论文部分内容阅读
【摘要】《基因工程实验》是生命学科中的一门十分重要的实践课。其方法与技术已广泛渗透到现代生命科学的各个领域， 成为生命科学的一门核心技术。实验课程的教学好坏不仅直接关系到学生的专业素质和创新能力的培养，更为直接的效果就是将来进入实验室是否具有一个扎实的实验基础。本文就基因工程实验中通过建设Western Blot精品实验课程来带动实验教学进行了初步探讨与分析。
【关键词】基因工程实验 精品课程 Western Blot 基因工程实验
【中图分类号】G64 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2013）03-0049-01
1.实验项目的内涵
Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品中的蛋白质进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。所以，可以在疾病检测和探索疾病的发病机制等方面发挥重要作用。一个实验项目的内涵高低，可以从这个实验的经典属性看出，作为生物学领域被人们津津乐道的经典实验，理应具有较好的内涵。综上所述， Western Blot的内涵可以定位为以解决实际医疗检测为目标导向，以帮助学生掌握生物学研究的基本技术为主要目的生物学经典实验[1-4]。
2.实验教学的目的
（1）增强学生主观能动性：在精品实验项目Western Blot的教学过程中，老师不仅仅是单一地告诉学生实验原理，然后让学生简单重复实验步骤。而是通过将课堂上学习的知识与将来科研中可能遇到的问题相结合，引导了学生探求问题的好奇心，在老师启发式教学的引导下，学生学习的主观能动性在潜移默化中得到增强。
（2）培养学生创新能力：在教學过程中，鼓励学生提出创新性意见；同时，在实验分析时，鼓励学生通过对实验的理解优化实验条件。使得学生不仅仅在被动地接受知识，而能够有创新性的思维，以增强学生的创新能力。
（3）增强学生与老师的交流：在实验过程中，学生与老师互动，共同讨论相关问题，共同提高。
3.实验教学的方法
（1）实验前，让学生通过查找文献或教材去理解和掌握Western Blot的原理和方法。
（2）电泳胶的制备：①安装夹心式垂直板电泳槽。②根据所测蛋白质的分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。③利用双蒸水、Acr-Bis、Tris-HCl、10%SDS、10%AP和TEMED等分别配制下层分离胶和上层浓缩胶（先不加入TEMED）。④先配制分离胶并灌注，然后在顶端一侧加入1ml异丙醇封住，室温待其凝聚后去掉上层的异丙醇并用去离子水清洗，再配制浓缩胶并灌注，插入梳子待胶凝聚。
（3）待胶凝固后拔出梳子，组装电泳设备，加入电泳缓冲液后点样品。
（4）120V电压恒压电泳1.5小时左右至溴酚蓝接近胶的底部时终止电泳。
（5）使用PVDF膜和Bio-Rad的标准湿式转膜装置转膜，设置转膜电流为300-400mA，转膜时间一般根据目的蛋白的分子量大小决定：目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长；目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
（6）膜的封闭：①用1xTBST室温漂洗3次，每次10min，以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。②取漂洗的转印膜，放入5% No-fat milk的封闭液内，摇床震动，室温封闭2h。③用1xTBST室温漂洗3次，每次10min。
（7）抗体杂交：①封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液稀释的一抗封口，4℃孵育过夜或室温摇动孵育2h。②洗膜3次，每次10min。③加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h，④洗膜3次，每次10min。
（8）检测：较常用的检测系统有辣根过氧化物酶标记二抗的的增强化学发光（ECL），还有碱性磷酸酶（AP）标记的二抗结合NBT/BCIP显色法，其中前者需要扫描仪才能最后读出实验结果，实验硬件要求较高；而后者则可以直接在杂交膜上显色，因此本实验采用后者。①按照1ml 1xAP反应缓冲Buffer中各加 50μl NBT及BCIP 溶液的比例配置显色液。②把经洗涤的PVDF或NC膜浸入生色底物混合物中，于室温平缓摇动进行温育反应。③细心观察反应过程，当蛋白带的颜色深度达时，把膜浸入水中停止反应。④拍摄膜照片或直接保存膜留作永久实验纪录。
（9）学生分析实验结果并提出具创新性的问题。
（10）完成实验报告。
4.实验教学的考核
Western Blot作为生物学经典实验，能很好地培养学生的综合素质和创新能力。而作为精品实验项目，该实验的考核要区别于传统的考核方式。以前实验的考核主要以实验报告为唯一的依据，并不能完全地反馈学生对实验的实际掌握情况。因此，我们采用综合评定的方式。学生查阅资料的情况、学生对实验的理解、实验操作的过程和对待实验的态度都列入评分，计入实验成绩。通过这种综合评价方式，可以使学生认真地思考每个实验细节，注重实验操作能力的提高，使学生养成严谨求实的科研态度，全面提升学生的综合素质。
5.结束语
Western Blot是一门柔和了基础性、设计性和探索性要素的生物学经典实验。 它能够将课堂上的理论知识与具体实验相结合，激发学生的学习兴趣，增强学生的主观能动性，促进学生分析问题，解决问题的实践能力和创新能力等多方面能力的培养和提高[5-6]。
参考文献：
[1]朱玉华，杨正宏.建设精品实验项目，促进创新能力培养[J].实验室研究与探索，2008，27（1）：7-9.
[2]王士芬，施鼎方，唐贤春.建立精品实验项目，丰富实验教育形式[J].实验技术与管理，2008，25（6）：146-148.
[3]徐宁，牟建明.“精品实验项目”经典属性的探索[J]. 实验技术与管理，2012，29（3）：24-26.
[4]张娴，王士芬，徐竟成.建设精品实验项目，深化创新人才教育[J].实验室研究与探索，2011，30（11）：87-89.
[5]王云创，秦丹，刘俊杰，等.在实验教学中培养创造性思维能力[J].实验室研究与探索，2010，29（5）：140-142.
[6]沈剑敏，陈强，管利萍.培养大学生创新实践能力的探索与思考[J].实验室研究与探索，2009，28（10）：104-105，152.
【关键词】基因工程实验 精品课程 Western Blot 基因工程实验
【中图分类号】G64 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2013）03-0049-01
1.实验项目的内涵
Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品中的蛋白质进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。所以，可以在疾病检测和探索疾病的发病机制等方面发挥重要作用。一个实验项目的内涵高低，可以从这个实验的经典属性看出，作为生物学领域被人们津津乐道的经典实验，理应具有较好的内涵。综上所述， Western Blot的内涵可以定位为以解决实际医疗检测为目标导向，以帮助学生掌握生物学研究的基本技术为主要目的生物学经典实验[1-4]。
2.实验教学的目的
（1）增强学生主观能动性：在精品实验项目Western Blot的教学过程中，老师不仅仅是单一地告诉学生实验原理，然后让学生简单重复实验步骤。而是通过将课堂上学习的知识与将来科研中可能遇到的问题相结合，引导了学生探求问题的好奇心，在老师启发式教学的引导下，学生学习的主观能动性在潜移默化中得到增强。
（2）培养学生创新能力：在教學过程中，鼓励学生提出创新性意见；同时，在实验分析时，鼓励学生通过对实验的理解优化实验条件。使得学生不仅仅在被动地接受知识，而能够有创新性的思维，以增强学生的创新能力。
（3）增强学生与老师的交流：在实验过程中，学生与老师互动，共同讨论相关问题，共同提高。
3.实验教学的方法
（1）实验前，让学生通过查找文献或教材去理解和掌握Western Blot的原理和方法。
（2）电泳胶的制备：①安装夹心式垂直板电泳槽。②根据所测蛋白质的分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。③利用双蒸水、Acr-Bis、Tris-HCl、10%SDS、10%AP和TEMED等分别配制下层分离胶和上层浓缩胶（先不加入TEMED）。④先配制分离胶并灌注，然后在顶端一侧加入1ml异丙醇封住，室温待其凝聚后去掉上层的异丙醇并用去离子水清洗，再配制浓缩胶并灌注，插入梳子待胶凝聚。
（3）待胶凝固后拔出梳子，组装电泳设备，加入电泳缓冲液后点样品。
（4）120V电压恒压电泳1.5小时左右至溴酚蓝接近胶的底部时终止电泳。
（5）使用PVDF膜和Bio-Rad的标准湿式转膜装置转膜，设置转膜电流为300-400mA，转膜时间一般根据目的蛋白的分子量大小决定：目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长；目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
（6）膜的封闭：①用1xTBST室温漂洗3次，每次10min，以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。②取漂洗的转印膜，放入5% No-fat milk的封闭液内，摇床震动，室温封闭2h。③用1xTBST室温漂洗3次，每次10min。
（7）抗体杂交：①封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液稀释的一抗封口，4℃孵育过夜或室温摇动孵育2h。②洗膜3次，每次10min。③加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h，④洗膜3次，每次10min。
（8）检测：较常用的检测系统有辣根过氧化物酶标记二抗的的增强化学发光（ECL），还有碱性磷酸酶（AP）标记的二抗结合NBT/BCIP显色法，其中前者需要扫描仪才能最后读出实验结果，实验硬件要求较高；而后者则可以直接在杂交膜上显色，因此本实验采用后者。①按照1ml 1xAP反应缓冲Buffer中各加 50μl NBT及BCIP 溶液的比例配置显色液。②把经洗涤的PVDF或NC膜浸入生色底物混合物中，于室温平缓摇动进行温育反应。③细心观察反应过程，当蛋白带的颜色深度达时，把膜浸入水中停止反应。④拍摄膜照片或直接保存膜留作永久实验纪录。
（9）学生分析实验结果并提出具创新性的问题。
（10）完成实验报告。
4.实验教学的考核
Western Blot作为生物学经典实验，能很好地培养学生的综合素质和创新能力。而作为精品实验项目，该实验的考核要区别于传统的考核方式。以前实验的考核主要以实验报告为唯一的依据，并不能完全地反馈学生对实验的实际掌握情况。因此，我们采用综合评定的方式。学生查阅资料的情况、学生对实验的理解、实验操作的过程和对待实验的态度都列入评分，计入实验成绩。通过这种综合评价方式，可以使学生认真地思考每个实验细节，注重实验操作能力的提高，使学生养成严谨求实的科研态度，全面提升学生的综合素质。
5.结束语
Western Blot是一门柔和了基础性、设计性和探索性要素的生物学经典实验。 它能够将课堂上的理论知识与具体实验相结合，激发学生的学习兴趣，增强学生的主观能动性，促进学生分析问题，解决问题的实践能力和创新能力等多方面能力的培养和提高[5-6]。
参考文献：
[1]朱玉华，杨正宏.建设精品实验项目，促进创新能力培养[J].实验室研究与探索，2008，27（1）：7-9.
[2]王士芬，施鼎方，唐贤春.建立精品实验项目，丰富实验教育形式[J].实验技术与管理，2008，25（6）：146-148.
[3]徐宁，牟建明.“精品实验项目”经典属性的探索[J]. 实验技术与管理，2012，29（3）：24-26.
[4]张娴，王士芬，徐竟成.建设精品实验项目，深化创新人才教育[J].实验室研究与探索，2011，30（11）：87-89.
[5]王云创，秦丹，刘俊杰，等.在实验教学中培养创造性思维能力[J].实验室研究与探索，2010，29（5）：140-142.
[6]沈剑敏，陈强，管利萍.培养大学生创新实践能力的探索与思考[J].实验室研究与探索，2009，28（10）：104-105，152.