【摘 要】
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以前期工作中获得的一个可以直接转化头孢菌素C(CPC)为7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的CPC酰化酶为基础,采用易错PCR,引入不同浓度的Mg2+和Mn2+,所得易错PCR产物经克隆、转化后进行
【机 构】
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中国医药工业研究总院上海医药工业研究院;
【基金项目】
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国家“十二五”重大新药科技专项(2011ZX09203-001-06);上海市自然科学基金(11ZR1435200);中国医药集团新产品项目基金(2011HY03-1)给予资助
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以前期工作中获得的一个可以直接转化头孢菌素C(CPC)为7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的CPC酰化酶为基础,采用易错PCR,引入不同浓度的Mg2+和Mn2+,所得易错PCR产物经克隆、转化后进行初筛,共筛选了400株转化子,其中有35株酶活力得到提高。采用金属螯合亲和色谱法分离得到纯酶后再进行复筛,其中一株酶活力显著提高,转化率提高约35%。测序结果显示,该CPC酰化酶突变蛋白的编码序列中有两个碱基发生突变,使得第122位的丙氨酸被替换为缬氨酸。在最适条件下,该酶催化CPC生成7-ACA的转化率为95%。
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