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摘要：本文采用高效液相色谱法测定虎杖提取物中白藜芦醇含量。测定条件: Hypersil ODS2-C18柱（4.6×250mm, 5μm）,流动相为甲醇：水( 40：60) ,检测波长: 303 nm，流速：1.0ml/min。结果表明:白藜芦醇在0. 4~2. 0μg 范围内具良好的线性关系, 相关系数= 0. 9998,平均回收率为 98. 19%（n=3）。结论：本方法操作简便快速，结果准确可靠，适于虎杖提取物中自藜芦醇的测定。
关键词：白藜芦醇；虎杖提取物；高效液相色谱法
Determination Of resveratrol In Polygonum Cuspidatum Extract
By High Performance Liquid Chromatography
Liu De-zhi
Zhejiang huisong Pharmaceutical Co. Ltd, Hangzhou 310018
Abstract: In this paper, the determination of resveratrol in Polygonum cuspidatum extract by hplc. Determination of conditions: Hypersil ODS2-C18 column ( 4.6 × 250mm, 5 μ m ), mobile phase of methanol: water ( 40:60 ), the detection wavelength: 303nm, flow rate: 1.0ml·min. Results: resveratrol has good linear relationship in the 0 4~2. 0 μg range, correlation coefficient = 0.9998, the average recovery rate was 98.19% ( n=3 ). Conclusion: the method is simple and rapid, accurate and reliable, and is suitable for determination of resveratrol from Polygonum cuspidatum extract.
Key words: Resveratrol; Polygonum cuspidatum extract; High performance liquid chromatography
虎杖提取物是由虎杖经一定的提取工艺提取而成。虎杖为蓼科植物虎杖的干燥根和根茎，主含蒽醌类和芪类化合物, 其中芪类成分尤其是白藜芦醇( resveratrol) 具有重要生理活性。白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝结和血管舒张，保持血液畅通，可预防癌症的发生及发展，具有抗动脉粥样硬化和冠心病，缺血性心脏病，高血脂的防治作用，用于治疗多种病痛，其中包括霉菌感染，多种皮肤炎症，心血管疾病和肝脏疾病等。白藜芦醇同时显示出有助于心血管健康和活血，减轻疼痛，清热去湿，去毒去痰。目前, 有关虎杖提取物中白藜芦醇含量测定方法的研究报告尚不多见, 为此, 本文对虎杖中白藜芦醇含量的HPLC测定方法进行了研究。本文建立的测定虎杖中自藜芦醇的反相高效液相色谱法，以甲醇-水体系为流动相，采用等度洗脱，方法准确，快速，简单，准确度好，精密度和回收率都符合要求。
1仪器和试剂
日本岛津LC-10Atvp高效液相色谱；日本岛津SPD-10A检测器；CLASS-VP工作站；色谱柱（Hypersil ODS2 C18, 4.6×250mm, 5μm）；日本岛津CTO-10AS柱温箱。
虎杖提取物（自制批号PC101-101006、PC101-101115）；白藜芦醇标准品（来源中国药品生物制品检验所，批号111535-200502，纯度100%）；甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为重蒸水。
2溶液的制备
2.1对照品溶液的制备
精密称取10mg白藜芦醇，加入到25ml容量瓶中，加甲醇溶解，定容。精密吸管10ml到50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液。
2.2 供试品溶液制备
精密称取40mg样品到100ml容量瓶中，加入80ml甲醇溶解，超声15分钟，冷却到室温，加甲醇定容至刻度，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。
3色谱条件
色谱柱：Hypersil ODS2 C18, 4.6×250mm, 5μm；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；流动相：甲醇：水（40 : 60）；波长：303nm；此条件下白藜芦醇及其苷的理论塔板数均不低于3000。
4 测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
5方法与结果
根据ICH指南和日本药典14版。我们确定验证虎杖提取物中白藜芦醇含量测定方法学验证应符合以下标准要求。
5.1 鉴定试验
按上述条件进行了标准品和样品测试的对比，并进行光谱扫描。结果标准品和样品保留时间相同，主峰完全分离，光谱扫描在波长303nm处有最大吸收。
白藜芦醇对照品色谱峰 白藜芦醇光谱扫描
样品色谱图样品光谱扫描
5.2 准确性和可重复性
通过日内和日间差异，对重复性进行了分析。日内差异对样品一天内进行六次测试，日间差异按照6天对样品进行了6次测试。检验标准的相对标准偏差不得过2%。按照本方法检验，结果日内差异相对标准偏差为0.59%，日间差异相对标准偏差是1.08%，符合要求。
相关数据见附表1、附表2：
附表1：日内差异
附表2：日间差异
5.3 精度和可重复性
重现性进行了不同检验人员在不同的设备检验同一样品。要求相对标准偏差不得过2%。按照要求进行重复性检验，相对标准偏差为0.57%，符合要求。相关数据见附表3：
附表3
5.4检测限
检测限经标准溶液稀释后进行检测，按照信噪比10：1时相应的浓度确定，我们发现，检测限为：8.0×10-5mg/ml。
5.5线性与范围
采用6种不同浓度
0.12 mg/ml）进样分析，峰面积与浓度应呈良好的线性关系，计算回归方程及相关系数，回归线的相关系数（R）>0.995。检查结果峰面积与浓度呈良好的线性关系，回归线的相关系数（R）为0.9999，符合要求。相关数据见附表4：
附表4：
5.6 加样回收
取白藜芦醇标准品与已知含量的样品（PC101-101006和PC101-101115）混合,然后按照分析方法制备样品进行检测。白藜芦醇回收率应大于95%。检验结果，回收率为99.67%，符合要求。相关数据见附表：
附表
6结论
6.1 波长的选择：白藜芦醇的紫外吸收光谱在220nm和303nm左右有吸收峰，因220左右噪音影响较大，检测数据不稳定，所以选择303nm作为检测波长，并收到较好的实验效果。
6.2在流动相的选择上，文献报道较多的是采用乙腈-水体系，考虑到乙腈的毒性，本文选用甲醇-水体系，试验结果证明，本文建立的HPLC法，样品不需要预处理，可对提取液直接进样分析。
6.3本文所采用的方法测定虎杖提取物中白藜芦醇含量，准确，快速，简单，准确度好，精密度和回收率都符合要求，该方法可用于虎杖提取物中白藜芦醇含量测定。
参考文献：
1 ICH验证指南：分析方法的验证。
2 日本药典14版。
3 ChP(中国药典).2010.Vol I(一部)
2 ZENG Jian—guo(曾建国)，HOU Tuan—zlang(候团章)。ZHANG Sheng(张胜).HPLC assay for resveratrol in the extracts of Polygo- num cuspidatum Sieb.et Zucc.(高效液相色谱法测定虎杖提取物 中白藜芦醇的含量).Chin J Tradit Med Sci Technol(中国中医药科技)。2000，7(3)：175
3 ZHU Hong—jin(朱鸿津).Determination of resvemtrol in Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.by HPLC(HPLC法测定虎杖中白藜芦醇 的含量).ProgPharm Sci(药学进展)。2001，25(1)：110
4 WANG Dan(王丹)。TANG Ying(唐盈).Studies on the determina— tion of piceid in Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.(中药虎杖中白藜芦醇甙含量测定的研究).Chin Tradit Herb Drugs(中草药)。 1987，18(11)：16
关键词：白藜芦醇；虎杖提取物；高效液相色谱法
Determination Of resveratrol In Polygonum Cuspidatum Extract
By High Performance Liquid Chromatography
Liu De-zhi
Zhejiang huisong Pharmaceutical Co. Ltd, Hangzhou 310018
Abstract: In this paper, the determination of resveratrol in Polygonum cuspidatum extract by hplc. Determination of conditions: Hypersil ODS2-C18 column ( 4.6 × 250mm, 5 μ m ), mobile phase of methanol: water ( 40:60 ), the detection wavelength: 303nm, flow rate: 1.0ml·min. Results: resveratrol has good linear relationship in the 0 4~2. 0 μg range, correlation coefficient = 0.9998, the average recovery rate was 98.19% ( n=3 ). Conclusion: the method is simple and rapid, accurate and reliable, and is suitable for determination of resveratrol from Polygonum cuspidatum extract.
Key words: Resveratrol; Polygonum cuspidatum extract; High performance liquid chromatography
虎杖提取物是由虎杖经一定的提取工艺提取而成。虎杖为蓼科植物虎杖的干燥根和根茎，主含蒽醌类和芪类化合物, 其中芪类成分尤其是白藜芦醇( resveratrol) 具有重要生理活性。白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝结和血管舒张，保持血液畅通，可预防癌症的发生及发展，具有抗动脉粥样硬化和冠心病，缺血性心脏病，高血脂的防治作用，用于治疗多种病痛，其中包括霉菌感染，多种皮肤炎症，心血管疾病和肝脏疾病等。白藜芦醇同时显示出有助于心血管健康和活血，减轻疼痛，清热去湿，去毒去痰。目前, 有关虎杖提取物中白藜芦醇含量测定方法的研究报告尚不多见, 为此, 本文对虎杖中白藜芦醇含量的HPLC测定方法进行了研究。本文建立的测定虎杖中自藜芦醇的反相高效液相色谱法，以甲醇-水体系为流动相，采用等度洗脱，方法准确，快速，简单，准确度好，精密度和回收率都符合要求。
1仪器和试剂
日本岛津LC-10Atvp高效液相色谱；日本岛津SPD-10A检测器；CLASS-VP工作站；色谱柱（Hypersil ODS2 C18, 4.6×250mm, 5μm）；日本岛津CTO-10AS柱温箱。
虎杖提取物（自制批号PC101-101006、PC101-101115）；白藜芦醇标准品（来源中国药品生物制品检验所，批号111535-200502，纯度100%）；甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为重蒸水。
2溶液的制备
2.1对照品溶液的制备
精密称取10mg白藜芦醇，加入到25ml容量瓶中，加甲醇溶解，定容。精密吸管10ml到50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液。
2.2 供试品溶液制备
精密称取40mg样品到100ml容量瓶中，加入80ml甲醇溶解，超声15分钟，冷却到室温，加甲醇定容至刻度，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。
3色谱条件
色谱柱：Hypersil ODS2 C18, 4.6×250mm, 5μm；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；流动相：甲醇：水（40 : 60）；波长：303nm；此条件下白藜芦醇及其苷的理论塔板数均不低于3000。
4 测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
5方法与结果
根据ICH指南和日本药典14版。我们确定验证虎杖提取物中白藜芦醇含量测定方法学验证应符合以下标准要求。
5.1 鉴定试验
按上述条件进行了标准品和样品测试的对比，并进行光谱扫描。结果标准品和样品保留时间相同，主峰完全分离，光谱扫描在波长303nm处有最大吸收。
白藜芦醇对照品色谱峰 白藜芦醇光谱扫描
样品色谱图样品光谱扫描
5.2 准确性和可重复性
通过日内和日间差异，对重复性进行了分析。日内差异对样品一天内进行六次测试，日间差异按照6天对样品进行了6次测试。检验标准的相对标准偏差不得过2%。按照本方法检验，结果日内差异相对标准偏差为0.59%，日间差异相对标准偏差是1.08%，符合要求。
相关数据见附表1、附表2：
附表1：日内差异
附表2：日间差异
5.3 精度和可重复性
重现性进行了不同检验人员在不同的设备检验同一样品。要求相对标准偏差不得过2%。按照要求进行重复性检验，相对标准偏差为0.57%，符合要求。相关数据见附表3：
附表3
5.4检测限
检测限经标准溶液稀释后进行检测，按照信噪比10：1时相应的浓度确定，我们发现，检测限为：8.0×10-5mg/ml。
5.5线性与范围
采用6种不同浓度
0.12 mg/ml）进样分析，峰面积与浓度应呈良好的线性关系，计算回归方程及相关系数，回归线的相关系数（R）>0.995。检查结果峰面积与浓度呈良好的线性关系，回归线的相关系数（R）为0.9999，符合要求。相关数据见附表4：
附表4：
5.6 加样回收
取白藜芦醇标准品与已知含量的样品（PC101-101006和PC101-101115）混合,然后按照分析方法制备样品进行检测。白藜芦醇回收率应大于95%。检验结果，回收率为99.67%，符合要求。相关数据见附表：
附表
6结论
6.1 波长的选择：白藜芦醇的紫外吸收光谱在220nm和303nm左右有吸收峰，因220左右噪音影响较大，检测数据不稳定，所以选择303nm作为检测波长，并收到较好的实验效果。
6.2在流动相的选择上，文献报道较多的是采用乙腈-水体系，考虑到乙腈的毒性，本文选用甲醇-水体系，试验结果证明，本文建立的HPLC法，样品不需要预处理，可对提取液直接进样分析。
6.3本文所采用的方法测定虎杖提取物中白藜芦醇含量，准确，快速，简单，准确度好，精密度和回收率都符合要求，该方法可用于虎杖提取物中白藜芦醇含量测定。
参考文献：
1 ICH验证指南：分析方法的验证。
2 日本药典14版。
3 ChP(中国药典).2010.Vol I(一部)
2 ZENG Jian—guo(曾建国)，HOU Tuan—zlang(候团章)。ZHANG Sheng(张胜).HPLC assay for resveratrol in the extracts of Polygo- num cuspidatum Sieb.et Zucc.(高效液相色谱法测定虎杖提取物 中白藜芦醇的含量).Chin J Tradit Med Sci Technol(中国中医药科技)。2000，7(3)：175
3 ZHU Hong—jin(朱鸿津).Determination of resvemtrol in Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.by HPLC(HPLC法测定虎杖中白藜芦醇 的含量).ProgPharm Sci(药学进展)。2001，25(1)：110
4 WANG Dan(王丹)。TANG Ying(唐盈).Studies on the determina— tion of piceid in Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.(中药虎杖中白藜芦醇甙含量测定的研究).Chin Tradit Herb Drugs(中草药)。 1987，18(11)：16