多种恶性肿瘤的发生及进展关系密切。有研究表明，S100A6在MM病人骨髓组织中呈高表达，与MM发生、进展及髓外转移有关。S100A2也是S100蛋白家族重要成员，由两个EF-手型结构组成，可与钙离子结合而参与一系列生理病理过程，在多种恶性肿瘤组织中表达异常，且与肿瘤增殖、分化、浸润、转移及预后密切相关。S100A2在调控肿瘤发生时具有两面性，在肝癌、胃癌等恶性肿瘤中发挥抑癌因子功能，而在胰腺癌、肺癌等恶性肿瘤中起促癌因子作用。本研究结果显示，MM病人骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量显著低于对照组，说明S100A2在MM中呈低表达，提示S100A2可能发挥抑癌因子功能而参与MM发病过程。
本文研究结果显示，MM病人骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量与ISS分期有关，随着ISS分期增加S100A2表达逐渐降低，而ISS分期是反映MM病人病情进展的主要指标，这进一步说明S100A可能作为抑癌基因参与了MM进展过程。本文结果显示，发生骨质破坏的MM病人骨髓单个核细胞中S100A2表达量较无骨质破坏病人降低，说明S100A2与MM发生骨质破坏有关。MM作为一种骨髓中浆细胞增生异常所致疾病，一般情况下病变仅局限在骨髓，但少数情况下会累及软组织，发生髓外病变。有研究表明，S100A2在肿瘤浸润、转移中发挥重要作用。本研究结果显示，髓外浸润病人骨髓单个核细胞中S100A2表达量较无髓外浸润病人降低，说明S100A2与MM病人髓外浸润密切相关，可能参与了髓外病变的发生。本研究结果还显示，缓解组MM病人治疗前和治疗后骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相对表达量均显著高于未缓解组，两组病人治疗后骨髓单个核细胞中S100A2 mRNA相對表达量均显著高于治疗前，说明骨髓单个核细胞中S100A2表达与病人治疗效果密切相关，有望成为指导治疗的生物学指标。
综上所述，S100A2在MM病人骨髓单个核细胞中呈低表达，且其表达与MM发生、进展、浸润及治疗效果有关，S100A2有望成为评估MM病人病情及治疗效果新的生物学指标。