论文部分内容阅读
摘 要: 目的:研究急性运动或AICAR注射对mTOR及下游信号的影响,旨在探讨AMPK调控骨骼 肌蛋白合成的机制。方法:52只雄性SD大鼠分为4组:安静对照组(n=8)、运动组(n=18) 、生理盐水注射对照组(n=8)、AICAR注射组(n=18)。运动速度26 m/min,坡度10%,时 间60 min。运动和注射组分别在结束后即刻、1 h、6 h和1 h、2 h、6 h取材。结果:运动 后即刻、注射后1 h,mTOR Ser2448磷酸化(分别下降45%和38%)和4EBP1 Thr37/46磷 酸化均显著降低(分别下降34%和38%),运动后1 h和注射后2 h mTOR及4EBP1开始增加 ,6 h达峰值。注射组S6K1 Thr389磷酸化水平在各时间点无显著变化,运动组均显著升高( 分别增加42%、52%和57%)。 结论:一次性剧烈运动或AICAR注射导致蛋白合成的暂时抑 制,其机制与AMPK下调mTOR Ser2448及其下游信号4EBP1 Thr37/46的磷酸化水平有关, 但未发现S6K1 Thr389磷酸化水平的下调。
关键词:AMPK;mTOR;蛋白合成;骨骼肌
中图分类号:G804.2文献标识码:A文章编号 :1007-3612(2009)05-0039-04
Acute Exercise or AICAR Injection Effect on mTOR signaling Pathw ay in Rat's Skeletal MuscleZHANG Guohua1, ZHU Yili2, ZENG Fanxing3
(1.College of Physical Education, Yangtze University, Jingzhou 434020, Hubei China;2.Capital Institute of Physical Education, Beijing 100088, China;3. Beijing Sports University, Beijing100084, China)
Abstract: Purpose: To study acute exercise or AICAR injection effect on mTOR andtheir downstream signaling, and to approach the mechanism that AMPK depresses p rotein synthesis in skeletal muscle. Methods:52 rats are randomly divided intofour groups, namely rest group (n=8), exercise group (n=18), saline injection gr oup (n=8), and AICAR injection group (n=18). After adaptable training, rats of e xercise group complete a bout treadmill exercise as26m/min speed,10% slope and60 min. Rats are respectively killed at immediate postexercise (0h),1h and 6 h , and at1h,2h, and 6h postinject. Results: At postexercise 0h or postinj ect 1h, mTOR Ser2448 and4EBP1 Thr37/46 phosphorylation are significantly decreas e d, then increased at1h or2h, and to the peaking at 6h. P70S6K Thr389 phosphory lation is not changed in injection groups but increases in exercise groups at al l times. Conclusions: A bout of exercise or AICAR injection can temporarily depr ess protein synthesis in skeletal muscle. The mechanism is related to down regul ate phosphorylation mTOR Ser2448 and4EBP1 Thr37/46 by AMPK, but not to down r egulate phosphorylation S6K1 Thr389.
Key words: AMPK; mTOR; protein synthesis; skeletal muscle
近年来,一些研究证实5′-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(5′-AMP activated protein kina se , AMPK)能抑制蛋白合成[1-2],其分子机制可能涉及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammal ian target of rapamycin,mTOR)信号通路[3]。AMPK通过何种机制调控mTOR信号 通路目前 还未阐明,初步的研究涉及mTOR信号通路上的多个分子如PKB、TSC2、mTOR、4E-BP1、S6K1 等,但其作用的主要靶点还不清楚。
急性运动或AICAR注射时,AMPK活性和mTOR信号通路的变化时程有什么特点?二者有什么样 的关系?目前未见报道。本实验采用一次性运动、一次性AICAR注射方法,研究运动或AICAR 对骨骼肌mTOR信号通路的影响,探讨AMPK抑制骨骼肌蛋白合成的分子机制。实验假设AMPK对 蛋白合成的抑制涉及mTOR信号通路。
1 材料与方法
1.1 动物及分组实验动物:8周龄健康雄性SD大鼠,体重180～200 g,由北京大学医学部实验动物中心提 供。昼夜节律人工控制光照(光照时间为07:00-19:00),环境温度(23±2)℃,动物自由 取食及饮水。
分组:52只雄性SD大鼠分为安静对照组(n=8)、运动组(n=18)、生理盐水注射对照组(n=8) 、AICAR注射组(n=18)。注射和运动方案:注射组以0.5 mg/g 体重剂量在大鼠后肢大腿外侧皮下一次性注射AICAR 溶 液(浓度为65 mg/mL),生理盐水注射部位、剂量同AICAR。运动组以26 m/min的速度,10% 的坡度进行一次性运动,时间为60 min。
1.2 取材方法 运动组分别在运动后即刻、1 h、6 h取材,AICAR注射组分别在注射后1 h、2 h、6 h取材。 取材前动物用20%的乌拉坦腹腔麻醉(0.8 mL/100 g体重)后,速取右后肢腓肠肌的白肌部 分(位于腓肠肌外侧浅层)约200 mg,装入冻存管后投入液氮中保存,用于AMPK活性及mTOR 、4E-BP1和S6K1磷酸化测定。
1.3 测试方法 AMPK活性的测定采用放射性同位素方法,即根据AMPK使特异性肽底物SAMS(氨基酸序列为HM RSAMSGLHLVKRR)磷酸化的原理,以[γ-32P]ATP作为磷供体检测酶的活性。按照Shin Ter ada[4]和Wim[5]提供的方法进行,AMPK活力单位:30℃条件下,每分钟 将1 nmol磷催化转入SAMS的酶量即1个单位酶活。mTOR、4E-BP1、P70S6K1磷酸化测定采用we stern blot方法。
1.4 统计处理 全部统计学分析均采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差(X±SD)表示,计量资料的比较用单因素方差分析。显著性水平取P<0.05,非常显著性水 平取P<0.01。
2 结 果
2.1 急性运动或AICAR注射AMPK活性的变化 和安静对照组相比,一次大强度运动后即刻,腓肠肌AMPK活性升高180%(P<0.01),2h组和1 h相比显著下降,但仍高于对照组(P<0.01),6 h恢复到对照组水平。和生 理 盐水注射对照组相比,一次AICAR注射后1 h,腓肠肌AMPK活性升高62%(P<0.01),2h时基本恢复(与对照组相比无显著差异,P>0.05),6 h时完全恢复。
均数±标准差(X±SD)。**表示与对照组相比有非常显著性差异, P<0.01。$$表示与即刻相比,有非常显著性差异,P<0.01。
2.2 急性运动或AICAR注射mTOR、4E-BP1、P70S6K1磷酸化水平的变化和安静对照组相比,一次大强度运动后各目标蛋白检测位点的磷酸化相对含量(和actin比 较的相对灰度值)变化如下:mTOR Ser2448在运动后即刻下降45%(P<0.05),2 h开 始 升高,6 h时进一步升高(增加87%,P<0.05);4E-BP1 Thr37/46在运动后即刻下降34 % (P<0.05),2 h时增加1.4倍(P<0.01),6 h时进一步升高(增加2.4倍, P<0.01);S6K1Thr389在各时间点分别增加42%、52%和57%(P<0.05)。
差(X±SD)。*表示与安静对照组相比有显著性差异, P<0.05;**表示有非常显著性差异,P<0.01。
和一次生理盐水对照组相比,一次AICAR注射后各目标蛋白检测位点磷酸化相对含量(和act in比较的相对灰度值)变化如下:mTOR Ser2448在注射后1 h下降38%(P<0.05),2 h 开始升高,但无显著性差异,6 h时进一步升高(增加97%,P<0.05);4E-BP1 Thr37/4 6在注射后1 h下降38%(P<0.05),2 h时升高61%(P<0.05),6 h时进一步升高 (增加188%,P<0.01);S6K1Thr389在各时间点均无显著变化(P>0.05)。
(6 h, n=6)mTOR Ser24480.93±0.070.58±0.05*1.18±0.131.84±0.17*4E-BP1 Thr37/460.93±0.080.58±0.05*1.50±0.19*2.68±0.32**S6K1 Thr3890.97±0.120.93±0.091.11±0.101.01±0.12注:结果为平均数±标准差(X±SD)。*表示与生理盐水对照组相比有显著性差 异,P<0.05;**表示有非常显著性差异,P<0.01。
3 分析与讨论
3.1 急性运动或AICAR注射激活骨骼肌AMPK信号5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5′-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside, AICA R)是目前应用较多的AMPK激活剂,它是腺苷的类似物,进入细胞后在腺苷激酶的作用下转 化为单磷酸核苷(ZMP),ZMP是AMP的类似物,它能够变构激活AMPK和其上游激酶AMPKK,后者 继而激活AMPK,此过程并不引起细胞AMP、ADP和ATP水平改变[6]。
本实验结果表明,以0.5 mg/g剂量一次性皮下注射AICAR能显著激活骨骼肌AMPK,注射后1hAMPK活性增加61%(P<0.01),2 h时仍略高于安静水平17%(P>0.05),但无显著 性差异,6h恢复正常。一次性大强度运动后即刻AMPK活性较安静时增加1.8倍,此后持续下降,但1h 时仍高于安静水平,6h时已完全恢复正常。
虽然无法比较运动和AICAR激活AMPK的效应,毕竟运动强度和时间与药物浓度之间尚无法进 行对应,但本实验结果表明运动和注射AICAR均能有效激活骨骼肌AMPK,且恢复时程基本一 致。不过,从本实验结果来看,二者仍表现出一些差异。其一,大强度一次性运动明显强于 AICAR以0.5 mg/g的剂量注射对AMPK的激活程度(数据显示如此)。事实上,运动和AICAR 激 活AMPK的机制是不相同的,前者主要通过AMP和ATP的作用,后者则通过ZMP的作用。ZMP虽然 是AMP的类似物,但其激活AMPK的方式可能与AMP不同。有人认为ZMP可能作用AMPK的外部机 制如激活糖原磷酸酶等其他AMP敏感酶,或是经腺苷受体和/或腺苷转运体发挥作用[7- 8]。 ZMP是否也象AMP一样,通过增加上游激酶对AMPKαThr172位点磷酸化而激活AMPK也不清楚, 而且,AICAR 增加ZMP的同时, ZTP亦见增长,并通过变构效应妨碍AMPK的完全激活。所以 ,ZMP的作用逊于AMP,这可能是AICAR的作用不如运动强烈的部分原因。其二,AICAR注射大 鼠注射后2 h AMPK已恢复正常,而运动大鼠在运动后2 h仍高于安静水平。所以,AICAR对运 动的效应模拟也不是完全一致的。
3.2 一次AICAR注射或运动对mTOR信号通路的影响 不同运动形式对骨骼肌蛋白代谢的影响非常复杂。高频电击、抗阻运动能促进蛋白合成,造 成净体重增加,剧烈或长时间耐力运动对蛋白代谢可能具有抑制作用。Bolster等发现,使 用AICAR孵育使大鼠肝细胞蛋白合成速率明显下降[1]。使用AICAR诱导C2C12肌管AM PK激活发 生于注射后第15 min,并在随后持续上升,相应地,在第15、30和60 min蛋白合成速率分别 下降为注射前的90%、70%和63%[9]。实验表明,AMPK抑制肌细胞蛋白合成的机制涉 及对mTOR信号通路的下调。
本实验发现,一次AICAR注射后1 h,mTOR Ser2448、4E-BP1 Thr37/46磷酸化水平均下降38% ,2 h时开始升高(分别增加26%、61%),6 h时达峰值(分别增加97%和188%),但S6K1 Th r389磷酸化水平在各时间点无显著变化,表明一次注射AICAR能显著抑制骨骼肌mTOR信号通 路,其作用靶点涉及mTOR Ser2448和4E-BP1 Thr37/46磷酸化水平的抑制,但不涉及S6K1 Th r389磷酸化水平的抑制。结合AICAR注射后AMPK活性的变化规律分析,当AMPK活性最高时,m TOR及其下游信号磷酸化水平最低,随着AMPK活性的逐渐下降,mTOR信号通路磷酸化水平逐 渐上升。因此,ATCAR注射对mTOR信号通路的抑制应该是AMPK依赖性的。
本实验还发现,一次性大强度运动后即刻,mTOR Ser2448和4E-BP1 Thr37/46磷酸化水平分 别下降45%和34%,2 h时开始升高(分别升高13%和1.4倍),6 h时达峰值(分别升高87%和2.4倍);S6K1 Thr389磷酸化水平在运动后即刻即见上升,并持续至运动后6 h(分别增加42% 、52%和56%,P<0.05),表明一次性大强度运动能显著抑制mTOR及下游4E-BP1信号, 但不能 抑制S6K1,运动后恢复期蛋白合成增加。结合AMPK活性的变化情况看,运动后即刻,AMPK活 性最大,此时mTOR磷酸化水平最低,而运动后6 h,随着AMPK活性的恢复,mTOR磷酸化水平 达到峰值,表明运动后mTOR及下游信号分子的激活与AMPK有关。但运动后1 h,mTOR、4E-BP1和S6K1信号磷酸化开始增加,而此时AMPK活性仍显著高于安静水平,这似乎令人费解。本 课 题组对此的理解是,AMPK并非控制mTOR信号通路的唯一机制,运动时可能还有其他机制同时 被激活,如MEK/ERK/P90RSK信号通路,该通路和AMPK的作用相反,能促进蛋白合成,运动中 AMPK的作用占优势。运动后一定时间尽管AMPK仍维持激活状态,但随着其活性的下降,其他 激活mTOR通路的机制可能开始占据优势,从而无视AMPK对mTOR通路的抑制效应。所以,运动 后mTOR信号通路的激活可能部分与非AMPK依赖性机制的作用有关。
AMPK作用于mTOR信号通路的靶点存在争议。
首先,AMPK是否能使mTOR去磷酸化而降低其活性?一些研究认为,AMPK能直接或经mTOR的分 子伴侣raptor间接作用于mTOR而抑制其活性。1) 直接磷酸化mTOR Thr2446位点,这使得 另一位点Ser2448的磷酸化被抑制,而Ser2448位点是PKB信号的作用靶,其磷酸化是激活mTO R的最主要方式,所以,AMPK磷酸化mTOR Thr2446位点后,通过抑制PKB介导的Ser2448位点 的磷酸化而间接抑制mTOR的活性[10];2) 通过影响mTOR的分子伴侣raptor而调 节其活性 。从本研究结果来看,无论是AICAR注射还是跑台运动都导致了mTOR 在Ser2448位点的去磷 酸化,似能同意AMPK直接或通过PKB间接抑制mTOR的观点。
其次,AMPK是否能去磷酸化4E-BP1和S6K1?目前存在三种不同的看法:1) AMPK对S6K1和4 E-BP1的磷酸化水平均有作用。有研究发现,使用AICAR诱导AMPK激活后能使raptor-mTOR络 合物变成关闭的、活性下降的形式,导致其磷酸化下游靶4E-BP1和S6K1的能力下降,从而抑 制mTOR信号通路[9];2)4E-BP1是AMPK的主要作用靶。Hans等的研究发现,人体 一次性抗 阻运动后即刻AMPK活性升高并持续至1 h,蛋白合成速度明显下降,运动后1～2 h开始升高 。 同时,运动后即刻4E-BP1磷酸化下降,1～2 h开始升高,而TSC2、PKB、mTOR、eEF2均无显 著 变化,因此认为AMPK主要通过对4E-BP1的去磷酸化而抑制蛋白合成[2]。David等的 研究亦得 到类似结果[11];3) S6K1是AMPK的主要作用靶。Gustavo等发现,一次高频电击 使大鼠胫 骨前肌S6K1磷酸化水平在刺激后3 h显著增加并持续至6 h,并且AICAR能以剂量和时间依赖 方式抑制HCE-T细胞S6K1活性[12]。本实验结果支持4E-BP1是AMPK的主要作用靶点 的观点,因为无论是AICAR注射还是跑台运动均未发生骨骼肌S6K1的去磷酸化。
另外,AMPK是否能控制mTOR的上游信号?虽然本研究未涉及上游指标,但从文献报道可以得 出一些认识。有研究表明,AMPK在两个位点(Thr1227 和Ser1345)直接磷酸化并激活TSC2 ,通过使这两个位点突变证明磷酸化事件增加了TSC复合体抑制mTOR通路的能力[13]。人们 认为TSC2抑制mTOR的活性的分子机制可能涉及小GTP酶Rheb。不过,部分研究不支持AMPK对T SC2的调节作用[2,11]。AMPK是否能影响mTOR的另两种上游信号PI3K和PKB亦存在 争议。有 研究发现在C2C12肌管中使用AICAR导致IRS-1在Ser789位点磷酸化增加,而该位点的磷酸化 导致与IRS-1相关的PI3K活性下降[14]。另一在体研究发现AICAR使骨骼肌PKB在Ser473位点 磷酸化水平下降[15],然而,在培养的HCE-T细胞中,使用AICAR未见到这种影响[16], Cheng等发现AICAR不能通过PKB介导mTOR信号通路功能[17]。
本研究结果表明,AICAR和运动无论是对AMPK的激活,还是对蛋白合成的抑制,都表现出较 好的相似性。大量的运动(包括抗阻、电击和跑台运动的人体和动物模型)研究表明,抗阻 或剧烈耐力运动中,蛋白合成被抑制,运动后恢复期这种抑制被解除,随后进入恢复性增加 阶段,恢复过程可能持续到运动后24～48 h[11]。所以,运动对骨骼肌蛋白合成的 影响是 运动中的抑制和运动后恢复性增加两过程的中和。本实验对AICAR注射效果的研究表明,mTO R及下游信号4E-BP1被短暂抑制,随后磷酸化水平增加,这和运动组的观察结果是一致的。 不过,AICAR注射未能影响S6K1的磷酸化水平,而运动后即刻、1 h和6 h均见S6K1磷酸化水 平增加,尚不能解释造成这种不一致的原因,但至少再次表明AICAR并不能完全模拟运动效 应。
总的来看,目前对AMPK与mTOR信号通路关系的研究主要集中在mTOR及下游信号上,多数学者 同意AMPK能通过磷酸化事件调节mTOR和4E-BP1分子活性,当然,这种影响可能是直接也可能 是间接的。S6K1也可能是AMPK的另一作用靶,但本研究和部分报道未支持这一观点。AMPK与 mTOR信号通路上游分子PI3K、PKB、TSC1/2等的关系的研究材料目前还不丰富,且结论也不 一致,这是本研究领域的今后需要加强的方向。由于AMPK的激活及对mTOR信号通路的作用在 不同肌纤维类型(如快慢肌)、不同运动方式(如力量与耐力)、不同研究对象(如人和啮 齿动物)及不同研究方法(如在体和离体)中并不相同,这可能是导致一些研究结论不一致 的部分原因。
4 结 论
1) 一次性剧烈运动或AICAR注射均能激活骨骼肌AMPK,并导致蛋白合成的暂时抑制,其机 制与AMPK下调mTOR Ser2448及其下游信号4E-BP1 Thr37/46的磷酸化水平有关,但未发现S6K1 Thr389磷酸化水平的下调;
2) 一次性剧烈运动后1h或AICAR注射后2 h,骨骼肌蛋白合成加速,6 h时达峰值,其机制与 mTOR Ser2448、4E-BP1 Thr37/46和S6K1 Thr389磷酸化水平升高相关,但AICAR和运动对S6K1 Thr389磷酸化水平的影响存在差异。
3) 一次性剧烈运动或AICAR注射后1～6 h,AMPK信号的下调与mTOR信号通路的上调时程基本 一致,但不完全同步,表明运动后蛋白合成的恢复与AMPK信号的下调有关,但也可能部分涉 及其他激活mTOR的机制。
参考文献:
[1] Bolster DR, Crozier SJ, Kimball SR & Jefferson LS. AMP-activatedp rotein kinase suppresses protein synthesis in rat skeletal muscle through down-r egulated mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling. J Biol Chem,2002,277 (27):23977-23980.
[2] Hans C. Dreyer, Satoshi Fujita, Jerson G. Cadenas, et al. Resistance ex ercis e increases AMPK activity and reduces4E-BP1 phosphorylation and protein synthes is in human skeletal muscle. Physiology in Press, published online on July27, 2006.
[3] Asumthia S. Jeyapalan, Renan A. Orellana, Agus Suryawan,et al. Glucosestimu lates protein synthesis in skeletal muscle of neonatal pigs through an AMPK- andmTOR-independent process.Am J Physiol Endocrinol Metab,2007,293(8):595-603.
[4] Shin Terada, Masahide Goto, Miyuki Kato, et al. Effects of low-intensitypro longed exercise on PGC-1 mRNA expression in rat epitrochlearis muscle. Biochemi cal and Biophysical Research Communications,2002,296(2):350-354.
[5] Wim Derave, Hua Ai, Jacob Ihlemann,et al. Dissociation of AMP-Activated P rot ein Kinase Activation and Glucose Transport in Contracting Slow-Twitch Muscle.Diabetes,2000,49(8):1281-1287.
[6] Merrill GF, Kurth EJ, Hardie DG, Winder WW. AICA riboside increases AMP-a cti vated protein kinase, fatty acid oxidation, and glucose uptake in rat muscle. A m J Physiol,1997,273:1107-1112.
[7] Li Zhang, Markus Frederich, Huamei He, et al.Relationship between5-amino imi dazole-4-carboxamide-ribotide and AMP-activated protein kinase activity in the p erfused mouse heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,290(3):1235-1243.
[8] Annelies Beckers, Sophie Organe, Leen Timmermans, et al.Methotrexate enha nce s the antianabolic and antiproliferative effects of5-aminoimidazole-4-carboxami de riboside. Mol. Cancer Ther,2006,5(9):2211-2217.
[9] David L. Williamson, Douglas R. Bolster, Scot R. Kimball. Time coursechange s in signaling pathways and protein synthesis in C2C12 myotubes following AMPK a ctivation by AICAR. Am J Physiol Endocrinol Metab,2006,291(1):80-89.
[10] Chiang GG & Abraham RT. Phosphorylation of mammalian target of rapamycin(m TOR) at Ser-2448 is mediated by p70S6 kinase. J Biol Chem,2005,280(27):25485-25490.
[11] David L. Williamson, Neil Kubica, Scot R. Kimball,et al. Exercise-indu ced a lterations in extracellular signal-regulated kinase1/2 and mammalian target ofrapamycin (mTOR) signalling to regulatory mechanisms of mRNA translation in mous e muscle. J Physiol,2006,573(2):497-510.
[12] Gustavo. Nader and Karyna. Esser. Intracellular signaling specificityin sk eletal muscle in response to different modes of exercise. J Appl Physiol,2001,90:1936-1942.
[13] Inoki K, Zhu T, and Guan KL. TSC2 mediates cellular energy response to c ontrol cell growth and survival. Cell,2003,115(5):577-590.
[14] Jakobsen SN, Hardie DG, Morrice N, and Tornqvist HE.5′-AMPactivated pr ote in kinase phosphorylates IRS-1 on Ser-789 in mouse C2C12 myotubes in response to 5-aminoimidazole-4-carboxamide riboside. J Biol Chem,2001,276(50):46912-46916 .
[15] Winder WW and Hardie DG. Inactivation of acetyl-CoA carboxylase and acti vat ion of AMP-activated protein kinase in muscle during exercise. Am J Physiol End ocrinol Metab,1996,270:299-304.
[16] Kimura N, Tokunaga C, Dalal S, et al. A possible linkage between AMP-act iva ted protein kinase (AMPK) and mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pat hway. Genes Cells,2003,8(1):65-79.
[17] Cheng SW, Fryer LG, Carling D & Shepherd PR. Thr2446 is a novel mammalia n t arget of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. JBiol Chem,2004,279(16):15719-15722.
关键词:AMPK;mTOR;蛋白合成;骨骼肌
中图分类号:G804.2文献标识码:A文章编号 :1007-3612(2009)05-0039-04
Acute Exercise or AICAR Injection Effect on mTOR signaling Pathw ay in Rat's Skeletal MuscleZHANG Guohua1, ZHU Yili2, ZENG Fanxing3
(1.College of Physical Education, Yangtze University, Jingzhou 434020, Hubei China;2.Capital Institute of Physical Education, Beijing 100088, China;3. Beijing Sports University, Beijing100084, China)
Abstract: Purpose: To study acute exercise or AICAR injection effect on mTOR andtheir downstream signaling, and to approach the mechanism that AMPK depresses p rotein synthesis in skeletal muscle. Methods:52 rats are randomly divided intofour groups, namely rest group (n=8), exercise group (n=18), saline injection gr oup (n=8), and AICAR injection group (n=18). After adaptable training, rats of e xercise group complete a bout treadmill exercise as26m/min speed,10% slope and60 min. Rats are respectively killed at immediate postexercise (0h),1h and 6 h , and at1h,2h, and 6h postinject. Results: At postexercise 0h or postinj ect 1h, mTOR Ser2448 and4EBP1 Thr37/46 phosphorylation are significantly decreas e d, then increased at1h or2h, and to the peaking at 6h. P70S6K Thr389 phosphory lation is not changed in injection groups but increases in exercise groups at al l times. Conclusions: A bout of exercise or AICAR injection can temporarily depr ess protein synthesis in skeletal muscle. The mechanism is related to down regul ate phosphorylation mTOR Ser2448 and4EBP1 Thr37/46 by AMPK, but not to down r egulate phosphorylation S6K1 Thr389.
Key words: AMPK; mTOR; protein synthesis; skeletal muscle
近年来,一些研究证实5′-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(5′-AMP activated protein kina se , AMPK)能抑制蛋白合成[1-2],其分子机制可能涉及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammal ian target of rapamycin,mTOR)信号通路[3]。AMPK通过何种机制调控mTOR信号 通路目前 还未阐明,初步的研究涉及mTOR信号通路上的多个分子如PKB、TSC2、mTOR、4E-BP1、S6K1 等,但其作用的主要靶点还不清楚。
急性运动或AICAR注射时,AMPK活性和mTOR信号通路的变化时程有什么特点?二者有什么样 的关系?目前未见报道。本实验采用一次性运动、一次性AICAR注射方法,研究运动或AICAR 对骨骼肌mTOR信号通路的影响,探讨AMPK抑制骨骼肌蛋白合成的分子机制。实验假设AMPK对 蛋白合成的抑制涉及mTOR信号通路。
1 材料与方法
1.1 动物及分组实验动物:8周龄健康雄性SD大鼠,体重180～200 g,由北京大学医学部实验动物中心提 供。昼夜节律人工控制光照(光照时间为07:00-19:00),环境温度(23±2)℃,动物自由 取食及饮水。
分组:52只雄性SD大鼠分为安静对照组(n=8)、运动组(n=18)、生理盐水注射对照组(n=8) 、AICAR注射组(n=18)。注射和运动方案:注射组以0.5 mg/g 体重剂量在大鼠后肢大腿外侧皮下一次性注射AICAR 溶 液(浓度为65 mg/mL),生理盐水注射部位、剂量同AICAR。运动组以26 m/min的速度,10% 的坡度进行一次性运动,时间为60 min。
1.2 取材方法 运动组分别在运动后即刻、1 h、6 h取材,AICAR注射组分别在注射后1 h、2 h、6 h取材。 取材前动物用20%的乌拉坦腹腔麻醉(0.8 mL/100 g体重)后,速取右后肢腓肠肌的白肌部 分(位于腓肠肌外侧浅层)约200 mg,装入冻存管后投入液氮中保存,用于AMPK活性及mTOR 、4E-BP1和S6K1磷酸化测定。
1.3 测试方法 AMPK活性的测定采用放射性同位素方法,即根据AMPK使特异性肽底物SAMS(氨基酸序列为HM RSAMSGLHLVKRR)磷酸化的原理,以[γ-32P]ATP作为磷供体检测酶的活性。按照Shin Ter ada[4]和Wim[5]提供的方法进行,AMPK活力单位:30℃条件下,每分钟 将1 nmol磷催化转入SAMS的酶量即1个单位酶活。mTOR、4E-BP1、P70S6K1磷酸化测定采用we stern blot方法。
1.4 统计处理 全部统计学分析均采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差(X±SD)表示,计量资料的比较用单因素方差分析。显著性水平取P<0.05,非常显著性水 平取P<0.01。
2 结 果
2.1 急性运动或AICAR注射AMPK活性的变化 和安静对照组相比,一次大强度运动后即刻,腓肠肌AMPK活性升高180%(P<0.01),2h组和1 h相比显著下降,但仍高于对照组(P<0.01),6 h恢复到对照组水平。和生 理 盐水注射对照组相比,一次AICAR注射后1 h,腓肠肌AMPK活性升高62%(P<0.01),2h时基本恢复(与对照组相比无显著差异,P>0.05),6 h时完全恢复。
均数±标准差(X±SD)。**表示与对照组相比有非常显著性差异, P<0.01。$$表示与即刻相比,有非常显著性差异,P<0.01。
2.2 急性运动或AICAR注射mTOR、4E-BP1、P70S6K1磷酸化水平的变化和安静对照组相比,一次大强度运动后各目标蛋白检测位点的磷酸化相对含量(和actin比 较的相对灰度值)变化如下:mTOR Ser2448在运动后即刻下降45%(P<0.05),2 h开 始 升高,6 h时进一步升高(增加87%,P<0.05);4E-BP1 Thr37/46在运动后即刻下降34 % (P<0.05),2 h时增加1.4倍(P<0.01),6 h时进一步升高(增加2.4倍, P<0.01);S6K1Thr389在各时间点分别增加42%、52%和57%(P<0.05)。
差(X±SD)。*表示与安静对照组相比有显著性差异, P<0.05;**表示有非常显著性差异,P<0.01。
和一次生理盐水对照组相比,一次AICAR注射后各目标蛋白检测位点磷酸化相对含量(和act in比较的相对灰度值)变化如下:mTOR Ser2448在注射后1 h下降38%(P<0.05),2 h 开始升高,但无显著性差异,6 h时进一步升高(增加97%,P<0.05);4E-BP1 Thr37/4 6在注射后1 h下降38%(P<0.05),2 h时升高61%(P<0.05),6 h时进一步升高 (增加188%,P<0.01);S6K1Thr389在各时间点均无显著变化(P>0.05)。
(6 h, n=6)mTOR Ser24480.93±0.070.58±0.05*1.18±0.131.84±0.17*4E-BP1 Thr37/460.93±0.080.58±0.05*1.50±0.19*2.68±0.32**S6K1 Thr3890.97±0.120.93±0.091.11±0.101.01±0.12注:结果为平均数±标准差(X±SD)。*表示与生理盐水对照组相比有显著性差 异,P<0.05;**表示有非常显著性差异,P<0.01。
3 分析与讨论
3.1 急性运动或AICAR注射激活骨骼肌AMPK信号5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5′-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside, AICA R)是目前应用较多的AMPK激活剂,它是腺苷的类似物,进入细胞后在腺苷激酶的作用下转 化为单磷酸核苷(ZMP),ZMP是AMP的类似物,它能够变构激活AMPK和其上游激酶AMPKK,后者 继而激活AMPK,此过程并不引起细胞AMP、ADP和ATP水平改变[6]。
本实验结果表明,以0.5 mg/g剂量一次性皮下注射AICAR能显著激活骨骼肌AMPK,注射后1hAMPK活性增加61%(P<0.01),2 h时仍略高于安静水平17%(P>0.05),但无显著 性差异,6h恢复正常。一次性大强度运动后即刻AMPK活性较安静时增加1.8倍,此后持续下降,但1h 时仍高于安静水平,6h时已完全恢复正常。
虽然无法比较运动和AICAR激活AMPK的效应,毕竟运动强度和时间与药物浓度之间尚无法进 行对应,但本实验结果表明运动和注射AICAR均能有效激活骨骼肌AMPK,且恢复时程基本一 致。不过,从本实验结果来看,二者仍表现出一些差异。其一,大强度一次性运动明显强于 AICAR以0.5 mg/g的剂量注射对AMPK的激活程度(数据显示如此)。事实上,运动和AICAR 激 活AMPK的机制是不相同的,前者主要通过AMP和ATP的作用,后者则通过ZMP的作用。ZMP虽然 是AMP的类似物,但其激活AMPK的方式可能与AMP不同。有人认为ZMP可能作用AMPK的外部机 制如激活糖原磷酸酶等其他AMP敏感酶,或是经腺苷受体和/或腺苷转运体发挥作用[7- 8]。 ZMP是否也象AMP一样,通过增加上游激酶对AMPKαThr172位点磷酸化而激活AMPK也不清楚, 而且,AICAR 增加ZMP的同时, ZTP亦见增长,并通过变构效应妨碍AMPK的完全激活。所以 ,ZMP的作用逊于AMP,这可能是AICAR的作用不如运动强烈的部分原因。其二,AICAR注射大 鼠注射后2 h AMPK已恢复正常,而运动大鼠在运动后2 h仍高于安静水平。所以,AICAR对运 动的效应模拟也不是完全一致的。
3.2 一次AICAR注射或运动对mTOR信号通路的影响 不同运动形式对骨骼肌蛋白代谢的影响非常复杂。高频电击、抗阻运动能促进蛋白合成,造 成净体重增加,剧烈或长时间耐力运动对蛋白代谢可能具有抑制作用。Bolster等发现,使 用AICAR孵育使大鼠肝细胞蛋白合成速率明显下降[1]。使用AICAR诱导C2C12肌管AM PK激活发 生于注射后第15 min,并在随后持续上升,相应地,在第15、30和60 min蛋白合成速率分别 下降为注射前的90%、70%和63%[9]。实验表明,AMPK抑制肌细胞蛋白合成的机制涉 及对mTOR信号通路的下调。
本实验发现,一次AICAR注射后1 h,mTOR Ser2448、4E-BP1 Thr37/46磷酸化水平均下降38% ,2 h时开始升高(分别增加26%、61%),6 h时达峰值(分别增加97%和188%),但S6K1 Th r389磷酸化水平在各时间点无显著变化,表明一次注射AICAR能显著抑制骨骼肌mTOR信号通 路,其作用靶点涉及mTOR Ser2448和4E-BP1 Thr37/46磷酸化水平的抑制,但不涉及S6K1 Th r389磷酸化水平的抑制。结合AICAR注射后AMPK活性的变化规律分析,当AMPK活性最高时,m TOR及其下游信号磷酸化水平最低,随着AMPK活性的逐渐下降,mTOR信号通路磷酸化水平逐 渐上升。因此,ATCAR注射对mTOR信号通路的抑制应该是AMPK依赖性的。
本实验还发现,一次性大强度运动后即刻,mTOR Ser2448和4E-BP1 Thr37/46磷酸化水平分 别下降45%和34%,2 h时开始升高(分别升高13%和1.4倍),6 h时达峰值(分别升高87%和2.4倍);S6K1 Thr389磷酸化水平在运动后即刻即见上升,并持续至运动后6 h(分别增加42% 、52%和56%,P<0.05),表明一次性大强度运动能显著抑制mTOR及下游4E-BP1信号, 但不能 抑制S6K1,运动后恢复期蛋白合成增加。结合AMPK活性的变化情况看,运动后即刻,AMPK活 性最大,此时mTOR磷酸化水平最低,而运动后6 h,随着AMPK活性的恢复,mTOR磷酸化水平 达到峰值,表明运动后mTOR及下游信号分子的激活与AMPK有关。但运动后1 h,mTOR、4E-BP1和S6K1信号磷酸化开始增加,而此时AMPK活性仍显著高于安静水平,这似乎令人费解。本 课 题组对此的理解是,AMPK并非控制mTOR信号通路的唯一机制,运动时可能还有其他机制同时 被激活,如MEK/ERK/P90RSK信号通路,该通路和AMPK的作用相反,能促进蛋白合成,运动中 AMPK的作用占优势。运动后一定时间尽管AMPK仍维持激活状态,但随着其活性的下降,其他 激活mTOR通路的机制可能开始占据优势,从而无视AMPK对mTOR通路的抑制效应。所以,运动 后mTOR信号通路的激活可能部分与非AMPK依赖性机制的作用有关。
AMPK作用于mTOR信号通路的靶点存在争议。
首先,AMPK是否能使mTOR去磷酸化而降低其活性?一些研究认为,AMPK能直接或经mTOR的分 子伴侣raptor间接作用于mTOR而抑制其活性。1) 直接磷酸化mTOR Thr2446位点,这使得 另一位点Ser2448的磷酸化被抑制,而Ser2448位点是PKB信号的作用靶,其磷酸化是激活mTO R的最主要方式,所以,AMPK磷酸化mTOR Thr2446位点后,通过抑制PKB介导的Ser2448位点 的磷酸化而间接抑制mTOR的活性[10];2) 通过影响mTOR的分子伴侣raptor而调 节其活性 。从本研究结果来看,无论是AICAR注射还是跑台运动都导致了mTOR 在Ser2448位点的去磷 酸化,似能同意AMPK直接或通过PKB间接抑制mTOR的观点。
其次,AMPK是否能去磷酸化4E-BP1和S6K1?目前存在三种不同的看法:1) AMPK对S6K1和4 E-BP1的磷酸化水平均有作用。有研究发现,使用AICAR诱导AMPK激活后能使raptor-mTOR络 合物变成关闭的、活性下降的形式,导致其磷酸化下游靶4E-BP1和S6K1的能力下降,从而抑 制mTOR信号通路[9];2)4E-BP1是AMPK的主要作用靶。Hans等的研究发现,人体 一次性抗 阻运动后即刻AMPK活性升高并持续至1 h,蛋白合成速度明显下降,运动后1～2 h开始升高 。 同时,运动后即刻4E-BP1磷酸化下降,1～2 h开始升高,而TSC2、PKB、mTOR、eEF2均无显 著 变化,因此认为AMPK主要通过对4E-BP1的去磷酸化而抑制蛋白合成[2]。David等的 研究亦得 到类似结果[11];3) S6K1是AMPK的主要作用靶。Gustavo等发现,一次高频电击 使大鼠胫 骨前肌S6K1磷酸化水平在刺激后3 h显著增加并持续至6 h,并且AICAR能以剂量和时间依赖 方式抑制HCE-T细胞S6K1活性[12]。本实验结果支持4E-BP1是AMPK的主要作用靶点 的观点,因为无论是AICAR注射还是跑台运动均未发生骨骼肌S6K1的去磷酸化。
另外,AMPK是否能控制mTOR的上游信号?虽然本研究未涉及上游指标,但从文献报道可以得 出一些认识。有研究表明,AMPK在两个位点(Thr1227 和Ser1345)直接磷酸化并激活TSC2 ,通过使这两个位点突变证明磷酸化事件增加了TSC复合体抑制mTOR通路的能力[13]。人们 认为TSC2抑制mTOR的活性的分子机制可能涉及小GTP酶Rheb。不过,部分研究不支持AMPK对T SC2的调节作用[2,11]。AMPK是否能影响mTOR的另两种上游信号PI3K和PKB亦存在 争议。有 研究发现在C2C12肌管中使用AICAR导致IRS-1在Ser789位点磷酸化增加,而该位点的磷酸化 导致与IRS-1相关的PI3K活性下降[14]。另一在体研究发现AICAR使骨骼肌PKB在Ser473位点 磷酸化水平下降[15],然而,在培养的HCE-T细胞中,使用AICAR未见到这种影响[16], Cheng等发现AICAR不能通过PKB介导mTOR信号通路功能[17]。
本研究结果表明,AICAR和运动无论是对AMPK的激活,还是对蛋白合成的抑制,都表现出较 好的相似性。大量的运动(包括抗阻、电击和跑台运动的人体和动物模型)研究表明,抗阻 或剧烈耐力运动中,蛋白合成被抑制,运动后恢复期这种抑制被解除,随后进入恢复性增加 阶段,恢复过程可能持续到运动后24～48 h[11]。所以,运动对骨骼肌蛋白合成的 影响是 运动中的抑制和运动后恢复性增加两过程的中和。本实验对AICAR注射效果的研究表明,mTO R及下游信号4E-BP1被短暂抑制,随后磷酸化水平增加,这和运动组的观察结果是一致的。 不过,AICAR注射未能影响S6K1的磷酸化水平,而运动后即刻、1 h和6 h均见S6K1磷酸化水 平增加,尚不能解释造成这种不一致的原因,但至少再次表明AICAR并不能完全模拟运动效 应。
总的来看,目前对AMPK与mTOR信号通路关系的研究主要集中在mTOR及下游信号上,多数学者 同意AMPK能通过磷酸化事件调节mTOR和4E-BP1分子活性,当然,这种影响可能是直接也可能 是间接的。S6K1也可能是AMPK的另一作用靶,但本研究和部分报道未支持这一观点。AMPK与 mTOR信号通路上游分子PI3K、PKB、TSC1/2等的关系的研究材料目前还不丰富,且结论也不 一致,这是本研究领域的今后需要加强的方向。由于AMPK的激活及对mTOR信号通路的作用在 不同肌纤维类型(如快慢肌)、不同运动方式(如力量与耐力)、不同研究对象(如人和啮 齿动物)及不同研究方法(如在体和离体)中并不相同,这可能是导致一些研究结论不一致 的部分原因。
4 结 论
1) 一次性剧烈运动或AICAR注射均能激活骨骼肌AMPK,并导致蛋白合成的暂时抑制,其机 制与AMPK下调mTOR Ser2448及其下游信号4E-BP1 Thr37/46的磷酸化水平有关,但未发现S6K1 Thr389磷酸化水平的下调;
2) 一次性剧烈运动后1h或AICAR注射后2 h,骨骼肌蛋白合成加速,6 h时达峰值,其机制与 mTOR Ser2448、4E-BP1 Thr37/46和S6K1 Thr389磷酸化水平升高相关,但AICAR和运动对S6K1 Thr389磷酸化水平的影响存在差异。
3) 一次性剧烈运动或AICAR注射后1～6 h,AMPK信号的下调与mTOR信号通路的上调时程基本 一致,但不完全同步,表明运动后蛋白合成的恢复与AMPK信号的下调有关,但也可能部分涉 及其他激活mTOR的机制。
参考文献:
[1] Bolster DR, Crozier SJ, Kimball SR & Jefferson LS. AMP-activatedp rotein kinase suppresses protein synthesis in rat skeletal muscle through down-r egulated mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling. J Biol Chem,2002,277 (27):23977-23980.
[2] Hans C. Dreyer, Satoshi Fujita, Jerson G. Cadenas, et al. Resistance ex ercis e increases AMPK activity and reduces4E-BP1 phosphorylation and protein synthes is in human skeletal muscle. Physiology in Press, published online on July27, 2006.
[3] Asumthia S. Jeyapalan, Renan A. Orellana, Agus Suryawan,et al. Glucosestimu lates protein synthesis in skeletal muscle of neonatal pigs through an AMPK- andmTOR-independent process.Am J Physiol Endocrinol Metab,2007,293(8):595-603.
[4] Shin Terada, Masahide Goto, Miyuki Kato, et al. Effects of low-intensitypro longed exercise on PGC-1 mRNA expression in rat epitrochlearis muscle. Biochemi cal and Biophysical Research Communications,2002,296(2):350-354.
[5] Wim Derave, Hua Ai, Jacob Ihlemann,et al. Dissociation of AMP-Activated P rot ein Kinase Activation and Glucose Transport in Contracting Slow-Twitch Muscle.Diabetes,2000,49(8):1281-1287.
[6] Merrill GF, Kurth EJ, Hardie DG, Winder WW. AICA riboside increases AMP-a cti vated protein kinase, fatty acid oxidation, and glucose uptake in rat muscle. A m J Physiol,1997,273:1107-1112.
[7] Li Zhang, Markus Frederich, Huamei He, et al.Relationship between5-amino imi dazole-4-carboxamide-ribotide and AMP-activated protein kinase activity in the p erfused mouse heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,290(3):1235-1243.
[8] Annelies Beckers, Sophie Organe, Leen Timmermans, et al.Methotrexate enha nce s the antianabolic and antiproliferative effects of5-aminoimidazole-4-carboxami de riboside. Mol. Cancer Ther,2006,5(9):2211-2217.
[9] David L. Williamson, Douglas R. Bolster, Scot R. Kimball. Time coursechange s in signaling pathways and protein synthesis in C2C12 myotubes following AMPK a ctivation by AICAR. Am J Physiol Endocrinol Metab,2006,291(1):80-89.
[10] Chiang GG & Abraham RT. Phosphorylation of mammalian target of rapamycin(m TOR) at Ser-2448 is mediated by p70S6 kinase. J Biol Chem,2005,280(27):25485-25490.
[11] David L. Williamson, Neil Kubica, Scot R. Kimball,et al. Exercise-indu ced a lterations in extracellular signal-regulated kinase1/2 and mammalian target ofrapamycin (mTOR) signalling to regulatory mechanisms of mRNA translation in mous e muscle. J Physiol,2006,573(2):497-510.
[12] Gustavo. Nader and Karyna. Esser. Intracellular signaling specificityin sk eletal muscle in response to different modes of exercise. J Appl Physiol,2001,90:1936-1942.
[13] Inoki K, Zhu T, and Guan KL. TSC2 mediates cellular energy response to c ontrol cell growth and survival. Cell,2003,115(5):577-590.
[14] Jakobsen SN, Hardie DG, Morrice N, and Tornqvist HE.5′-AMPactivated pr ote in kinase phosphorylates IRS-1 on Ser-789 in mouse C2C12 myotubes in response to 5-aminoimidazole-4-carboxamide riboside. J Biol Chem,2001,276(50):46912-46916 .
[15] Winder WW and Hardie DG. Inactivation of acetyl-CoA carboxylase and acti vat ion of AMP-activated protein kinase in muscle during exercise. Am J Physiol End ocrinol Metab,1996,270:299-304.
[16] Kimura N, Tokunaga C, Dalal S, et al. A possible linkage between AMP-act iva ted protein kinase (AMPK) and mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pat hway. Genes Cells,2003,8(1):65-79.
[17] Cheng SW, Fryer LG, Carling D & Shepherd PR. Thr2446 is a novel mammalia n t arget of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. JBiol Chem,2004,279(16):15719-15722.