【摘 要】
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目的利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼faf1基因,并研究faf1基因对斑马鱼发育的影响。方法针对斑马鱼faf1基因设计并制备gRNA,通过显微注射技术将gRNA与Cas9 mRNA混合注入斑马鱼
【机 构】
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重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室; 重庆医科大学基础医学院发育生物学研究室;
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目(31171388);重庆市杰出青年科学基金(CSTC2012jjjq10001)~~
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目的利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼faf1基因,并研究faf1基因对斑马鱼发育的影响。方法针对斑马鱼faf1基因设计并制备gRNA,通过显微注射技术将gRNA与Cas9 mRNA混合注入斑马鱼单细胞胚胎中,通过酶切和基因测序技术筛选出发生突变的F0代斑马鱼,将其与野生型斑马鱼外交得到F1代杂合体斑马鱼,检测其可遗传突变类型,并用显微镜观察、记录每一代斑马鱼表型。结果成功制备了faf1 gRNA和Cas9 mRNA。位于faf1 6号外显子的gRNA(gRNA6)能使faf1基因发生移码突变。筛选出可遗传突变类型(mutant 1,MU1)并观察到该杂合突变型斑马鱼有体细胞色素沉积延迟,受精后第4天开始尾部肌节出现"结节样"表型以及头颅缩小、舌骨小角角度增大等颅面软骨畸形的变化,并于受精后8~9 d死亡。结论利用CRISPR/Cas9敲除该基因产生了新的表型,即色素沉积延迟及尾部肌节部位出现"结节样"变化。
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