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关键词：菠菜潜隐病毒;RT-PCR;菠菜;检测
菠菜（Spinacia oleracea L.）是中国普遍栽培的蔬菜之一。菠菜潜隐病毒（Spinach latent virus，SpLV）是菠菜上重要的种传病毒病害，曾用名为GE36，属雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）等轴不稳环斑病毒属（Ilarvirus）。SpLV基因组结构为单链正义五分体RNA，必需有3个大的组分（RNA1、RNA2、RNA3）及1～2个小的组分（RNA4、RNA5）或外壳蛋白一起才能完成侵染过程，主要侵染菠菜、番茄、藜麦、甜菜、鸡冠花、黄瓜、克利夫兰烟、黏毛烟、黄花烟、菜豆等，SpLV存活期长，至少可以在菠菜、藜麦种子中存活5年，远距离传播主要依靠种子[1-2]。SpLV目前主要分布在丹麦、芬兰、瑞典、挪威、南斯拉夫、新西兰、克罗地亚、美国、日本等国家或地区[3-6]，我国没有分布，也没有截获的任何报道。
本研究以进境的菠菜种子为材料，应用一步法逆转录PCR（RT-PCR）技术对SpLV进行检测鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
1.1.1 材料 受检材料为2019年3月广州海关检验检疫技术中心植检室接收的进境的菠菜种子。
1.1.2 试剂 核酸提取试剂TRIzol为Invitrogen公司产品;RT-PCR一步法试剂盒（PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit）、DNA Marker 2000购自大连TaKaRa公司。
1.1.3 引物 SpLV RNA1组分引物SpLV-RNA1-F/R序列：5′-TGTGGATTGGTGGTTGGA-3′，5′-CTTGCTTGAGGAGAGATGTTG-3′; RNA2组分引物SpLV-RNA2-F/R序列：5′-GAACCACCGAAACCGAAA-3′，5′-CCACCTCAACACCAGTCATAG-3′;RNA3组分引物SpLV-RNA3-F/R序列：5′-GCCTTCATCTTTGCCTTTG-3′，5′-CATTTCATCTGCGGTGGT-3′;预期扩增产物大小分别为722、436、213 bp[4]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 样品RNA的提取 随机取样并称取50 g菠菜种子，研磨成粉末状，称取0.1 g移入灭菌的 2 mL 离心管中，加入1 mL的TRIzol试剂，剧烈振荡摇匀，室温静置3 min;4 ℃、12 000 g离心10 min，取上清;加入200 μL三氯甲烷，上下颠倒混匀，室温静置3 min;4 ℃、12 000 g离心10 min，取上层水相;加等体积的异丙醇，颠倒混匀;4 ℃、12 000 g离心10 min，弃上清;加1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，4 ℃、7 500 g离心 5 min，弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后，溶于 50 μL 无RNA酶的ddH2O，-20 ℃保存备用。
1.2.2 RT-PCR扩增 利用一步法RT-PCR试剂盒，针对SpLV的3个不同组分进行RT-PCR一步法检测，扩增体系如下：PrimeScript One Step Buffer 25 μL，上下游引物各（20 μmol/L）1 μL，Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 μL，最后加RNase Free H2O至总体积为50 μL。反应参数如下：50 ℃ 30 min;94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环;72 ℃10 min。
1.2.3 PCR产物的检测 RT-PCR反应结束后，取5 μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测并记录结果。PCR产物由广州天一辉远基因科技有限公司纯化并测序。
2 结果与分析
2.1 RT-PCR扩增结果与分析
利用引物对SpLV-RNA1-F/R、SpLV-RNA2-F/R、SpLV-RNA3-F/R对菠菜种子中SpLV的3个组分进行一步法 RT-PCR检测鉴定。结果显示，从待检测样品中分别扩增出3条特异性条带，大小分别为722、436、213 bp，与预期片段大小相符（图1），初步判断待测样品可能感染了SpLV， 在底物和引物浓度完全一致的情况下，获得的RNA2组分扩增产物的浓度明显比RNA1、RNA3高。
2.2 序列分析
产物核苷酸序列测序拼接后可知，扩增的目的片段大小分别为722、436、213 bp，在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，简称NCBI）网站进行核酸序列Blast。结果表明，其中722 bp核苷酸片段与分离物SRP059420 RNA1组分（GenBank登录号：KY695012.1）核苷酸序列的同源性为99.72%，与美国分离物（GenBank登录号：U93192.1）核苷酸序列的同源性為99.58%，与番茄分离物（GenBank登录号：DQ457000.1）核苷酸序列的同源性为9787%;436 bp核苷酸片段与分离物SRP059420 RNA2组分（GenBank登录号：KY695013.1）核苷酸序列的同源性为100.00%，与美国分离物（GenBank登录号：U93193.1）核苷酸序列的同源性为9977%;213 bp核苷酸片段与分离物SRP059420（KY695014.1）和菠菜分离物（GenBank登录号：U93194.1）RNA3组分核苷酸序列同源性均为10000%。进一步验证得出，3个不同大小的 RT-PCR产物均为SpLV的特异性产物。
3 结论与讨论
菠菜潜隐病毒为五分体病毒，本研究为确定 RT-PCR扩增到的产物为目标病毒，利用特异性引物对SpLV侵染所需要的3个组分（RNA1、RNA2、RNA3）分别进行扩增，在扩增条件完全一致的情况下，引物对SpLV-RNA2-F/R扩增的RNA2组分产物量最大，条带清晰，更适合日常SpLV的检测鉴定。 菠菜种子被植物病毒感染后，种子的品质下降，发芽率降低，芽苗生长势减弱，更易被其他病害侵染。SpLV随种子传毒的效率非常高，在藜麦和菠菜上种传率超过50%，在烟叶上超过90%[1]。韩国曾多次从输韩菠菜种子上截获SpLV，并在2007年把该病毒列入输韩植物和植物产品检疫性有害生物名录。此次在菠菜种子上截获菠菜潜隐病毒，保护了我国蔬菜种植业的安全，为防止该病毒的传入，广州海关对该批菠菜种子作退运处理。但是由于有害生物分布的非均匀性以及种子带毒率的非一致性，入境第一口岸能否检出有害生物以便识别风险，这是一个概率事件，而不是百分之百能够检出有害生物的必然事件。因此国外预检及入境后的监管、监测及跟踪检疫更为重要。
参考文献：
[1]Bos L，Huttinga H，Maat D Z. Spinach latent virus，a new ilarvirus seed-borne in Spinacia oleracea[J]. Journal of Plant Pathology，1980，86（2）：79-98.
[2]Ge X，Scott S W，Zimmerman M T. The complete sequence of the genomic RNAs of spinach latent virus[J]. Arch Virology，1997，142（6）：1213-1226.
[3]Fotopoulos V，Dovas C I，Katis N I. Incidence of viruses infecting spinach in Greece，highlighting the importance of weeds as reservoir hosts[J]. Journal of Plant Pathology，2011，93（2）：389-395.
[4]Lebas B，Ochoa-Corona F M，Tang Z J，et al. First report of Spinach latent virus in tomato in New Zealand[J]. Plant Disease，2007，91（2）：228.
[5]Vargas A J，Mclane H，Bush E，et al. Spinach latent virus infecting tomato in Virginia，United States[J]. Plant Disease，2013，97（12）：1662-1663.
[6]Mustafa G，Erbay E，Semih E，et al. Occurrence of viruses infecting spinach in Western Anatolia of Turkey[J]. Journal of Food Agriculture and Environment，2014，12（1）：272-275.林 姍，陆兴利，赵金鹏，等. 四川省猕猴桃溃疡病发生的气象条件和综合防治[J].
菠菜（Spinacia oleracea L.）是中国普遍栽培的蔬菜之一。菠菜潜隐病毒（Spinach latent virus，SpLV）是菠菜上重要的种传病毒病害，曾用名为GE36，属雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）等轴不稳环斑病毒属（Ilarvirus）。SpLV基因组结构为单链正义五分体RNA，必需有3个大的组分（RNA1、RNA2、RNA3）及1～2个小的组分（RNA4、RNA5）或外壳蛋白一起才能完成侵染过程，主要侵染菠菜、番茄、藜麦、甜菜、鸡冠花、黄瓜、克利夫兰烟、黏毛烟、黄花烟、菜豆等，SpLV存活期长，至少可以在菠菜、藜麦种子中存活5年，远距离传播主要依靠种子[1-2]。SpLV目前主要分布在丹麦、芬兰、瑞典、挪威、南斯拉夫、新西兰、克罗地亚、美国、日本等国家或地区[3-6]，我国没有分布，也没有截获的任何报道。
本研究以进境的菠菜种子为材料，应用一步法逆转录PCR（RT-PCR）技术对SpLV进行检测鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
1.1.1 材料 受检材料为2019年3月广州海关检验检疫技术中心植检室接收的进境的菠菜种子。
1.1.2 试剂 核酸提取试剂TRIzol为Invitrogen公司产品;RT-PCR一步法试剂盒（PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit）、DNA Marker 2000购自大连TaKaRa公司。
1.1.3 引物 SpLV RNA1组分引物SpLV-RNA1-F/R序列：5′-TGTGGATTGGTGGTTGGA-3′，5′-CTTGCTTGAGGAGAGATGTTG-3′; RNA2组分引物SpLV-RNA2-F/R序列：5′-GAACCACCGAAACCGAAA-3′，5′-CCACCTCAACACCAGTCATAG-3′;RNA3组分引物SpLV-RNA3-F/R序列：5′-GCCTTCATCTTTGCCTTTG-3′，5′-CATTTCATCTGCGGTGGT-3′;预期扩增产物大小分别为722、436、213 bp[4]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 样品RNA的提取 随机取样并称取50 g菠菜种子，研磨成粉末状，称取0.1 g移入灭菌的 2 mL 离心管中，加入1 mL的TRIzol试剂，剧烈振荡摇匀，室温静置3 min;4 ℃、12 000 g离心10 min，取上清;加入200 μL三氯甲烷，上下颠倒混匀，室温静置3 min;4 ℃、12 000 g离心10 min，取上层水相;加等体积的异丙醇，颠倒混匀;4 ℃、12 000 g离心10 min，弃上清;加1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，4 ℃、7 500 g离心 5 min，弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后，溶于 50 μL 无RNA酶的ddH2O，-20 ℃保存备用。
1.2.2 RT-PCR扩增 利用一步法RT-PCR试剂盒，针对SpLV的3个不同组分进行RT-PCR一步法检测，扩增体系如下：PrimeScript One Step Buffer 25 μL，上下游引物各（20 μmol/L）1 μL，Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 μL，最后加RNase Free H2O至总体积为50 μL。反应参数如下：50 ℃ 30 min;94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环;72 ℃10 min。
1.2.3 PCR产物的检测 RT-PCR反应结束后，取5 μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测并记录结果。PCR产物由广州天一辉远基因科技有限公司纯化并测序。
2 结果与分析
2.1 RT-PCR扩增结果与分析
利用引物对SpLV-RNA1-F/R、SpLV-RNA2-F/R、SpLV-RNA3-F/R对菠菜种子中SpLV的3个组分进行一步法 RT-PCR检测鉴定。结果显示，从待检测样品中分别扩增出3条特异性条带，大小分别为722、436、213 bp，与预期片段大小相符（图1），初步判断待测样品可能感染了SpLV， 在底物和引物浓度完全一致的情况下，获得的RNA2组分扩增产物的浓度明显比RNA1、RNA3高。
2.2 序列分析
产物核苷酸序列测序拼接后可知，扩增的目的片段大小分别为722、436、213 bp，在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，简称NCBI）网站进行核酸序列Blast。结果表明，其中722 bp核苷酸片段与分离物SRP059420 RNA1组分（GenBank登录号：KY695012.1）核苷酸序列的同源性为99.72%，与美国分离物（GenBank登录号：U93192.1）核苷酸序列的同源性為99.58%，与番茄分离物（GenBank登录号：DQ457000.1）核苷酸序列的同源性为9787%;436 bp核苷酸片段与分离物SRP059420 RNA2组分（GenBank登录号：KY695013.1）核苷酸序列的同源性为100.00%，与美国分离物（GenBank登录号：U93193.1）核苷酸序列的同源性为9977%;213 bp核苷酸片段与分离物SRP059420（KY695014.1）和菠菜分离物（GenBank登录号：U93194.1）RNA3组分核苷酸序列同源性均为10000%。进一步验证得出，3个不同大小的 RT-PCR产物均为SpLV的特异性产物。
3 结论与讨论
菠菜潜隐病毒为五分体病毒，本研究为确定 RT-PCR扩增到的产物为目标病毒，利用特异性引物对SpLV侵染所需要的3个组分（RNA1、RNA2、RNA3）分别进行扩增，在扩增条件完全一致的情况下，引物对SpLV-RNA2-F/R扩增的RNA2组分产物量最大，条带清晰，更适合日常SpLV的检测鉴定。 菠菜种子被植物病毒感染后，种子的品质下降，发芽率降低，芽苗生长势减弱，更易被其他病害侵染。SpLV随种子传毒的效率非常高，在藜麦和菠菜上种传率超过50%，在烟叶上超过90%[1]。韩国曾多次从输韩菠菜种子上截获SpLV，并在2007年把该病毒列入输韩植物和植物产品检疫性有害生物名录。此次在菠菜种子上截获菠菜潜隐病毒，保护了我国蔬菜种植业的安全，为防止该病毒的传入，广州海关对该批菠菜种子作退运处理。但是由于有害生物分布的非均匀性以及种子带毒率的非一致性，入境第一口岸能否检出有害生物以便识别风险，这是一个概率事件，而不是百分之百能够检出有害生物的必然事件。因此国外预检及入境后的监管、监测及跟踪检疫更为重要。
参考文献：
[1]Bos L，Huttinga H，Maat D Z. Spinach latent virus，a new ilarvirus seed-borne in Spinacia oleracea[J]. Journal of Plant Pathology，1980，86（2）：79-98.
[2]Ge X，Scott S W，Zimmerman M T. The complete sequence of the genomic RNAs of spinach latent virus[J]. Arch Virology，1997，142（6）：1213-1226.
[3]Fotopoulos V，Dovas C I，Katis N I. Incidence of viruses infecting spinach in Greece，highlighting the importance of weeds as reservoir hosts[J]. Journal of Plant Pathology，2011，93（2）：389-395.
[4]Lebas B，Ochoa-Corona F M，Tang Z J，et al. First report of Spinach latent virus in tomato in New Zealand[J]. Plant Disease，2007，91（2）：228.
[5]Vargas A J，Mclane H，Bush E，et al. Spinach latent virus infecting tomato in Virginia，United States[J]. Plant Disease，2013，97（12）：1662-1663.
[6]Mustafa G，Erbay E，Semih E，et al. Occurrence of viruses infecting spinach in Western Anatolia of Turkey[J]. Journal of Food Agriculture and Environment，2014，12（1）：272-275.林 姍，陆兴利，赵金鹏，等. 四川省猕猴桃溃疡病发生的气象条件和综合防治[J].