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摘 要：香蕉枯萎病發生普遍，危害巨大，选择合理的轮作作物对该病防控意义重大。本研究在25个蔬菜品种接种香蕉枯萎病菌4号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense， Foc 4）后，调查Foc 4对不同种蔬菜的致病性，测定不同时期蔬菜根际土壤中香蕉枯萎病菌的数量;通过菌丝生长速率法和孢子萌发法，测定不同蔬菜根系的水浸提液对Foc 4菌丝生长和孢子萌发的抑制作用，筛选适合与香蕉轮作的蔬菜品种，探索轮作防病的机理。结果表明，所调查的25个蔬菜品种在接种Foc 4后根系发育正常，长势良好。除甘蓝和冬瓜外，其余23个蔬菜品种对Foc 4都没有富集作用。种植大多数蔬菜后，土壤中的尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）数量呈不同程度的下降趋势，尤其是蒜、香葱、韭菜、香芹、芫茜的根际土壤带菌量大大低于对照土样的带菌量，其次是南瓜、苦瓜、茄子、辣椒、菜豆、萝卜等蔬菜。研究9种蔬菜根系水浸提液对Foc 4生长的影响表明：9种蔬菜根系水浸提液对Foc 4菌丝生长和孢子萌发有不同程度的抑制作用，但浸提液对病菌菌丝生长的抑制效果并不因处理时间的延长而增加。第6天测定时显示，不同蔬菜根系水浸提液对病原菌生长抑制的作用表现为：韭菜>香葱>香芹>大肉西蒜>芫茜>南瓜>朝天椒>苦瓜;当测定时间为16 h时，蔬菜根系水浸提液对孢子萌发的抑制效果表现为：韭菜>香葱>香芹>芫茜>朝天椒>南瓜>苦瓜>大肉西蒜>紫长茄。9种蔬菜中，韭菜根系水浸提液对病菌的抑制效果最好，其抑制率、敏感度都明显优于其他蔬菜;香葱根系分泌物表现出良好的抑菌作用，仅次于韭菜;香芹及芫茜也具有一定的抑菌效果。本试验为筛选适合与香蕉轮作的蔬菜品种提供了依据。
关键词：香蕉枯萎病;防控;轮作;蔬菜品种;筛选
中图分类号：S436.67 文献标识码：A
Preliminary Screening of Vegetable Varieties Suitable for Rotation to Prevent and Control Banana Fusarium Wilt
ZENG Lisha， WANG Fang， ZHOU Haiqi， LYU Shun*， LIU Wenqing， CUI Guangjuan， FAN Zhenyi，
LIU Liqin， ZHANG Keheng
Dongguan Banana and Vegetable Institute， Dongguan， Guangdong 523061， China
Abstract： Fusarium wilt of banana is widely spreaded and extremely harmful. The selection of suitable rotation crop was of great significance to the prevention and control of this disease. In this paper， 25 vegetable varieties were inoculated with the pathogen of banana Fusarium wilt （Fusarium oxysporum f. sp. cubense， Foc 4） to investigate the pathogenicity of Foc 4 to different kinds of vegetables， and the number of Foc 4 in vegetable rhizosphere soil was measured at different periods. In addition， through the method of mycelium growth rate and spore germination， the inhibition effects of 9 different vegetable root water extracts on the mycelium growth and spore germination of Foc 4 was measured. The vegetable varieties suitable for rotation to prevent and control banana Fusarium wilt were selected， and the mechanism of this rotation was explored. The results showed that none of the 25 vegetable varieties were infected by Foc 4， the root system of the vegetables developed normally and grew well. 23 vegetable varieties had no enrichment effect on Foc 4 except cabbage and wax gourd. The number of Foc 4 in the soil decreased after planting most of vegetables， especially in the soil of garlic， onion， leek， parsley and coriander， which was much lower than that of the control soil， followed by pumpkin， bitter melon， eggplant， pepper， string bean and radish， etc. Antifungal experiment showed that 9 vegetables root extracts had inhibitory effects on the growth of mycelia and spore germination of Foc 4， but the inhibitory effects didn’t increase with the extension of treatment time. On the 6th day， the inhibitory effect of different vegetable roots on the growth of pathogen was as follows： Chinese chives>chives>chinese celery>western garlic>coriander>pumpkin>pod pepper>bitter melon. When the treatment time was 16 h， the inhibition effect on spore germination was shown as follows： Chinese chives>chives>chinese celery>coriander>pod pepper>pumpkin>bitter melon>western garlic>purple eggplant. Among the 9 plants， Chinese chives root extract had the best inhibition effect on Foc 4， and the second was chives. Chinese celery and coriander were also effective in fungi inhibition. This paper would provide a reference for selecting vegetable varieties suitable for banana rotation. Keywords： fusarium wilt of banana; prevent and control; rotation; vegetable varieties; screening
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.024
香蕉枯萎病是由尖孢镰孢菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense， Foc）引起的土传性维管束病害。目前枯萎病已成为危害最大的香蕉病害之一，其所到之处，大片蕉园被毁灭，严重阻碍了香蕉产业的健康稳定发展[1-3]。大量实践表明，长期连作会显著提高香蕉枯萎病的发病率;导致这种现象的原因比较复杂，如土壤养分含量的减少、土壤理化性状的恶化、土壤微生态环境的变化和植株自身分泌毒害物质的影响等[4]。
研究表明，轮作能有效减少土传病害的发生，是防控香蕉枯萎病较为有效的方法之一，选择合理的轮作作物及轮作模式对于香蕉枯萎病的防控有重要意义。据报道，香蕉与甘蔗[5]、香蕉与水稻[6]轮作技术的采用使香蕉枯萎病得到了有效抑制;许多葱蒜类蔬菜的根系分泌物对多种植物致病菌具有较强的抑制作用，大田生产中常被用于间作或轮作[7]。相关研究表明，韭菜、香葱等葱蒜类蔬菜是瓜类蔬菜很好的轮作前茬，可较大程度地减轻瓜类枯萎病的发生[8]。韭菜与香蕉轮作可以显著降低香蕉枯萎病的发病率[9]。
蔬菜品种众多，生长周期短，合理开展轮作，可促进土壤肥力恢复与改良，减轻病虫发生，改善产品品质及产量。研究表明，实行稻菜轮作、果菜轮作、水旱轮作，对土传病害控制效果显著，而种植南瓜、甜玉米能中和土壤酸度，改良土壤pH，抑制真菌性病害[10-11]。本研究通过调查香蕉枯萎病菌4号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense， Foc 4）对不同种蔬菜的致病性，测定不同蔬菜品种对Foc 4的富集作用，及不同蔬菜根系分泌物對Foc 4生长的抑制作用，初步筛选适合与香蕉轮作的蔬菜品种，探索菜-蕉轮作的防病机理。
1 材料与方法
1.1 材料
供试的菌株为香蕉枯萎病菌4号生理小种（F. oxysporum f. sp. cubense，Foc 4），由东莞市香蕉蔬菜研究所分离保存;供试的25个蔬菜品种为：瓜类（‘蜜本3号南瓜’‘粤农节瓜’‘清远杂交大冬瓜’‘粤秀三号青瓜’‘瑞新金帅青瓜’‘粤优大肉丝瓜’‘佳庆668丝瓜’‘碧绿三号苦瓜’‘绿富油绿苦瓜’）、茄果类（‘绿宝大肉青长茄’‘农丰三号紫长茄’‘皇冠666番茄’‘新星101番茄’‘粤蔬2号尖椒’‘艳红朝天椒’）、豆类（‘双青12号玉豆’）、葱蒜类（‘美国加州大肉西蒜’‘四季香葱’‘791韭菜’）、玉米类（‘甜糯水果玉米’）、根菜类（‘白沙南畔州萝卜’）、甘兰类（‘宝石绿甘蓝’）、白菜类（‘翠绿80天菜心’）、绿叶类（‘黄心白骨香芹’‘泰国抗热芫茜’），种子购买于市场。
1.2 方法
1.2.1 植物种植及样品的采集 所有试验植物均栽种在东莞市麻涌镇大步村东莞市香蕉蔬菜研究所实验基地，定植时间为2015年10月，种植前对试验田块进行了为期2个月左右的泡水，并采用氯溴异氰尿酸进行全田消毒。其中瓜类、茄果类及玉米采用育苗后移栽的种植方式，其他蔬菜均采用直播种植，每个实验小区种植每种植物（蔬菜和香蕉）30株，3个重复小区。采用常规方法进行栽培管理。待栽种的植物生长10 d后，开始浇灌浓度为1×106 CFU/mL的Foc 4的孢子悬浮液，每株菜苗浇灌20 mL。设置浇灌枯萎病菌孢子悬浮液并种植香蕉（‘巴西蕉’）的小区为阳性对照，以同样浇灌菌液但不种任何作物的小区为空白对照。
每隔3 d浇灌Foc 4孢子悬浮液1次，连续浇灌菌液3次，再间隔3 d后开始采集植物（蔬菜和香蕉）根际土壤样品，第1次采样记为0 d，以后每隔10 d收集1次根际土壤保存备用，并且观察蔬菜是否出现黄叶、萎蔫、根茎维管束褐化等发病症状。采集时随机抽取5株菜苗，小心铲去根表面5 cm的表土，收集附着在根系上的土壤作为根际土壤，并将相同蔬菜品种的土样混合均匀，依四分法保留30～50 g土样，无菌袋收集，于0～4 ℃冷藏。采集同等深度但未种作物的土壤（已施菌液）作为空白对照。
1.2.2 蔬菜根际土中香蕉枯萎病菌数的统计 参考李鹏等[12]的方法，采用香蕉枯萎病菌检测专用的Komada改良培养基结合显微镜检进行平板计数[13-14]，利用平板梯度稀释法测定每种植物单位重量根际土壤中尖孢镰孢菌（F. oxysporum）的平均菌落数。
1.2.3 不同蔬菜根系水浸提液对Foc 4的抑制作用 从25个蔬菜品种中选取对Foc 4没有富集作用，且Foc 4在其根系定殖数量较少的9种蔬菜，研究其根系水浸提液对病原菌的抑制作用。
1.2.4 蔬菜根系水浸提液的制备 待栽种的蔬菜定植49 d后，挖取并收集各蔬菜根系。先将各蔬菜根鲜样置于阴凉干燥处自然阴干，然后将各种蔬菜干根与无菌水（浸提剂）以1 g/5 mL的比例浸提，浸提时间为48 h（用无菌水振荡浸提48 h），过滤后作为母液，置于4 ℃冰箱中待用[15]。
1.2.5 菌丝生长抑制率测定 菌丝生长抑制率测定采用生长速率法[16]。按1∶9的比例分别将各蔬菜干根的水浸提液的母液与PDA培养基混合摇匀，倒进直径为9 cm的培养皿中，以加入1 mL无菌水的PDA培养基为对照（CK）。在无菌条件下，用直径9 mm打孔器在Foc 4菌落平板上打制菌饼，并接到含各蔬菜干根浸提液的培养基中央，在28 ℃条件下培养，采用十字交叉法测量菌落生长直径并计算抑菌率，抑菌率= [1- （处理皿菌落直径-菌块直径）/（对照皿菌落直径-菌块直径）]×100%。 1.2.6 孢子萌发抑制率的测定 孢子萌发抑制率参考杨江舟等[16]的方法，采用凹玻片孢子萌发法进行测定，并计算出孢子萌发率和抑制率[17]。
1.3 数据处理
利用SPSS 23.0软件对数据进行方差分析和显著性差异分析。
2 结果与分析
2.1 Foc 4对不同蔬菜的致病性
对浇灌Foc 4后的25个蔬菜品种进行长势及发病情况调查。结果表明，所调查的25个蔬菜品种都未出现黄叶、萎蔫、根茎维管束褐化等典型的枯萎病症状，接种过Foc 4的蔬菜根系发育正常，长势良好（表1）。
2.2 香蕉枯萎病菌在不同蔬菜根际土壤中的数量变化
在开始观察的0～10 d，所测定的25个蔬菜品种根际带菌量都呈明显下降趋势，10 d之后，除‘宝石绿甘蓝’外，其他24个蔬菜品种的根际土壤中病原菌的含量都低于CK及‘巴西蕉’的根际土壤。不同蔬菜品种的根际土壤中香蕉枯萎病菌含量顯著下降，其中，蒜、香葱、韭菜及香芹、芫茜等绿叶类蔬菜最明显;其次是南瓜、苦瓜、茄子、辣椒及菜豆、萝卜等蔬菜。当蔬菜定殖第30天时，蒜的根际带菌量下降为200 CFU/g;香葱的根际带菌量下降为300 CFU/g;芫茜的根际带菌量为300 CFU/g;韭菜的根际病原菌菌落仅为100 CFU/g（表1），但有1个冬瓜品种（‘清远杂交大冬瓜’）及1个甘蓝品种（‘宝石绿甘蓝’）在定殖第30天时，其根际土壤的枯萎病菌含量仍达到12 000 CFU/g以上，这表明甘蓝根际可能对香蕉枯萎病菌没有抑制作用，冬瓜根际还可能对枯萎病菌有一定富集作用。
2.3 9种蔬菜根系水浸提液对Foc 4菌丝生长的影响
9种蔬菜根系水浸提液对Foc 4的抑制作用结果显示，除紫长茄外，其他蔬菜的根系水浸提液对Foc 4菌丝生长都有不同程度的抑制作用（表2）。第3天时测定结果显示，不同蔬菜根系对病原菌生长抑制的作用表现为：韭菜>香葱>芫茜=香芹>朝天椒>大肉西蒜=南瓜>苦瓜（表2，图1）。其中韭菜对病原菌生长的抑制作用最强，抑菌率达37.14%，但其水浸提液对Foc 4菌丝生长的抑制效果并不因处理时间的延长而增加，反而随着处理时间的延长各蔬菜根系水浸提液的抑菌效果呈现一定的下降趋势，分析其原因，可能与单个菌丝细胞所接受的根系水浸提液剂量有关。第6天时测定结果显示，不同蔬菜根系对病原菌生长抑制的作用表现为：韭菜>香葱>香芹>大肉西蒜>芫茜>南瓜>朝天椒>苦瓜（表2）。
2.4 9种蔬菜根系水浸提液对Foc 4孢子萌发的抑制作用
由表3、图2可见，在测试的各阶段，不同蔬菜干根水浸提液对Foc 4孢子萌发都有一定的抑制效果，并且随着测试时间的延长，大部分蔬菜品种干根水浸提液对病菌孢子萌发的抑制率提高。当测定时间为16 h时，不同蔬菜根系水浸提液对Foc 4孢子萌发的抑制效果表现为：韭菜>香葱>香芹>芫茜>朝天椒>南瓜>苦瓜>大肉西蒜>紫长茄。说明韭菜、香葱、香芹、芫茜等葱蒜类及绿叶蔬菜对Foc 4孢子萌发具有较好的抑制效果。
3 讨论
香蕉枯萎病是香蕉生产中重点防治的土传病害，也是香蕉连作的主要障碍，因此抑制镰孢菌的繁殖，降低枯萎病的发病率是判断克服连作障碍效果的重要指标。轮作种植是我国传统农业的精华，对持续控制枯萎病等土传病害和克服连作障碍有显著的作用。大量试验证明，轮作可以协调不同作物对养分需求的差异，提高土壤中养分的利用率[18-19]，改良根际微生物群落结构[20-21]，减少土传病害的发生[22-23]。过去的研究已发现香蕉与甘蔗（Saccharum officinarum）[5]、水稻（Oryza sativa）[6]、辣椒（Capsicum annuum）[24]、木薯（Mani?hot esculenta）[25]、玉米（Zea mays）[22]、菠萝（Ananas comosus）[22]、韭菜（Allium tuberosum）[9]轮作，均能不同程度降低后茬香蕉枯萎病的发病率，促进香蕉生长，其中尤以韭菜轮作效果最佳，后茬发病率仅为0.1%[26]。
本研究以农田常见的蔬菜品种为对象，通过测定不同蔬菜品种对香蕉枯萎病菌的富集作用，以及不同蔬菜根系分泌物对Foc 4菌丝生长及孢子萌发的影响，筛选适合与香蕉轮作的蔬菜品种。结果表明，所调查的25个蔬菜品种在接种Foc 4后均未出现典型的枯萎病症状，其根系发育正常，长势良好，符合香蕉枯萎病病原菌的寄主专化性。除甘蓝和冬瓜外，其他23个蔬菜品种对尖孢镰孢菌（F. oxysporum）都没有富集作用。轮作后，不同蔬菜品种根际土壤中的尖孢镰孢菌（F. oxys?p?o?rum）数量都呈不同程度的下降趋势，尤其是韭菜、大蒜、香葱、香芹、南瓜、苦瓜、茄子及辣椒等的根际土壤带菌量显著低于对照。表明，某些蔬菜品种具有降低土壤中病原镰孢菌数量的作用，由于大部分蔬菜品种都是香蕉枯萎病菌的非敏感寄主，因此在与香蕉轮作或间作时既能减少香蕉地的枯萎病菌数量，也不影响其自身的生长。另外，本试验是田间小区试验，虽然种植前对试验田块进行了消毒处理，但是由于试验周期比较长，土壤中微生物种类仍然较多而复杂，采用Komada选择培养基结合镜检进行计数，可以大致评估土壤中病原尖孢镰孢菌（F. oxysporum）的数量，从而初步筛选富集或抑制尖孢镰孢菌（F. oxyspor?u?m）的蔬菜品种，接下来还需结合qPCR等分子生物手段对土壤的Foc 4数量进行精确定量及验证。
本研究结果表明，不同蔬菜根系水浸提液对Foc 4生长具有不同程度的影响，韭菜根系水浸提液对病菌的抑制效果最好，其次是香葱和香芹，其抑制率、敏感度都明显优于其他品种。根据已有的报道，韭菜提取物能够显著抑制尖孢镰孢菌菌丝生长和孢子萌发，并使其形态发生畸变[9， 27];西芹鲜根浸提液处理后黄瓜枯萎病菌菌体中的 SOD、POD、CAT酶活性均受到抑制[28];葱茎的石油醚提取液对香蕉枯萎病菌的抑制效果最明显[29]，与本研究结果相一致。说明这些刺激性的蔬菜可能通过根系分泌抑菌物质来抑制香蕉枯萎病原菌的生长。而非刺激性蔬菜，如本研究中的南瓜、苦瓜、茄子、辣椒等瓜果类蔬菜，及菜豆、萝卜等蔬菜品种，虽然它们根系的水浸提物抑菌的作用较弱或不明，但是在接菌30 d时，其根际土壤带菌量也显著低于对照。相似的是，王贝贝等[22]在对甘蔗、辣椒、玉米、菠萝与香蕉的轮作研究中发现，这些作物的根系分泌物对尖孢镰孢菌并无显著抑制作用，但能促进后茬土壤拮抗菌的生长，如辣椒轮作能有效提高土壤中芽孢杆菌科（Bacillaceae）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）和鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）细菌丰度[25]。菠萝轮作显著促进土壤中浮霉状菌属（Plancto?myces）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、伯克氏菌属（Burkholderia）等细菌显著增加，这些拮抗菌的增加改善了土壤环境，间接抑制病原的生长[20]。曾莉莎等[5]在探讨香蕉-甘蔗轮作模式影响后茬香蕉枯萎病发病率的可能机制时，也发现土壤中假单胞菌目（Pseudomonadales）、浮霉菌目（Planctomycetales）、酸微菌目（Acidimicrobiales）和土壤红杆菌目（Solirubrobacterales）的细菌丰度呈随甘蔗种植年限增加而逐年增加的趋势，与香蕉枯萎病发病率呈显著负相关关系;酸杆菌目（Acidobacteriales）、红螺菌目（Rhodospirillales）和军团菌目（Legionellales）的细菌丰度则呈随甘蔗种植年限逐年降低趋势，与香蕉枯萎病发病率呈显著正相关。说明除了直接分泌抑菌物质外，某些蔬菜品种还可能通过增加土壤拮抗菌，改良土壤微生物群落结构，从而影响尖孢镰孢菌的生存环境，达到降低蕉地香蕉枯萎病原菌的目的。而在本研究中关于轮作苦瓜、茄子、辣椒、菜豆、萝卜等蔬菜品种对后茬香蕉枯萎病发病率的影响及其具体的作用机制还需要进一步试验。 参考文献
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责任编辑：沈德发
关键词：香蕉枯萎病;防控;轮作;蔬菜品种;筛选
中图分类号：S436.67 文献标识码：A
Preliminary Screening of Vegetable Varieties Suitable for Rotation to Prevent and Control Banana Fusarium Wilt
ZENG Lisha， WANG Fang， ZHOU Haiqi， LYU Shun*， LIU Wenqing， CUI Guangjuan， FAN Zhenyi，
LIU Liqin， ZHANG Keheng
Dongguan Banana and Vegetable Institute， Dongguan， Guangdong 523061， China
Abstract： Fusarium wilt of banana is widely spreaded and extremely harmful. The selection of suitable rotation crop was of great significance to the prevention and control of this disease. In this paper， 25 vegetable varieties were inoculated with the pathogen of banana Fusarium wilt （Fusarium oxysporum f. sp. cubense， Foc 4） to investigate the pathogenicity of Foc 4 to different kinds of vegetables， and the number of Foc 4 in vegetable rhizosphere soil was measured at different periods. In addition， through the method of mycelium growth rate and spore germination， the inhibition effects of 9 different vegetable root water extracts on the mycelium growth and spore germination of Foc 4 was measured. The vegetable varieties suitable for rotation to prevent and control banana Fusarium wilt were selected， and the mechanism of this rotation was explored. The results showed that none of the 25 vegetable varieties were infected by Foc 4， the root system of the vegetables developed normally and grew well. 23 vegetable varieties had no enrichment effect on Foc 4 except cabbage and wax gourd. The number of Foc 4 in the soil decreased after planting most of vegetables， especially in the soil of garlic， onion， leek， parsley and coriander， which was much lower than that of the control soil， followed by pumpkin， bitter melon， eggplant， pepper， string bean and radish， etc. Antifungal experiment showed that 9 vegetables root extracts had inhibitory effects on the growth of mycelia and spore germination of Foc 4， but the inhibitory effects didn’t increase with the extension of treatment time. On the 6th day， the inhibitory effect of different vegetable roots on the growth of pathogen was as follows： Chinese chives>chives>chinese celery>western garlic>coriander>pumpkin>pod pepper>bitter melon. When the treatment time was 16 h， the inhibition effect on spore germination was shown as follows： Chinese chives>chives>chinese celery>coriander>pod pepper>pumpkin>bitter melon>western garlic>purple eggplant. Among the 9 plants， Chinese chives root extract had the best inhibition effect on Foc 4， and the second was chives. Chinese celery and coriander were also effective in fungi inhibition. This paper would provide a reference for selecting vegetable varieties suitable for banana rotation. Keywords： fusarium wilt of banana; prevent and control; rotation; vegetable varieties; screening
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.024
香蕉枯萎病是由尖孢镰孢菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense， Foc）引起的土传性维管束病害。目前枯萎病已成为危害最大的香蕉病害之一，其所到之处，大片蕉园被毁灭，严重阻碍了香蕉产业的健康稳定发展[1-3]。大量实践表明，长期连作会显著提高香蕉枯萎病的发病率;导致这种现象的原因比较复杂，如土壤养分含量的减少、土壤理化性状的恶化、土壤微生态环境的变化和植株自身分泌毒害物质的影响等[4]。
研究表明，轮作能有效减少土传病害的发生，是防控香蕉枯萎病较为有效的方法之一，选择合理的轮作作物及轮作模式对于香蕉枯萎病的防控有重要意义。据报道，香蕉与甘蔗[5]、香蕉与水稻[6]轮作技术的采用使香蕉枯萎病得到了有效抑制;许多葱蒜类蔬菜的根系分泌物对多种植物致病菌具有较强的抑制作用，大田生产中常被用于间作或轮作[7]。相关研究表明，韭菜、香葱等葱蒜类蔬菜是瓜类蔬菜很好的轮作前茬，可较大程度地减轻瓜类枯萎病的发生[8]。韭菜与香蕉轮作可以显著降低香蕉枯萎病的发病率[9]。
蔬菜品种众多，生长周期短，合理开展轮作，可促进土壤肥力恢复与改良，减轻病虫发生，改善产品品质及产量。研究表明，实行稻菜轮作、果菜轮作、水旱轮作，对土传病害控制效果显著，而种植南瓜、甜玉米能中和土壤酸度，改良土壤pH，抑制真菌性病害[10-11]。本研究通过调查香蕉枯萎病菌4号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense， Foc 4）对不同种蔬菜的致病性，测定不同蔬菜品种对Foc 4的富集作用，及不同蔬菜根系分泌物對Foc 4生长的抑制作用，初步筛选适合与香蕉轮作的蔬菜品种，探索菜-蕉轮作的防病机理。
1 材料与方法
1.1 材料
供试的菌株为香蕉枯萎病菌4号生理小种（F. oxysporum f. sp. cubense，Foc 4），由东莞市香蕉蔬菜研究所分离保存;供试的25个蔬菜品种为：瓜类（‘蜜本3号南瓜’‘粤农节瓜’‘清远杂交大冬瓜’‘粤秀三号青瓜’‘瑞新金帅青瓜’‘粤优大肉丝瓜’‘佳庆668丝瓜’‘碧绿三号苦瓜’‘绿富油绿苦瓜’）、茄果类（‘绿宝大肉青长茄’‘农丰三号紫长茄’‘皇冠666番茄’‘新星101番茄’‘粤蔬2号尖椒’‘艳红朝天椒’）、豆类（‘双青12号玉豆’）、葱蒜类（‘美国加州大肉西蒜’‘四季香葱’‘791韭菜’）、玉米类（‘甜糯水果玉米’）、根菜类（‘白沙南畔州萝卜’）、甘兰类（‘宝石绿甘蓝’）、白菜类（‘翠绿80天菜心’）、绿叶类（‘黄心白骨香芹’‘泰国抗热芫茜’），种子购买于市场。
1.2 方法
1.2.1 植物种植及样品的采集 所有试验植物均栽种在东莞市麻涌镇大步村东莞市香蕉蔬菜研究所实验基地，定植时间为2015年10月，种植前对试验田块进行了为期2个月左右的泡水，并采用氯溴异氰尿酸进行全田消毒。其中瓜类、茄果类及玉米采用育苗后移栽的种植方式，其他蔬菜均采用直播种植，每个实验小区种植每种植物（蔬菜和香蕉）30株，3个重复小区。采用常规方法进行栽培管理。待栽种的植物生长10 d后，开始浇灌浓度为1×106 CFU/mL的Foc 4的孢子悬浮液，每株菜苗浇灌20 mL。设置浇灌枯萎病菌孢子悬浮液并种植香蕉（‘巴西蕉’）的小区为阳性对照，以同样浇灌菌液但不种任何作物的小区为空白对照。
每隔3 d浇灌Foc 4孢子悬浮液1次，连续浇灌菌液3次，再间隔3 d后开始采集植物（蔬菜和香蕉）根际土壤样品，第1次采样记为0 d，以后每隔10 d收集1次根际土壤保存备用，并且观察蔬菜是否出现黄叶、萎蔫、根茎维管束褐化等发病症状。采集时随机抽取5株菜苗，小心铲去根表面5 cm的表土，收集附着在根系上的土壤作为根际土壤，并将相同蔬菜品种的土样混合均匀，依四分法保留30～50 g土样，无菌袋收集，于0～4 ℃冷藏。采集同等深度但未种作物的土壤（已施菌液）作为空白对照。
1.2.2 蔬菜根际土中香蕉枯萎病菌数的统计 参考李鹏等[12]的方法，采用香蕉枯萎病菌检测专用的Komada改良培养基结合显微镜检进行平板计数[13-14]，利用平板梯度稀释法测定每种植物单位重量根际土壤中尖孢镰孢菌（F. oxysporum）的平均菌落数。
1.2.3 不同蔬菜根系水浸提液对Foc 4的抑制作用 从25个蔬菜品种中选取对Foc 4没有富集作用，且Foc 4在其根系定殖数量较少的9种蔬菜，研究其根系水浸提液对病原菌的抑制作用。
1.2.4 蔬菜根系水浸提液的制备 待栽种的蔬菜定植49 d后，挖取并收集各蔬菜根系。先将各蔬菜根鲜样置于阴凉干燥处自然阴干，然后将各种蔬菜干根与无菌水（浸提剂）以1 g/5 mL的比例浸提，浸提时间为48 h（用无菌水振荡浸提48 h），过滤后作为母液，置于4 ℃冰箱中待用[15]。
1.2.5 菌丝生长抑制率测定 菌丝生长抑制率测定采用生长速率法[16]。按1∶9的比例分别将各蔬菜干根的水浸提液的母液与PDA培养基混合摇匀，倒进直径为9 cm的培养皿中，以加入1 mL无菌水的PDA培养基为对照（CK）。在无菌条件下，用直径9 mm打孔器在Foc 4菌落平板上打制菌饼，并接到含各蔬菜干根浸提液的培养基中央，在28 ℃条件下培养，采用十字交叉法测量菌落生长直径并计算抑菌率，抑菌率= [1- （处理皿菌落直径-菌块直径）/（对照皿菌落直径-菌块直径）]×100%。 1.2.6 孢子萌发抑制率的测定 孢子萌发抑制率参考杨江舟等[16]的方法，采用凹玻片孢子萌发法进行测定，并计算出孢子萌发率和抑制率[17]。
1.3 数据处理
利用SPSS 23.0软件对数据进行方差分析和显著性差异分析。
2 结果与分析
2.1 Foc 4对不同蔬菜的致病性
对浇灌Foc 4后的25个蔬菜品种进行长势及发病情况调查。结果表明，所调查的25个蔬菜品种都未出现黄叶、萎蔫、根茎维管束褐化等典型的枯萎病症状，接种过Foc 4的蔬菜根系发育正常，长势良好（表1）。
2.2 香蕉枯萎病菌在不同蔬菜根际土壤中的数量变化
在开始观察的0～10 d，所测定的25个蔬菜品种根际带菌量都呈明显下降趋势，10 d之后，除‘宝石绿甘蓝’外，其他24个蔬菜品种的根际土壤中病原菌的含量都低于CK及‘巴西蕉’的根际土壤。不同蔬菜品种的根际土壤中香蕉枯萎病菌含量顯著下降，其中，蒜、香葱、韭菜及香芹、芫茜等绿叶类蔬菜最明显;其次是南瓜、苦瓜、茄子、辣椒及菜豆、萝卜等蔬菜。当蔬菜定殖第30天时，蒜的根际带菌量下降为200 CFU/g;香葱的根际带菌量下降为300 CFU/g;芫茜的根际带菌量为300 CFU/g;韭菜的根际病原菌菌落仅为100 CFU/g（表1），但有1个冬瓜品种（‘清远杂交大冬瓜’）及1个甘蓝品种（‘宝石绿甘蓝’）在定殖第30天时，其根际土壤的枯萎病菌含量仍达到12 000 CFU/g以上，这表明甘蓝根际可能对香蕉枯萎病菌没有抑制作用，冬瓜根际还可能对枯萎病菌有一定富集作用。
2.3 9种蔬菜根系水浸提液对Foc 4菌丝生长的影响
9种蔬菜根系水浸提液对Foc 4的抑制作用结果显示，除紫长茄外，其他蔬菜的根系水浸提液对Foc 4菌丝生长都有不同程度的抑制作用（表2）。第3天时测定结果显示，不同蔬菜根系对病原菌生长抑制的作用表现为：韭菜>香葱>芫茜=香芹>朝天椒>大肉西蒜=南瓜>苦瓜（表2，图1）。其中韭菜对病原菌生长的抑制作用最强，抑菌率达37.14%，但其水浸提液对Foc 4菌丝生长的抑制效果并不因处理时间的延长而增加，反而随着处理时间的延长各蔬菜根系水浸提液的抑菌效果呈现一定的下降趋势，分析其原因，可能与单个菌丝细胞所接受的根系水浸提液剂量有关。第6天时测定结果显示，不同蔬菜根系对病原菌生长抑制的作用表现为：韭菜>香葱>香芹>大肉西蒜>芫茜>南瓜>朝天椒>苦瓜（表2）。
2.4 9种蔬菜根系水浸提液对Foc 4孢子萌发的抑制作用
由表3、图2可见，在测试的各阶段，不同蔬菜干根水浸提液对Foc 4孢子萌发都有一定的抑制效果，并且随着测试时间的延长，大部分蔬菜品种干根水浸提液对病菌孢子萌发的抑制率提高。当测定时间为16 h时，不同蔬菜根系水浸提液对Foc 4孢子萌发的抑制效果表现为：韭菜>香葱>香芹>芫茜>朝天椒>南瓜>苦瓜>大肉西蒜>紫长茄。说明韭菜、香葱、香芹、芫茜等葱蒜类及绿叶蔬菜对Foc 4孢子萌发具有较好的抑制效果。
3 讨论
香蕉枯萎病是香蕉生产中重点防治的土传病害，也是香蕉连作的主要障碍，因此抑制镰孢菌的繁殖，降低枯萎病的发病率是判断克服连作障碍效果的重要指标。轮作种植是我国传统农业的精华，对持续控制枯萎病等土传病害和克服连作障碍有显著的作用。大量试验证明，轮作可以协调不同作物对养分需求的差异，提高土壤中养分的利用率[18-19]，改良根际微生物群落结构[20-21]，减少土传病害的发生[22-23]。过去的研究已发现香蕉与甘蔗（Saccharum officinarum）[5]、水稻（Oryza sativa）[6]、辣椒（Capsicum annuum）[24]、木薯（Mani?hot esculenta）[25]、玉米（Zea mays）[22]、菠萝（Ananas comosus）[22]、韭菜（Allium tuberosum）[9]轮作，均能不同程度降低后茬香蕉枯萎病的发病率，促进香蕉生长，其中尤以韭菜轮作效果最佳，后茬发病率仅为0.1%[26]。
本研究以农田常见的蔬菜品种为对象，通过测定不同蔬菜品种对香蕉枯萎病菌的富集作用，以及不同蔬菜根系分泌物对Foc 4菌丝生长及孢子萌发的影响，筛选适合与香蕉轮作的蔬菜品种。结果表明，所调查的25个蔬菜品种在接种Foc 4后均未出现典型的枯萎病症状，其根系发育正常，长势良好，符合香蕉枯萎病病原菌的寄主专化性。除甘蓝和冬瓜外，其他23个蔬菜品种对尖孢镰孢菌（F. oxysporum）都没有富集作用。轮作后，不同蔬菜品种根际土壤中的尖孢镰孢菌（F. oxys?p?o?rum）数量都呈不同程度的下降趋势，尤其是韭菜、大蒜、香葱、香芹、南瓜、苦瓜、茄子及辣椒等的根际土壤带菌量显著低于对照。表明，某些蔬菜品种具有降低土壤中病原镰孢菌数量的作用，由于大部分蔬菜品种都是香蕉枯萎病菌的非敏感寄主，因此在与香蕉轮作或间作时既能减少香蕉地的枯萎病菌数量，也不影响其自身的生长。另外，本试验是田间小区试验，虽然种植前对试验田块进行了消毒处理，但是由于试验周期比较长，土壤中微生物种类仍然较多而复杂，采用Komada选择培养基结合镜检进行计数，可以大致评估土壤中病原尖孢镰孢菌（F. oxysporum）的数量，从而初步筛选富集或抑制尖孢镰孢菌（F. oxyspor?u?m）的蔬菜品种，接下来还需结合qPCR等分子生物手段对土壤的Foc 4数量进行精确定量及验证。
本研究结果表明，不同蔬菜根系水浸提液对Foc 4生长具有不同程度的影响，韭菜根系水浸提液对病菌的抑制效果最好，其次是香葱和香芹，其抑制率、敏感度都明显优于其他品种。根据已有的报道，韭菜提取物能够显著抑制尖孢镰孢菌菌丝生长和孢子萌发，并使其形态发生畸变[9， 27];西芹鲜根浸提液处理后黄瓜枯萎病菌菌体中的 SOD、POD、CAT酶活性均受到抑制[28];葱茎的石油醚提取液对香蕉枯萎病菌的抑制效果最明显[29]，与本研究结果相一致。说明这些刺激性的蔬菜可能通过根系分泌抑菌物质来抑制香蕉枯萎病原菌的生长。而非刺激性蔬菜，如本研究中的南瓜、苦瓜、茄子、辣椒等瓜果类蔬菜，及菜豆、萝卜等蔬菜品种，虽然它们根系的水浸提物抑菌的作用较弱或不明，但是在接菌30 d时，其根际土壤带菌量也显著低于对照。相似的是，王贝贝等[22]在对甘蔗、辣椒、玉米、菠萝与香蕉的轮作研究中发现，这些作物的根系分泌物对尖孢镰孢菌并无显著抑制作用，但能促进后茬土壤拮抗菌的生长，如辣椒轮作能有效提高土壤中芽孢杆菌科（Bacillaceae）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）和鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）细菌丰度[25]。菠萝轮作显著促进土壤中浮霉状菌属（Plancto?myces）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、伯克氏菌属（Burkholderia）等细菌显著增加，这些拮抗菌的增加改善了土壤环境，间接抑制病原的生长[20]。曾莉莎等[5]在探讨香蕉-甘蔗轮作模式影响后茬香蕉枯萎病发病率的可能机制时，也发现土壤中假单胞菌目（Pseudomonadales）、浮霉菌目（Planctomycetales）、酸微菌目（Acidimicrobiales）和土壤红杆菌目（Solirubrobacterales）的细菌丰度呈随甘蔗种植年限增加而逐年增加的趋势，与香蕉枯萎病发病率呈显著负相关关系;酸杆菌目（Acidobacteriales）、红螺菌目（Rhodospirillales）和军团菌目（Legionellales）的细菌丰度则呈随甘蔗种植年限逐年降低趋势，与香蕉枯萎病发病率呈显著正相关。说明除了直接分泌抑菌物质外，某些蔬菜品种还可能通过增加土壤拮抗菌，改良土壤微生物群落结构，从而影响尖孢镰孢菌的生存环境，达到降低蕉地香蕉枯萎病原菌的目的。而在本研究中关于轮作苦瓜、茄子、辣椒、菜豆、萝卜等蔬菜品种对后茬香蕉枯萎病发病率的影响及其具体的作用机制还需要进一步试验。 参考文献
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责任编辑：沈德发