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摘 要: 目的:探讨低氧运动对大鼠骨骼肌蛋白量及p70S6K的影响。方法:SD大鼠分为四组: 常氧安静组、低氧安静组、常氧训练组、高住低训组。常氧安静组在常氧环境下安静生活; 低氧安静组在氧浓度13.6% 低氧舱内安静生活;常氧训练组和高住低训组进行4周的跑台 运动,每天训练1 h,每周训练6 d。高住低训组晚上在氧浓度13.6% 低氧舱内低氧暴露。 结果:28 d后,与对照组比较,高住低训组骨骼肌总蛋白浓度显著下降(p<0.01),p 70S6K蛋白表达显著增加(p<0.05),p70S6K(Thr389)磷酸化水平显著降低 (p<0.01);常氧训练组p70S6K蛋白表达显著增加(p<0.05);低氧安静 组p70S6K(Thr389)磷酸化水平显著降低(p<0.01)。结论:1) 高住低训抑制了 骨骼肌蛋白合成及p70S6K(Thr389)磷酸化,这也提示机体可能通过调节mTOR/p70 S6K细胞信号转导通路来调节骨骼肌蛋白代谢;2) 耐力运动提高了骨骼肌p70S6K蛋 白的表达。
关键词:高住低训;骨骼肌总蛋白;p70S6K;p70S6K(Thr389)
中图分类号:G804.2文献标识码:A文章编号 :1007-3612(2010)03-0046-04
The Effects of Four Weeks Living HighTraining Low on p70S6 K of Skeletal Muscle in Rats
LI Xiaohong,ZHAO Hua,ZENG Fanxing
(Beijing Sport University, Beijing 100084, China)
Abstract: Objective: To explore the influence of hypoxic exercise on skeletal mu scle protein and p70S6K in rats. Methods: SD rats are divided into four groups:control group, hypoxic group, normal exercise group and living hightraining lo w (HiLo) group. Control group lives in normal environment quietly. Hypoxic groupwas traded with 13.6% oxygen concentration all the day, and live quietly. Theother two groups take four weeks exercises, 1hour/day, and 6 days/week. And HiLogroup was traded with 13.6% oxygen concentration during night. Results: After28 days, compared with control group, HiLo group’s total protein concentrationin rat skeletal muscle decreased significantly (p<0.01), but p70S6K p roteinexpression increased significantly (p<0.05), and p70S6K (Thr389) phosphory lation also decreased significantly (p<0.01); Normal exercise group’s p70S 6K protein expression increased significantly (p<0.05); Hypoxic group’s p7 0S6K (Thr389) phosphorylation decreased significantly (p<0.01). Concl usions:1) In our study, HiLo suppresses skeletal muscle protein synthesis and p 70S6K(Thr389) phosphorylation, which suggests that it may adjust the skele tal protein synthesis by adjusting p70S6K/mTOR signal transduction pathway s. 2) Endurance sports promote skeletal p70S6K protein expression.
Key words: livng hightraining low (HiLo); protein of skeletal muscle;p70S6K; p70S6K (Thr389)
研究表明低氧及低氧运动抑制骨骼肌蛋白合成,这是低氧训练面临的一个重要问题。 细胞内信号转导通路是影响骨骼肌蛋白合成的关键。大量的细胞培养实验表明低氧抑制蛋白 合成,而且与细胞内信号转导通路有关。高度保守的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian t arget of rapamycin,mTOR)信号转导通路在骨骼肌蛋白代谢中发挥了关键性的作用。
mTOR可以感受细胞能量状况(AMP/ATP)、环境中营养状况以及PI3K等信号。激活后的mT OR再将信号传递给下游三种主要靶蛋白p70S6K、4EBP1、eIF4G,这些靶蛋白是蛋白质 合成的重要调控因子[1],其中p70S6K是备受关注的一个信号分子。p70 S6K是 核糖体40 s小亚基s6蛋白激酶,其主要功能是使细胞内40 s核糖体蛋白s6磷酸化,而s6磷酸 化被认为是提高翻译效 率的关键因素,它可以促进含有5’TOP(tract of pyrimidine)结构mRNAs翻译,这些mRNA的 主要翻译产物包括核糖体蛋白、延长因子和结合蛋白等,这些翻译元件的生物合成是蛋白质 合成的基础。一般认为,只有活化的p70S6K才能发挥作用。目前,已发现p70S6K 有12个磷酸化位点[2]。p70S6K的激活过程非常复杂, 需要多个丝氨酸/苏 氨酸位点的磷酸化作用,其中Thr389的磷酸化直接激活蛋白激酶[3]。
本研究以细胞转导信号通路为切入点,探讨分析低氧以及低氧运动对大鼠骨骼肌总蛋 白量以及p70S6K的影响,从而能更好地了解低氧运动对骨骼肌蛋白代谢的调节机制。
投稿日期:2009-11-05
基金项目:国家自然科学基金项目(批准号30671013)。北京体育大学2 009届本科毕业论文。通讯作者:曾凡星教授。
作者简介:李晓红,在读硕士研究生,研究方向运动生理学。 1 研究对象与方法
1.1 实验对象
9周龄的雄性SD大鼠40只,由北京维通利华公司提供。昼夜节律人工控制光 照(光照时间为07:00-19:00),环境温度(23±2)℃,大鼠自由取食及饮水。
1.2 实验方法
适应性训练:40只SD大鼠在常氧条件下静养半周后,再进行半周的水平跑台递增负荷适 应性训练,淘汰不适应跑台训练的大鼠,然后筛选36只实验大鼠随机分为4个实验组。动物 分组及训练方式见表1。
表1 动物分组及训练方式情况
分组编号数量生活方式训练方式 常氧安静组NS 8常氧环境下安静生活无低氧安静组HS 8低氧环境下安静生活无常氧训练组NE 10 每天在常氧环境下以恒定 训练强度 :35 m/min强度训练1 h,其余时间在运动时间:1 h/d常氧环境下安静生活6 d/周,持续4周高住低训组HLE10每天在常氧环境下以恒定强训练强 度:35 m/min度训练1 h,19:00-7:00在13.6%运动时间:1 h/d,O2低氧环境下安静生活6 d/周,持续4周 1.3 组织取材
四组大鼠均在第28 d取材,取材前禁饮食12 h,25%乌拉坦腹腔麻醉后,速取后肢趾长伸 肌,剔除肌腱及筋膜组织,用锡纸将其包裹后迅速投入液氮,而后置于-80℃冰箱保存待测 。
1.4 指标测试与方法
1.4.1 组织匀浆用于匀浆的肌肉样品,被切成重约100 mg大小,加50 μL的预冷的匀浆缓冲液于玻璃匀浆 器中冰上匀浆,当无肉眼可见的块状肌肉时,将匀浆液转移至1.5 mLEP 中,再用50 μL的 匀浆缓冲液冲洗匀浆器,也转移至EP管中。12 000 g,4 ℃离心10 min。取上清液,用于总 蛋白浓度测定及p70S6K测定。
1.4.2 骨骼肌总白浓度测定 骨骼肌总蛋白浓度采用Bradford 法测试,具体过程:1) 配制Bradford工作液:按照《精编分子生物学实验指南》[2]配制。2) 标准曲线制备:分别取1 mg/mL牛血清清蛋白(BSA标准蛋白)分别为0、10、20、40、6 0、80、100 μL,不足100 μL的再用生理盐水补足到100 μL,并将样品稀释数个梯度,以 测出最佳上样量。3) 加入5 mL Bradford工作液,用旋涡混匀器混匀,静置5 min。 4) 于595 nm处测定溶液吸光值A595 nm。制作标准曲线,并求出最佳上样量。5) 如上方法分批次测试样品吸光值,根据标准曲线求出样品浓度。
1.4.3 骨骼肌p70S6K及p70S6K(Thr389) 测定骨骼肌p70S6K蛋白表达和p70S6K(Thr389)磷酸化均采用Western Blot法测 定,所用试剂按照《精编分子生物学实验指南》[4]配制,具体过程如下:
1) 制胶:配制8%的分离胶灌入玻璃板中,用蒸馏水封胶,室温放置约30 min;再配制5% 的浓缩胶,胶凝固后取出梳子。
2) 取60 μg总蛋白,加入上样缓冲液、水、DTT,配成20 μL体系,混合均匀后置100℃沸 水中5 min,使蛋白变性,再于碎冰中冷却。
3) 上样:以3 000 rpm,室温离心。再将样品加入凝胶样品孔。
4) 电泳:5%的浓缩胶以80 V恒压,8%分离胶以120 V恒压条件下电泳。
5) 转膜:电泳结束后取出凝胶,放入转移缓冲液中浸泡10 min,再采用半干转将蛋白转 到硝酸纤维素膜(NC膜)上,以恒压20 V,持续90 min。
6) 封闭:将NC膜放入1×TBS液于摇床上轻摇5 min,再加入封闭液,室温下轻摇1.5 h 。之后将NC膜用TBST液洗3次,每次10 min,于摇床上轻摇漂洗。
7) 一抗孵育:将NC膜封入保鲜膜袋中,将用封闭液稀释过的一抗加入袋中,4℃孵育过 夜。不同抗体稀释比例分别为:actin 为1:1000,p70S6K抗体为1:1000,Phospho- p 70S6K(Thr389)为1:1200。之后将NC膜用TBST液洗3次,每次10 min,于摇床上轻摇 漂洗。
8) 二抗孵育:将NC膜封入保鲜膜袋中,将用封闭液稀释过的二抗(1:16 000)加入袋中 ,室温振荡孵育1 h。之后将NC膜用TBST液洗3次,每次10 min,于摇床上轻摇漂洗。
9) 化学发光:于暗室中配制ECL发光试剂反应液,将A、B等量混合后滴加到膜上,视情况 待其反应一段时间后,用保鲜膜封住,保持平整,保鲜膜表面外面没有残余液体。将蛋白面 朝上,放到胶片盒里,压片、感光、显影、定影。
10) 计算:曝光底片用Gel Doc XR 凝胶成像系统用透光拍照,用Quantity One图像分析 系统分析,进行背景消除后,用软件计算出目的条带的光密度值。将每个条带与相应样品的 β-actin条带光密度值进行比较,计算出目的条带的相对含量值。
1.5 统计方法计量资料用X±S表示,计量资料的比较采用单因素分析方法分析。显著性 水平 检验,以p<0.05表示有显著性差异,以p<0.01表示有高度显著性差异。全部统计学分 析均采用SPSS13.0统计软件进行分析。
2 结 果
2.1 骨骼肌总蛋白浓度
表2和图1反应了四周低氧运动后大鼠骨骼肌总蛋白浓度的变化情况。28 d后,与对照组 比较,高住低训组骨骼肌总蛋白浓度显著降低(P<0.01);常氧训练组骨骼肌总蛋白 浓 度增加0.7%,无显著性差异;低氧安静组骨骼肌总蛋白浓度减少3.4%,无显著性差异。与 常氧训练组比较,高住低训组骨骼肌总蛋白浓度显著降低(P<0.01)。
表2 四周低氧运动后骨骼肌总蛋白浓度的变化
组别 总蛋白浓度NS 62.66±3.78HS 60.53±3.52NE 63.12±6.63HiLo54.49±1.90**##*:与对照比较,P<0.05;**:与对照组比较,P<0.01;##:常氧训练组比较,P<0. 01。以下各表同。
2.2 骨骼肌p70S6K蛋白表达
表3和图2反应了四周低氧运动后大鼠骨骼肌p70S6K蛋白表达的变化情况。与对照组比 较,高住低训组p70S6K蛋白表达显著增加(P<0.05);常氧训练组p70S6K 蛋白表达显著增加(P<0.05);低氧安静组p70S6K蛋白表达无显著变化。与常 氧训练组比较,高住低训组p70S6K蛋白表达量减少9.8%,但无显著性差异。
表3 四周低氧运动后骨骼肌p70S6K蛋白的变化
组别p70S6K蛋白/actinNS3.32±0.12HS3.30±0.21NE4.68±0.27*HiLo4.22±0.15*图1 四周低氧运动后骨骼肌总蛋白浓度的变化 图2 四周低氧运动后骨骼肌p70S6K蛋白表达的变化2.3 骨骼肌p70S6K(Thr389)酸化
表4和图3反应了四周低氧运动后大鼠骨骼肌p70S6K(Thr389)磷酸化的变化情况。 与对照组比较,高住低训组p70S6K(Thr389)磷酸化显著降低(P<0.01);低氧 安 静组p70S6K(Thr389)磷酸化显著降低(P<0.01);常氧训练组p70S6K(Th r 389)磷酸化减少5.6%,无显著性差异。与常氧训练组比较,高住低训组p70S6K(Thr3 89)磷酸化减少11.9%,无显著性差异。
表4 四周低氧运动后骨骼肌p70S6K(Thr389)的变化
组别p7 0S6KThr389/actinNS1.42±0.06HS0.95±0.13**NE1.34±0.14HiLo 1.18±0.13** 图3 四周低氧运动后骨骼肌p70S6K(Thr389)的变化
3 分析与讨论
3.1 四周低氧运动后骨骼肌总蛋白的变化训练方式不同,对骨骼肌的影响也不同。抗阻力训练增加蛋白质的合成,引起肌细胞肥 大。耐力运动在促进骨骼肌肥大方面的作用不明显,但也有报道认为有氧耐力训练后骨骼肌 蛋白合成增加,这种差异可能与训练方法、训练时间以及训练强度有关。贺道远[7] 的实验 显示,28 d常氧训练后,骨骼肌总蛋白浓度显著增加。本实验中,与对照组比较,常氧耐力 运动组骨骼肌总蛋白浓度增加0.7%,但无显著性差异,这与以往一些研究结果较一致,本 实 验中的耐力运动对促进骨骼肌蛋白合成的作用不明显。本实验与贺道远的研究结果差异很大 程度上可能是由研究的肌肉不一致造成的,本实验中样本来自趾长伸肌,属于快肌,而贺道 远研究的是腓肠肌,属于慢肌。耐力运动对慢肌的训练效果更明显,这可能与耐力训练能够 提高慢肌的总蛋白浓度有关。
低氧暴露抑制骨骼肌蛋白质合成,其具体机制还不清楚。从贺道远等[5]人的 报道中我 们发现,低氧暴露抑制骨骼肌蛋白合成以及mTOR蛋白表达,提示低氧抑制骨骼肌蛋白合成可 能与抑制细胞内mTOR/p70S6K信号转导通路有关。蛋白质的生物合成特别是起始阶段 是一个非常耗能的过程,O2浓度对蛋白质合成非常重要。因此有人认为,低氧环境导致 肌细胞利用的氧减少,影响了细胞的呼吸作用,降低了体内ATP浓度,能量缺乏使骨骼肌蛋 白的合成受阻。本实验中,与对照组比较,低氧安静组骨骼肌总蛋白浓度减少3.4%,但 无 显著性差异,与原有研究结果稍有差异,这可能与低氧暴露的时间、频率以及低氧环境的氧 气浓度有关。
运动后的恢复期对蛋白合成代谢的影响至关重要,因为运动期蛋白分解加强合成抑制, 而运动后恢复期蛋白合成加强,而分解明显减弱。本实验中,与对照组和常氧耐力运动组比 较,高住低训组骨骼肌总蛋白浓度均显著下降,运动后恢复期的低氧环境是抑制高住低训组 骨骼肌总蛋白浓度显著性下降的重要因素。且与对照组比较,常氧耐力运动组和低氧安静组 骨骼肌总蛋白浓度无显著变化,这提示单纯的耐力运动或低氧环境对骨骼肌蛋白代谢的影响 有限,高住低训组骨骼肌总蛋白浓度显著降低是由运动和低氧两个因素共同造成的。
3.2 四周低氧运动后骨骼肌p70S6K蛋白表达的变化
低氧运动对骨骼肌p70S6K蛋白表达的影响的研究还不多见。李常艳的研究[ 6]指 出,12周游泳训练后,不同负荷运动组大鼠骨骼肌p70S6K蛋白的表达无显著性差异。 在本实验中,与对照组比较,常氧训练组骨骼肌p70S6K蛋白表达显著增加,这种差异 可能是由于两者运动方式和训练持续时间不同导致的。贺道远[7]的实验显示,28d后,间 歇低氧暴露组大鼠骨骼肌p70S6K蛋白表达显著下降,常氧运动组显著增加,高住低训 组无显著变化。本实验中,与对照组比较,低氧安静组骨骼肌p70S6K蛋白表达无显著 变化,高住低训组和常氧耐力运动组均显著增加,这也可能是由两者研究的肌肉不一致造成 的,但两个实验都得出了较一致的结论,耐力运动显著提高了骨骼肌p70S6K蛋白表达 。但耐力运动在提高骨骼肌总蛋白浓度方面的作用不明显,这可能是因为p70S6K是一 种骨骼肌蛋白酶,在骨骼肌总蛋白中所占比例非常小,骨骼肌总蛋白浓度较小的变化就能够 引起p70S6K蛋白的显著性变化。本实验中高住低训组骨骼肌总蛋白浓度和p70S6K 蛋白的变化趋势甚至是相反的,其具体原因还需要进一步实验说明。
训练条件的改变也会引起骨骼肌p70S6K蛋白相应的变化。Fujita 等[8]研究 发现低强 度的抗阻练习后p70S6K蛋白的表达没有变化;低强度的抗阻练习结合适度地减少工作 肌肉的血流量,可以增加p70S6K蛋白的表达。贺道远的实验中,28 d高住低训组和低 氧暴露组复氧7 d后,p70S6K蛋白的表达均显著增加。这两个研究都能够反映出氧气 浓度对骨骼肌 p70S6K蛋白的表达有着重要的影响。
3.3 四周低氧运动后骨骼肌p70S6K(Thr389)磷酸化的变化
很多研究都表明mTOR/p70S6K信号转导通路在骨骼肌蛋白代谢中起了关键性作用。抗 阻运动促进骨骼肌蛋白合成,并且Hernande等[9]实验证实,抗阻运动可增加大鼠 骨骼肌中 p70S6K的活性,这进一步说明了p70S6K在骨骼肌蛋白合成代谢中的重要作用。 贺道远等[7]人通过实验也发现低氧运动抑制骨骼肌蛋白合成,抑制PKB/mTOR信号 通路。本实验中,与对照组比较,高住低训组和低氧安静组骨骼肌p70S6K(Thr389) 磷酸化水 平均显著降低,同时这两组的骨骼肌总蛋白浓度也不同程度降低,骨骼肌p70S6K(Thr 389)磷酸化水平与总蛋白浓度的变化一致,这提示低氧及低氧运动通过调节p70S6K细 胞信号转导通路来调节骨骼肌蛋白的合成代谢。当然,低氧及低氧运动对骨骼肌蛋白代谢的 影响还受其他很多因素的影响,如生长因子和胰岛素水平、睾酮水平以及其他非mTOR/p70 S6K信号转导通路等。对人和大鼠的实验证明,只有大强度的力学收缩才能激活p70 S6K[10]。本实验中,与对照组比较,常氧耐力运动组骨骼肌p70S6K(Thr3 89)磷酸 化水平无显著变化,这提示本实验中的耐力运动对骨骼肌的刺激是不够的,骨骼肌p70S 6K(Thr389)磷酸化对低氧以及低氧运动等刺激较敏感。
一般认为,只有活化的p70S6K才能发挥作用。目前已发现p70S6K有12个磷酸化 位点[2]。p70S6K的激活过程非常复杂, 需多个丝氨酸/苏氨酸位点的磷酸化 作用,其中Thr389的磷酸化直接激活蛋白激酶[3]。Thr389直接由mTORC1复合物中的mTOR 磷酸化, 因此p70S6K的激活与mTOR磷酸化密切相关。朱一力[12]的研究认为运动诱导 mTOR磷酸 化增加,p70S6K磷酸化也随之增加,他的研究提示mTOR磷酸化促进p70S6K磷酸 化。但p70S6K磷酸化还受其他很多因素的调节,有研究显示耐力训练可以引起mTOR磷酸化增加,但是p70S6K并没有被激活。贺道远等人[5]的实验结果显示, 大鼠低氧 暴露28 d后,骨骼肌mTOR表达下降86.6%,复氧7 d后,mTOR表达显著升高,为410%,表明低 氧暴露对mTOR表达有明显的抑制作用。本研究中,28 d低氧暴露组和高住低训组p70S6K (Thr389)磷酸化水平均显著降低,低氧环境对p70S6K(Thr389)磷酸化有明显的抑制 作用,这也进一步证实p70S6K(Thr389)磷酸化与mTOR磷酸化密切相关,但低氧对mTOR /p70S6K信号通路的影响机制还不太清楚,需要进一步研究。
4 结 论
1) 在本研究结果表明,高住低训抑制了骨骼肌蛋白合成及p70S6K(Thr389)磷酸化, 这也提示机体可能通过调节mTOR/p70S6K细胞信号转导通路来调节骨骼肌蛋白的代谢 ;
2) 耐力运动提高了骨骼肌p70S6K蛋白的表达。
参考文献:
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[6] 李常艳.不同负荷运动对老龄小鼠骨骼肌mTOR、p70s6k和ERK1/2磷酸化表达的 影响[D].北京体育大学博士学位论文,2008.
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关键词:高住低训;骨骼肌总蛋白;p70S6K;p70S6K(Thr389)
中图分类号:G804.2文献标识码:A文章编号 :1007-3612(2010)03-0046-04
The Effects of Four Weeks Living HighTraining Low on p70S6 K of Skeletal Muscle in Rats
LI Xiaohong,ZHAO Hua,ZENG Fanxing
(Beijing Sport University, Beijing 100084, China)
Abstract: Objective: To explore the influence of hypoxic exercise on skeletal mu scle protein and p70S6K in rats. Methods: SD rats are divided into four groups:control group, hypoxic group, normal exercise group and living hightraining lo w (HiLo) group. Control group lives in normal environment quietly. Hypoxic groupwas traded with 13.6% oxygen concentration all the day, and live quietly. Theother two groups take four weeks exercises, 1hour/day, and 6 days/week. And HiLogroup was traded with 13.6% oxygen concentration during night. Results: After28 days, compared with control group, HiLo group’s total protein concentrationin rat skeletal muscle decreased significantly (p<0.01), but p70S6K p roteinexpression increased significantly (p<0.05), and p70S6K (Thr389) phosphory lation also decreased significantly (p<0.01); Normal exercise group’s p70S 6K protein expression increased significantly (p<0.05); Hypoxic group’s p7 0S6K (Thr389) phosphorylation decreased significantly (p<0.01). Concl usions:1) In our study, HiLo suppresses skeletal muscle protein synthesis and p 70S6K(Thr389) phosphorylation, which suggests that it may adjust the skele tal protein synthesis by adjusting p70S6K/mTOR signal transduction pathway s. 2) Endurance sports promote skeletal p70S6K protein expression.
Key words: livng hightraining low (HiLo); protein of skeletal muscle;p70S6K; p70S6K (Thr389)
研究表明低氧及低氧运动抑制骨骼肌蛋白合成,这是低氧训练面临的一个重要问题。 细胞内信号转导通路是影响骨骼肌蛋白合成的关键。大量的细胞培养实验表明低氧抑制蛋白 合成,而且与细胞内信号转导通路有关。高度保守的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian t arget of rapamycin,mTOR)信号转导通路在骨骼肌蛋白代谢中发挥了关键性的作用。
mTOR可以感受细胞能量状况(AMP/ATP)、环境中营养状况以及PI3K等信号。激活后的mT OR再将信号传递给下游三种主要靶蛋白p70S6K、4EBP1、eIF4G,这些靶蛋白是蛋白质 合成的重要调控因子[1],其中p70S6K是备受关注的一个信号分子。p70 S6K是 核糖体40 s小亚基s6蛋白激酶,其主要功能是使细胞内40 s核糖体蛋白s6磷酸化,而s6磷酸 化被认为是提高翻译效 率的关键因素,它可以促进含有5’TOP(tract of pyrimidine)结构mRNAs翻译,这些mRNA的 主要翻译产物包括核糖体蛋白、延长因子和结合蛋白等,这些翻译元件的生物合成是蛋白质 合成的基础。一般认为,只有活化的p70S6K才能发挥作用。目前,已发现p70S6K 有12个磷酸化位点[2]。p70S6K的激活过程非常复杂, 需要多个丝氨酸/苏 氨酸位点的磷酸化作用,其中Thr389的磷酸化直接激活蛋白激酶[3]。
本研究以细胞转导信号通路为切入点,探讨分析低氧以及低氧运动对大鼠骨骼肌总蛋 白量以及p70S6K的影响,从而能更好地了解低氧运动对骨骼肌蛋白代谢的调节机制。
投稿日期:2009-11-05
基金项目:国家自然科学基金项目(批准号30671013)。北京体育大学2 009届本科毕业论文。通讯作者:曾凡星教授。
作者简介:李晓红,在读硕士研究生,研究方向运动生理学。 1 研究对象与方法
1.1 实验对象
9周龄的雄性SD大鼠40只,由北京维通利华公司提供。昼夜节律人工控制光 照(光照时间为07:00-19:00),环境温度(23±2)℃,大鼠自由取食及饮水。
1.2 实验方法
适应性训练:40只SD大鼠在常氧条件下静养半周后,再进行半周的水平跑台递增负荷适 应性训练,淘汰不适应跑台训练的大鼠,然后筛选36只实验大鼠随机分为4个实验组。动物 分组及训练方式见表1。
表1 动物分组及训练方式情况
分组编号数量生活方式训练方式 常氧安静组NS 8常氧环境下安静生活无低氧安静组HS 8低氧环境下安静生活无常氧训练组NE 10 每天在常氧环境下以恒定 训练强度 :35 m/min强度训练1 h,其余时间在运动时间:1 h/d常氧环境下安静生活6 d/周,持续4周高住低训组HLE10每天在常氧环境下以恒定强训练强 度:35 m/min度训练1 h,19:00-7:00在13.6%运动时间:1 h/d,O2低氧环境下安静生活6 d/周,持续4周 1.3 组织取材
四组大鼠均在第28 d取材,取材前禁饮食12 h,25%乌拉坦腹腔麻醉后,速取后肢趾长伸 肌,剔除肌腱及筋膜组织,用锡纸将其包裹后迅速投入液氮,而后置于-80℃冰箱保存待测 。
1.4 指标测试与方法
1.4.1 组织匀浆用于匀浆的肌肉样品,被切成重约100 mg大小,加50 μL的预冷的匀浆缓冲液于玻璃匀浆 器中冰上匀浆,当无肉眼可见的块状肌肉时,将匀浆液转移至1.5 mLEP 中,再用50 μL的 匀浆缓冲液冲洗匀浆器,也转移至EP管中。12 000 g,4 ℃离心10 min。取上清液,用于总 蛋白浓度测定及p70S6K测定。
1.4.2 骨骼肌总白浓度测定 骨骼肌总蛋白浓度采用Bradford 法测试,具体过程:1) 配制Bradford工作液:按照《精编分子生物学实验指南》[2]配制。2) 标准曲线制备:分别取1 mg/mL牛血清清蛋白(BSA标准蛋白)分别为0、10、20、40、6 0、80、100 μL,不足100 μL的再用生理盐水补足到100 μL,并将样品稀释数个梯度,以 测出最佳上样量。3) 加入5 mL Bradford工作液,用旋涡混匀器混匀,静置5 min。 4) 于595 nm处测定溶液吸光值A595 nm。制作标准曲线,并求出最佳上样量。5) 如上方法分批次测试样品吸光值,根据标准曲线求出样品浓度。
1.4.3 骨骼肌p70S6K及p70S6K(Thr389) 测定骨骼肌p70S6K蛋白表达和p70S6K(Thr389)磷酸化均采用Western Blot法测 定,所用试剂按照《精编分子生物学实验指南》[4]配制,具体过程如下:
1) 制胶:配制8%的分离胶灌入玻璃板中,用蒸馏水封胶,室温放置约30 min;再配制5% 的浓缩胶,胶凝固后取出梳子。
2) 取60 μg总蛋白,加入上样缓冲液、水、DTT,配成20 μL体系,混合均匀后置100℃沸 水中5 min,使蛋白变性,再于碎冰中冷却。
3) 上样:以3 000 rpm,室温离心。再将样品加入凝胶样品孔。
4) 电泳:5%的浓缩胶以80 V恒压,8%分离胶以120 V恒压条件下电泳。
5) 转膜:电泳结束后取出凝胶,放入转移缓冲液中浸泡10 min,再采用半干转将蛋白转 到硝酸纤维素膜(NC膜)上,以恒压20 V,持续90 min。
6) 封闭:将NC膜放入1×TBS液于摇床上轻摇5 min,再加入封闭液,室温下轻摇1.5 h 。之后将NC膜用TBST液洗3次,每次10 min,于摇床上轻摇漂洗。
7) 一抗孵育:将NC膜封入保鲜膜袋中,将用封闭液稀释过的一抗加入袋中,4℃孵育过 夜。不同抗体稀释比例分别为:actin 为1:1000,p70S6K抗体为1:1000,Phospho- p 70S6K(Thr389)为1:1200。之后将NC膜用TBST液洗3次,每次10 min,于摇床上轻摇 漂洗。
8) 二抗孵育:将NC膜封入保鲜膜袋中,将用封闭液稀释过的二抗(1:16 000)加入袋中 ,室温振荡孵育1 h。之后将NC膜用TBST液洗3次,每次10 min,于摇床上轻摇漂洗。
9) 化学发光:于暗室中配制ECL发光试剂反应液,将A、B等量混合后滴加到膜上,视情况 待其反应一段时间后,用保鲜膜封住,保持平整,保鲜膜表面外面没有残余液体。将蛋白面 朝上,放到胶片盒里,压片、感光、显影、定影。
10) 计算:曝光底片用Gel Doc XR 凝胶成像系统用透光拍照,用Quantity One图像分析 系统分析,进行背景消除后,用软件计算出目的条带的光密度值。将每个条带与相应样品的 β-actin条带光密度值进行比较,计算出目的条带的相对含量值。
1.5 统计方法计量资料用X±S表示,计量资料的比较采用单因素分析方法分析。显著性 水平 检验,以p<0.05表示有显著性差异,以p<0.01表示有高度显著性差异。全部统计学分 析均采用SPSS13.0统计软件进行分析。
2 结 果
2.1 骨骼肌总蛋白浓度
表2和图1反应了四周低氧运动后大鼠骨骼肌总蛋白浓度的变化情况。28 d后,与对照组 比较,高住低训组骨骼肌总蛋白浓度显著降低(P<0.01);常氧训练组骨骼肌总蛋白 浓 度增加0.7%,无显著性差异;低氧安静组骨骼肌总蛋白浓度减少3.4%,无显著性差异。与 常氧训练组比较,高住低训组骨骼肌总蛋白浓度显著降低(P<0.01)。
表2 四周低氧运动后骨骼肌总蛋白浓度的变化
组别 总蛋白浓度NS 62.66±3.78HS 60.53±3.52NE 63.12±6.63HiLo54.49±1.90**##*:与对照比较,P<0.05;**:与对照组比较,P<0.01;##:常氧训练组比较,P<0. 01。以下各表同。
2.2 骨骼肌p70S6K蛋白表达
表3和图2反应了四周低氧运动后大鼠骨骼肌p70S6K蛋白表达的变化情况。与对照组比 较,高住低训组p70S6K蛋白表达显著增加(P<0.05);常氧训练组p70S6K 蛋白表达显著增加(P<0.05);低氧安静组p70S6K蛋白表达无显著变化。与常 氧训练组比较,高住低训组p70S6K蛋白表达量减少9.8%,但无显著性差异。
表3 四周低氧运动后骨骼肌p70S6K蛋白的变化
组别p70S6K蛋白/actinNS3.32±0.12HS3.30±0.21NE4.68±0.27*HiLo4.22±0.15*图1 四周低氧运动后骨骼肌总蛋白浓度的变化 图2 四周低氧运动后骨骼肌p70S6K蛋白表达的变化2.3 骨骼肌p70S6K(Thr389)酸化
表4和图3反应了四周低氧运动后大鼠骨骼肌p70S6K(Thr389)磷酸化的变化情况。 与对照组比较,高住低训组p70S6K(Thr389)磷酸化显著降低(P<0.01);低氧 安 静组p70S6K(Thr389)磷酸化显著降低(P<0.01);常氧训练组p70S6K(Th r 389)磷酸化减少5.6%,无显著性差异。与常氧训练组比较,高住低训组p70S6K(Thr3 89)磷酸化减少11.9%,无显著性差异。
表4 四周低氧运动后骨骼肌p70S6K(Thr389)的变化
组别p7 0S6KThr389/actinNS1.42±0.06HS0.95±0.13**NE1.34±0.14HiLo 1.18±0.13** 图3 四周低氧运动后骨骼肌p70S6K(Thr389)的变化
3 分析与讨论
3.1 四周低氧运动后骨骼肌总蛋白的变化训练方式不同,对骨骼肌的影响也不同。抗阻力训练增加蛋白质的合成,引起肌细胞肥 大。耐力运动在促进骨骼肌肥大方面的作用不明显,但也有报道认为有氧耐力训练后骨骼肌 蛋白合成增加,这种差异可能与训练方法、训练时间以及训练强度有关。贺道远[7] 的实验 显示,28 d常氧训练后,骨骼肌总蛋白浓度显著增加。本实验中,与对照组比较,常氧耐力 运动组骨骼肌总蛋白浓度增加0.7%,但无显著性差异,这与以往一些研究结果较一致,本 实 验中的耐力运动对促进骨骼肌蛋白合成的作用不明显。本实验与贺道远的研究结果差异很大 程度上可能是由研究的肌肉不一致造成的,本实验中样本来自趾长伸肌,属于快肌,而贺道 远研究的是腓肠肌,属于慢肌。耐力运动对慢肌的训练效果更明显,这可能与耐力训练能够 提高慢肌的总蛋白浓度有关。
低氧暴露抑制骨骼肌蛋白质合成,其具体机制还不清楚。从贺道远等[5]人的 报道中我 们发现,低氧暴露抑制骨骼肌蛋白合成以及mTOR蛋白表达,提示低氧抑制骨骼肌蛋白合成可 能与抑制细胞内mTOR/p70S6K信号转导通路有关。蛋白质的生物合成特别是起始阶段 是一个非常耗能的过程,O2浓度对蛋白质合成非常重要。因此有人认为,低氧环境导致 肌细胞利用的氧减少,影响了细胞的呼吸作用,降低了体内ATP浓度,能量缺乏使骨骼肌蛋 白的合成受阻。本实验中,与对照组比较,低氧安静组骨骼肌总蛋白浓度减少3.4%,但 无 显著性差异,与原有研究结果稍有差异,这可能与低氧暴露的时间、频率以及低氧环境的氧 气浓度有关。
运动后的恢复期对蛋白合成代谢的影响至关重要,因为运动期蛋白分解加强合成抑制, 而运动后恢复期蛋白合成加强,而分解明显减弱。本实验中,与对照组和常氧耐力运动组比 较,高住低训组骨骼肌总蛋白浓度均显著下降,运动后恢复期的低氧环境是抑制高住低训组 骨骼肌总蛋白浓度显著性下降的重要因素。且与对照组比较,常氧耐力运动组和低氧安静组 骨骼肌总蛋白浓度无显著变化,这提示单纯的耐力运动或低氧环境对骨骼肌蛋白代谢的影响 有限,高住低训组骨骼肌总蛋白浓度显著降低是由运动和低氧两个因素共同造成的。
3.2 四周低氧运动后骨骼肌p70S6K蛋白表达的变化
低氧运动对骨骼肌p70S6K蛋白表达的影响的研究还不多见。李常艳的研究[ 6]指 出,12周游泳训练后,不同负荷运动组大鼠骨骼肌p70S6K蛋白的表达无显著性差异。 在本实验中,与对照组比较,常氧训练组骨骼肌p70S6K蛋白表达显著增加,这种差异 可能是由于两者运动方式和训练持续时间不同导致的。贺道远[7]的实验显示,28d后,间 歇低氧暴露组大鼠骨骼肌p70S6K蛋白表达显著下降,常氧运动组显著增加,高住低训 组无显著变化。本实验中,与对照组比较,低氧安静组骨骼肌p70S6K蛋白表达无显著 变化,高住低训组和常氧耐力运动组均显著增加,这也可能是由两者研究的肌肉不一致造成 的,但两个实验都得出了较一致的结论,耐力运动显著提高了骨骼肌p70S6K蛋白表达 。但耐力运动在提高骨骼肌总蛋白浓度方面的作用不明显,这可能是因为p70S6K是一 种骨骼肌蛋白酶,在骨骼肌总蛋白中所占比例非常小,骨骼肌总蛋白浓度较小的变化就能够 引起p70S6K蛋白的显著性变化。本实验中高住低训组骨骼肌总蛋白浓度和p70S6K 蛋白的变化趋势甚至是相反的,其具体原因还需要进一步实验说明。
训练条件的改变也会引起骨骼肌p70S6K蛋白相应的变化。Fujita 等[8]研究 发现低强 度的抗阻练习后p70S6K蛋白的表达没有变化;低强度的抗阻练习结合适度地减少工作 肌肉的血流量,可以增加p70S6K蛋白的表达。贺道远的实验中,28 d高住低训组和低 氧暴露组复氧7 d后,p70S6K蛋白的表达均显著增加。这两个研究都能够反映出氧气 浓度对骨骼肌 p70S6K蛋白的表达有着重要的影响。
3.3 四周低氧运动后骨骼肌p70S6K(Thr389)磷酸化的变化
很多研究都表明mTOR/p70S6K信号转导通路在骨骼肌蛋白代谢中起了关键性作用。抗 阻运动促进骨骼肌蛋白合成,并且Hernande等[9]实验证实,抗阻运动可增加大鼠 骨骼肌中 p70S6K的活性,这进一步说明了p70S6K在骨骼肌蛋白合成代谢中的重要作用。 贺道远等[7]人通过实验也发现低氧运动抑制骨骼肌蛋白合成,抑制PKB/mTOR信号 通路。本实验中,与对照组比较,高住低训组和低氧安静组骨骼肌p70S6K(Thr389) 磷酸化水 平均显著降低,同时这两组的骨骼肌总蛋白浓度也不同程度降低,骨骼肌p70S6K(Thr 389)磷酸化水平与总蛋白浓度的变化一致,这提示低氧及低氧运动通过调节p70S6K细 胞信号转导通路来调节骨骼肌蛋白的合成代谢。当然,低氧及低氧运动对骨骼肌蛋白代谢的 影响还受其他很多因素的影响,如生长因子和胰岛素水平、睾酮水平以及其他非mTOR/p70 S6K信号转导通路等。对人和大鼠的实验证明,只有大强度的力学收缩才能激活p70 S6K[10]。本实验中,与对照组比较,常氧耐力运动组骨骼肌p70S6K(Thr3 89)磷酸 化水平无显著变化,这提示本实验中的耐力运动对骨骼肌的刺激是不够的,骨骼肌p70S 6K(Thr389)磷酸化对低氧以及低氧运动等刺激较敏感。
一般认为,只有活化的p70S6K才能发挥作用。目前已发现p70S6K有12个磷酸化 位点[2]。p70S6K的激活过程非常复杂, 需多个丝氨酸/苏氨酸位点的磷酸化 作用,其中Thr389的磷酸化直接激活蛋白激酶[3]。Thr389直接由mTORC1复合物中的mTOR 磷酸化, 因此p70S6K的激活与mTOR磷酸化密切相关。朱一力[12]的研究认为运动诱导 mTOR磷酸 化增加,p70S6K磷酸化也随之增加,他的研究提示mTOR磷酸化促进p70S6K磷酸 化。但p70S6K磷酸化还受其他很多因素的调节,有研究显示耐力训练可以引起mTOR磷酸化增加,但是p70S6K并没有被激活。贺道远等人[5]的实验结果显示, 大鼠低氧 暴露28 d后,骨骼肌mTOR表达下降86.6%,复氧7 d后,mTOR表达显著升高,为410%,表明低 氧暴露对mTOR表达有明显的抑制作用。本研究中,28 d低氧暴露组和高住低训组p70S6K (Thr389)磷酸化水平均显著降低,低氧环境对p70S6K(Thr389)磷酸化有明显的抑制 作用,这也进一步证实p70S6K(Thr389)磷酸化与mTOR磷酸化密切相关,但低氧对mTOR /p70S6K信号通路的影响机制还不太清楚,需要进一步研究。
4 结 论
1) 在本研究结果表明,高住低训抑制了骨骼肌蛋白合成及p70S6K(Thr389)磷酸化, 这也提示机体可能通过调节mTOR/p70S6K细胞信号转导通路来调节骨骼肌蛋白的代谢 ;
2) 耐力运动提高了骨骼肌p70S6K蛋白的表达。
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