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摘要 ：本文采用传统形态学与分子生物学相结合的方法，对采自山西省窖藏马铃薯和薯蓣块茎中的短体线虫进行了种类鉴定。结果表明，从马铃薯块茎中分离出的短体线虫形态学特征与斯克里布纳短体线虫Pratylenchus scribneri一致，其SSU序列与P.scribneri美国群体相似性达99.8%。从薯蓣块茎中分离出的短体线虫形态学特征与咖啡短体线虫P.coffeae一致，其ITS序列与P.coffeae浙江群体相似性达98.8%。斯克里布纳短体线虫首次在我国马铃薯块茎中发现，咖啡短体线虫首次在山西省薯蓣块茎中发现。
关键词 ：山西; 马铃薯; 薯蓣; 斯克里布纳短体线虫; 咖啡短体线虫; 鉴定
中图分类号：
S 432.45
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2020036
Identification of two species of Pratylenchus （Nematoda： Pratylenchidae） from
the tubers of potato and yam in storage in Shanxi province
FENG Yeqing1， YAO Yanan1， DU Juan1， YANG Yimeng1， XU Yumei1*， ZHAO Zengqi1，2， WANG Jianming1
（1. College of Plant Protection， Shanxi Agricultural University， Jinzhong 030801， China;
2. Manaaki Whenua-Landcare Research， Auckland 1072， New Zealand）
Abstract
Two species of Pratylenchus， collected from the tubers of potato and yam in storage in Shanxi province， were identified based on morphological and molecular analyses in this study. The results showed that the morphological characteristics of the nematode population extracted from potato tubers were consistent with those of P.scribneri. It had 99.8% nucleotide similarity in SSU gene sequence with an American P.scribneri population. The morphological characteristics of the nematode population extracted from yam tubers were consistent with those of P.coffeae， with a 98.8% nucleotide similarity in ITS gene sequence with a Zhejiang Pcoffeae population. P.scribneri was first reported in potato tubers in China and P.coffeae was first found in yam tubers in Shanxi.
Key words
Shanxi province; potato; yam; Pratylenchus scribneri; Pratylenchus coffeae; identification
短體属线虫Pratylenchus Filipjev是一类根部迁移性、内寄生的植物病原线虫，可引起多种作物的根腐线虫病，其寄主范围和地理分布广泛，对寄主作物具有严重的经济危害性[1]，可给农业生产造成极大的损失[2]。
目前全球范围内已报道的短体线虫有效种为106种[36]，我国报道的有30余种，其中有些种类因缺乏详细的形态学或分子生物学数据而暂不列为有效种[79]。目前将咖啡短体线虫P.coffeae、穿刺短体线虫P.penetrans、伤残短体线虫P.vulnus、玉米短体线虫P.zeae、蒿短体线虫P.artemisiae和薯蓣短体线虫P.dioscoreae共6种列为中国种。
2017年-2019年，在对山西省薯类线虫病害进行调查的过程中，从窖藏马铃薯和薯蓣块茎中各分离到一种短体线虫。为明确其种类，本文采用了形态学和分子生物学相结合的方法，对马铃薯和薯蓣块茎中分离到的短体线虫进行了鉴定。
1 材料与方法
1.1 线虫样本的采集和分离
2019年4月自山西省晋中市太谷区桑梓村（112°37′46″E，37°26′54″N，海拔817 m）采集马铃薯Solanum tuberosum和薯蓣Dioscorea polystachya窖藏块茎样本，装入自封袋带回实验室。将2种块茎用自来水冲洗干净，晾干，切成约1 cm3的小块，采用浅盘法[10]分离，12 h后收集线虫。
1.2 线虫的杀死固定、形态观察和测量
挑取若干条线虫制成临时玻片，在体视显微镜（Motic SMZ-168，中国）下初步观察其形态特征。然后用4%甲醛热杀死固定，采用改进的甘油乙醇法[11]脱水，用脱水后的线虫制作永久玻片[12]。利用微分干涉光学显微镜（Nikon 80i，日本）观察、拍照并测量。采用de Man公式分析数据，并参照Castillo等[13]的方法进行种类鉴定。 1.3 线虫的DNA提取、PCR扩增测序和系统发育树构建
线虫DNA提取采用蛋白酶K法[1415]。
SSU PCR扩增采用2对引物：分别为上游引物1096F（5′-GGTAATTCTGGAGCTAATAC-3′）和下游引物1912R（5′-TTTACGGTCAGAACTAGGG-3′）;上游引物1813F（5′-CTGCGTGAGAGGTGAAAT-3′） 和下游引物2646R（5′-GCTACCTTGTTACGACTTTT-3′）[16]。ITS PCR扩增采用上游引物FerF（5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′）和下游引物rDNA2（5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′）[1718]。
20 μL反应体系：2×Easy Taq PCR SuperMix 10 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。扩增程序：95℃预变性3 min;94℃变性60 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，共40个循环;最后72℃延伸10 min。
PCR扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。用Sequencher 5.2.2软件检查测序结果并进行序列拼接。将获得的序列在GenBank中进行同源性比对，采用MrBayes 3.2.7构建系统发育树，用FigTree V 1.4.3软件读取结果。
2 结果与分析
通过形态学和分子生物学特征，将从窖藏马铃薯和薯蓣块茎中分离到的短体线虫分别鉴定为斯克里布纳短体线虫P.scribneri和咖啡短体线虫P.coffeae。具体鉴定结果如下：
2.1 斯克里布纳短体线虫Pratylenchus scribneri Steiner in Sherbakoff
关键词 ：山西; 马铃薯; 薯蓣; 斯克里布纳短体线虫; 咖啡短体线虫; 鉴定
中图分类号：
S 432.45
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2020036
Identification of two species of Pratylenchus （Nematoda： Pratylenchidae） from
the tubers of potato and yam in storage in Shanxi province
FENG Yeqing1， YAO Yanan1， DU Juan1， YANG Yimeng1， XU Yumei1*， ZHAO Zengqi1，2， WANG Jianming1
（1. College of Plant Protection， Shanxi Agricultural University， Jinzhong 030801， China;
2. Manaaki Whenua-Landcare Research， Auckland 1072， New Zealand）
Abstract
Two species of Pratylenchus， collected from the tubers of potato and yam in storage in Shanxi province， were identified based on morphological and molecular analyses in this study. The results showed that the morphological characteristics of the nematode population extracted from potato tubers were consistent with those of P.scribneri. It had 99.8% nucleotide similarity in SSU gene sequence with an American P.scribneri population. The morphological characteristics of the nematode population extracted from yam tubers were consistent with those of P.coffeae， with a 98.8% nucleotide similarity in ITS gene sequence with a Zhejiang Pcoffeae population. P.scribneri was first reported in potato tubers in China and P.coffeae was first found in yam tubers in Shanxi.
Key words
Shanxi province; potato; yam; Pratylenchus scribneri; Pratylenchus coffeae; identification
短體属线虫Pratylenchus Filipjev是一类根部迁移性、内寄生的植物病原线虫，可引起多种作物的根腐线虫病，其寄主范围和地理分布广泛，对寄主作物具有严重的经济危害性[1]，可给农业生产造成极大的损失[2]。
目前全球范围内已报道的短体线虫有效种为106种[36]，我国报道的有30余种，其中有些种类因缺乏详细的形态学或分子生物学数据而暂不列为有效种[79]。目前将咖啡短体线虫P.coffeae、穿刺短体线虫P.penetrans、伤残短体线虫P.vulnus、玉米短体线虫P.zeae、蒿短体线虫P.artemisiae和薯蓣短体线虫P.dioscoreae共6种列为中国种。
2017年-2019年，在对山西省薯类线虫病害进行调查的过程中，从窖藏马铃薯和薯蓣块茎中各分离到一种短体线虫。为明确其种类，本文采用了形态学和分子生物学相结合的方法，对马铃薯和薯蓣块茎中分离到的短体线虫进行了鉴定。
1 材料与方法
1.1 线虫样本的采集和分离
2019年4月自山西省晋中市太谷区桑梓村（112°37′46″E，37°26′54″N，海拔817 m）采集马铃薯Solanum tuberosum和薯蓣Dioscorea polystachya窖藏块茎样本，装入自封袋带回实验室。将2种块茎用自来水冲洗干净，晾干，切成约1 cm3的小块，采用浅盘法[10]分离，12 h后收集线虫。
1.2 线虫的杀死固定、形态观察和测量
挑取若干条线虫制成临时玻片，在体视显微镜（Motic SMZ-168，中国）下初步观察其形态特征。然后用4%甲醛热杀死固定，采用改进的甘油乙醇法[11]脱水，用脱水后的线虫制作永久玻片[12]。利用微分干涉光学显微镜（Nikon 80i，日本）观察、拍照并测量。采用de Man公式分析数据，并参照Castillo等[13]的方法进行种类鉴定。 1.3 线虫的DNA提取、PCR扩增测序和系统发育树构建
线虫DNA提取采用蛋白酶K法[1415]。
SSU PCR扩增采用2对引物：分别为上游引物1096F（5′-GGTAATTCTGGAGCTAATAC-3′）和下游引物1912R（5′-TTTACGGTCAGAACTAGGG-3′）;上游引物1813F（5′-CTGCGTGAGAGGTGAAAT-3′） 和下游引物2646R（5′-GCTACCTTGTTACGACTTTT-3′）[16]。ITS PCR扩增采用上游引物FerF（5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′）和下游引物rDNA2（5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′）[1718]。
20 μL反应体系：2×Easy Taq PCR SuperMix 10 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。扩增程序：95℃预变性3 min;94℃变性60 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，共40个循环;最后72℃延伸10 min。
PCR扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。用Sequencher 5.2.2软件检查测序结果并进行序列拼接。将获得的序列在GenBank中进行同源性比对，采用MrBayes 3.2.7构建系统发育树，用FigTree V 1.4.3软件读取结果。
2 结果与分析
通过形态学和分子生物学特征，将从窖藏马铃薯和薯蓣块茎中分离到的短体线虫分别鉴定为斯克里布纳短体线虫P.scribneri和咖啡短体线虫P.coffeae。具体鉴定结果如下：
2.1 斯克里布纳短体线虫Pratylenchus scribneri Steiner in Sherbakoff