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【摘 要】蛋白免疫印迹（Western Blot）是分子生物学和蛋白质组学中最常用的技术之一，最初建立于20世纪70年代末，至今仍被积极使用。传统蛋白免疫印迹方法存在着分辨率低、假条带、灵敏度低和蛋白质完整性差等缺点。多年来，蛋白免疫印迹的技术一直在不断更新，致力于更快地获得准确的结果。蛋白免疫印迹也能对多种疾病的进行检测，改进蛋白免疫印迹灵敏度和重复性，才能更大程度上实现其在临床上的应用。
【关键词】Western Blot;免疫印迹;蛋白质;抗体
Western blot是一种常用的蛋白质检测方法，可以提供目标蛋白的半定量或定量数据，也可用于检测蛋白的表达。免疫印迹法由Southern Blot进化而来，后者用于检测凝胶电泳分离的DNA片段中的特定DNA序列[1]。20世纪70年代末，Towbin等人（1979）利用聚丙烯酰胺-尿素凝胶电泳分离蛋白质，并将其转移到硝化纤维素膜上。伯内特（1981）后來使用了更广泛使用的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE），最终导致这种方法被称为Western Blot[2]。
通过使用蛋白免疫印迹，研究人员能够从提取的复杂蛋白质混合物中识别出特定的来自细胞的蛋白质。这项技术使用三个要素来完成这项任务：（1）按大小分离，（2）转移到固体载体上，（3）用适当的一抗和二抗标记靶蛋白。这些结果被转移到一种膜上，为每种蛋白质产生一条带。然后，该膜与特定目的蛋白质的标签抗体一起孵育。未结合抗体被洗掉，只剩下与抗体结合的目的蛋白质。然后通过显影胶片检测结合抗体由于抗体只与目的蛋白质结合，所以只有一条带是可见的。条带的厚度与蛋白质的存在量相对应;因此，需要做一个标准对照可以指示蛋白质的存在量[3]。
蛋白免疫印迹技术的发展
20世纪70年代末建立的蛋白免疫印迹技术至今仍在积极应用。然而，这种传统的蛋白免疫印迹方法存在着分辨率低、假条带、灵敏度低和蛋白质完整性差等缺点，近年来的进展极大地改进了标准蛋白免疫印迹方法的许多方面，以产生更高质量和定量的数据。双Tris凝胶系统是传统Laemmli系统的替代品，不仅可以使蛋白质更好分离，保持蛋白质完整性，分辨率更高，并将电泳时间缩短至35分钟。此外，iBlot干吸系统通过减小电极之间的距离来提高传输速度，在7分钟内显著提高了蛋白质转移到膜上的效率和速度。该传输系统较传统方法提高了效率，减少了转移时间[4]。虽然化学发光技术是蛋白质蛋白质检测中最常见和最传统的技术，但双色红外荧光检测能大大提高灵敏度、质量，以及数据的准确性。这种检测方法利用红外激光在700nm和800nm两种最佳波长下激发，生成信号最大的清晰数据图像比率和最高敏感度。因此，两个靶蛋白可以同时在同一膜上使用700nm和800nm的荧光检测通道可视化[5]。
蛋白免疫印迹的临床应用
蛋白免疫印迹技术可以从鉴定复杂混合物中的特定蛋白质到直接检测单个细胞中的蛋白质，通过单细胞Western印迹，可以在复杂的细胞群中同时分析大约2000个细胞中的细胞-细胞变异。随着完整细胞成像的整合，该技术允许在化疗药物柔红霉素治疗的人胶质母细胞瘤细胞中，在异质性肿瘤细胞群体中识别单个耐药肿瘤细胞及其亚型的蛋白质表达变化[6]。随着双向凝胶分离技术的应用以及通过肽质量指纹识别蛋白质，使得临床相关幽门螺杆菌在相关胃病（慢性胃炎、十二指肠溃疡）中的分析成为可能[7]。
蛋白免疫印迹通常用于临床诊断各种寄生虫和真菌疾病，应用于先天性弓形虫病的早期和敏感诊断[8]，并被用于严重感染性疾病副球虫病（PCM）[9]的快速和敏感血清学诊断。在一项研究中，该试验成功地用于农民肺病（FLD）的可靠血清学诊断，FLD是一种由吸入抗原颗粒引起的肺部疾病。因此，该技术可用于FLD的临床快速常规诊断[10]。
因此，随着进一步提高蛋白免疫印迹的灵敏度和重复性，蛋白免疫印迹技术的临床应用将继续向前发展，为人类的疾病诊断提供重要的技术支持。
参考文献：
[1]He M，Herr AE. Polyacrylamide gel photopatterning enables automated protein immunoblot in a two-dimensional microdevice. J Am Chem Soc，2010;132（8），2512–2513.
[2]Murphy RM，Lamb GD. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques：down-sizing Western blot up-sizes outcomes. J Physiol，2013;591（23），5823–5831.
[3]MahmoodT，YangP.Westernblot：Technique，theory，andtroubleshooting.NorthAmJM edSci2012;4：429-34.
[4]iBlot Dry Blot System. Life Technologies Corporation. 25-0911，84（2012）.
[5]Western Blot Analysis. LI-COR Biosciences. 988-12622，12（2012）.
[6]Kang CC，Lin JM，Xu Z，Kumar S，Herr AE. Single-cell Western blot after whole-cell imaging to assess cancer chemotherapeutic response. Anal Chem，2014;86（20），10429–10436.
[7]Hamm M，Ha S，Rustandi RR. Automated capillary Western dot blot method for the identity of a 15-valent pneumococcal conjugate vaccine. Anal Biochem，2015;478，33–39.
[8]Perenha-Viana MC，Gonzales IA，Brockelt SR，Machado LN，Svidzinski TI. Serological diagnosis of paracoccidioidomycosis through a Western blot technique. Clin Vaccine Immunol，2012;19（4），616–619.
[9]Head MW，Yull HM，Ritchie DL et al. Variably protease-sensitive prionopathy in the UK：a retrospective review 1991–2008. Brain，2013;136（Pt 4），1102–1115.
【关键词】Western Blot;免疫印迹;蛋白质;抗体
Western blot是一种常用的蛋白质检测方法，可以提供目标蛋白的半定量或定量数据，也可用于检测蛋白的表达。免疫印迹法由Southern Blot进化而来，后者用于检测凝胶电泳分离的DNA片段中的特定DNA序列[1]。20世纪70年代末，Towbin等人（1979）利用聚丙烯酰胺-尿素凝胶电泳分离蛋白质，并将其转移到硝化纤维素膜上。伯内特（1981）后來使用了更广泛使用的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE），最终导致这种方法被称为Western Blot[2]。
通过使用蛋白免疫印迹，研究人员能够从提取的复杂蛋白质混合物中识别出特定的来自细胞的蛋白质。这项技术使用三个要素来完成这项任务：（1）按大小分离，（2）转移到固体载体上，（3）用适当的一抗和二抗标记靶蛋白。这些结果被转移到一种膜上，为每种蛋白质产生一条带。然后，该膜与特定目的蛋白质的标签抗体一起孵育。未结合抗体被洗掉，只剩下与抗体结合的目的蛋白质。然后通过显影胶片检测结合抗体由于抗体只与目的蛋白质结合，所以只有一条带是可见的。条带的厚度与蛋白质的存在量相对应;因此，需要做一个标准对照可以指示蛋白质的存在量[3]。
蛋白免疫印迹技术的发展
20世纪70年代末建立的蛋白免疫印迹技术至今仍在积极应用。然而，这种传统的蛋白免疫印迹方法存在着分辨率低、假条带、灵敏度低和蛋白质完整性差等缺点，近年来的进展极大地改进了标准蛋白免疫印迹方法的许多方面，以产生更高质量和定量的数据。双Tris凝胶系统是传统Laemmli系统的替代品，不仅可以使蛋白质更好分离，保持蛋白质完整性，分辨率更高，并将电泳时间缩短至35分钟。此外，iBlot干吸系统通过减小电极之间的距离来提高传输速度，在7分钟内显著提高了蛋白质转移到膜上的效率和速度。该传输系统较传统方法提高了效率，减少了转移时间[4]。虽然化学发光技术是蛋白质蛋白质检测中最常见和最传统的技术，但双色红外荧光检测能大大提高灵敏度、质量，以及数据的准确性。这种检测方法利用红外激光在700nm和800nm两种最佳波长下激发，生成信号最大的清晰数据图像比率和最高敏感度。因此，两个靶蛋白可以同时在同一膜上使用700nm和800nm的荧光检测通道可视化[5]。
蛋白免疫印迹的临床应用
蛋白免疫印迹技术可以从鉴定复杂混合物中的特定蛋白质到直接检测单个细胞中的蛋白质，通过单细胞Western印迹，可以在复杂的细胞群中同时分析大约2000个细胞中的细胞-细胞变异。随着完整细胞成像的整合，该技术允许在化疗药物柔红霉素治疗的人胶质母细胞瘤细胞中，在异质性肿瘤细胞群体中识别单个耐药肿瘤细胞及其亚型的蛋白质表达变化[6]。随着双向凝胶分离技术的应用以及通过肽质量指纹识别蛋白质，使得临床相关幽门螺杆菌在相关胃病（慢性胃炎、十二指肠溃疡）中的分析成为可能[7]。
蛋白免疫印迹通常用于临床诊断各种寄生虫和真菌疾病，应用于先天性弓形虫病的早期和敏感诊断[8]，并被用于严重感染性疾病副球虫病（PCM）[9]的快速和敏感血清学诊断。在一项研究中，该试验成功地用于农民肺病（FLD）的可靠血清学诊断，FLD是一种由吸入抗原颗粒引起的肺部疾病。因此，该技术可用于FLD的临床快速常规诊断[10]。
因此，随着进一步提高蛋白免疫印迹的灵敏度和重复性，蛋白免疫印迹技术的临床应用将继续向前发展，为人类的疾病诊断提供重要的技术支持。
参考文献：
[1]He M，Herr AE. Polyacrylamide gel photopatterning enables automated protein immunoblot in a two-dimensional microdevice. J Am Chem Soc，2010;132（8），2512–2513.
[2]Murphy RM，Lamb GD. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques：down-sizing Western blot up-sizes outcomes. J Physiol，2013;591（23），5823–5831.
[3]MahmoodT，YangP.Westernblot：Technique，theory，andtroubleshooting.NorthAmJM edSci2012;4：429-34.
[4]iBlot Dry Blot System. Life Technologies Corporation. 25-0911，84（2012）.
[5]Western Blot Analysis. LI-COR Biosciences. 988-12622，12（2012）.
[6]Kang CC，Lin JM，Xu Z，Kumar S，Herr AE. Single-cell Western blot after whole-cell imaging to assess cancer chemotherapeutic response. Anal Chem，2014;86（20），10429–10436.
[7]Hamm M，Ha S，Rustandi RR. Automated capillary Western dot blot method for the identity of a 15-valent pneumococcal conjugate vaccine. Anal Biochem，2015;478，33–39.
[8]Perenha-Viana MC，Gonzales IA，Brockelt SR，Machado LN，Svidzinski TI. Serological diagnosis of paracoccidioidomycosis through a Western blot technique. Clin Vaccine Immunol，2012;19（4），616–619.
[9]Head MW，Yull HM，Ritchie DL et al. Variably protease-sensitive prionopathy in the UK：a retrospective review 1991–2008. Brain，2013;136（Pt 4），1102–1115.