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[摘要]目的：探索血管内皮生长因子、纤维蛋白胶及珊瑚人工骨复合物結合下颌骨外板劈开即“夹心法”成骨过程中组织形态学变化，为进一步的实验研究及以后的临床应用提供理论依据。方法：以小型猪为实验对象，A组左侧行下颌骨外板劈开，颗粒状珊瑚羟基磷灰石、血管内皮生长因子及纤维蛋白胶（CHA+VEGF+FS）复合物植入术，右侧作为正常对照组。B组左侧行下颌骨外板劈开，颗粒状珊瑚羟基磷灰石、血管内皮生长因子及纤维蛋白胶（CHA+VEGF+FS）复合物植入术；右侧行下颌骨外板劈开，颗粒状珊瑚羟基磷灰石及纤维蛋白胶（CHA+FS）复合物植入术。通过组织形态学观察等手段研究VEGF对新骨形成过程的影响，评估术后效果。结果：研究发现CHA+VEGF+FS复合物植入后可以促进珊瑚人工骨实现早期血管化，从而减低骨再生过程中珊瑚人工骨的无效降解。结论：CHA+VEGF+FS夹心法可以为珊瑚人工骨提供更好的成骨条件，从而更好实现骨再生，最终使得其可以作为矫治半侧颜面短小导致的下颌骨发育不良畸形的有效手段之一。
[关键词]下颌骨外板劈开术；珊瑚人工骨；半侧颜面短小；血管内皮生长因子；纤维蛋白胶
[中图分类号]R782.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）09-0117-04
The Foundation Research of “Sandwich” Method Combined with Exogenous VEGF for the Treatment of Hemifacial Microsomia
XU Jia，LI Xi，QIAO Jia，LIU Jian-feng，NIU Feng，GUI Lai
（The 6th Department of Plastic Surgery Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100144，China）
Abstract： Objective To discuss the morphological changes in the process of vascular endothelial growth factor and fibrin glue and coral artificial bone complex combined with the osteotomy of outer mandibular cortex，in order to carry out a further study and provide theoretical basis for clinical application in the future. Methods 10 miniature pigs were selected as the experimental animals and then were divided into 2 groups randomly： group A and group B. In group A， the outer cortex of mandibular body and angle was split in one side and the compound of CHA+VEGF+FS was implanted into the gap between the outer and inner cortex of mandible， and the other side was control group. In group B， two kinds of compounds （the left side： the compound of CHA+VEGF+FS， the right side： the compound of CHA+FS ） was implanted into the gaps with the same methods separately.The osteogenesis of this method was assessed by the morphological， histological observation. Results We found that CHA+VEGF+FS complex can promote the vascularization of coral artificial bone earlier， along with reducing the ineffective degradation of coral artificial bone during the process of bone regeneration. Conclusion The results of this pilot study indicate that the osteotomy of the outer mandibular cortex combined with the compound of CHA+VEGF+FS can provide a sufficient osteogenesis for the artificial coral bone during the process of bone regeneration， and finally， it can be used as one of the effective methods to correct the dysplasia of the mandible caused by hemifacial microsomia.
Key words： osteotomy of the outer mandibular cortex； coralline hydroxyapatite； hemifacial microsomia； vascular endothelial growth factor； fibrin sealant 半侧颜面短小的治疗过程中，下颌骨宽度的重建是一个具有挑战性的難题。目前自体骨被认为是骨修复材料的较好选择[1-2]，但是由于较高的骨吸收率限制了它的应用[3-4]。珊瑚人工骨具有很好的组织相容性，具有很强的骨传导能力，吸收后能完全被新生骨替代。因此，作为外源性骨源已有较多的临床和实验研究的报道[5-6]。既往珊瑚人工骨植入方式多为贴附植骨，但成骨效率不高。归来等[7]提出下颌骨外板劈开天然珊瑚人工骨植入即“夹心法”用以矫治半侧颜面短小畸形，取得了良好效果。
尽管如此，在植入较大的珊瑚人工骨后，其内部早期血管化程度较低，维持成骨细胞活力的各种营养物质无法通过血管运输及时到达，以致骨传导作用中断，当珊瑚人工骨被吸收时，新生骨还没有产生，以致难以实现骨替代最大化[8]。因此为了探寻更好的下颌骨外板劈开珊瑚人工骨充填术中珊瑚人工骨的植入条件、方式和环境，实现珊瑚人工骨早期血管化程度的提升，从而达到更优的成骨效果，设计了本实验研究。
1 材料和方法
1.1 实验分组：成年小型猪10头，随机分为A、B两组，A组左侧行下颌骨外板劈开，颗粒状珊瑚羟基磷灰石（Coralline hydroxyapatite，CHA）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）及纤维蛋白胶（Fibrin sealant，FS）复合物植入术，右侧为正常对照组。B组左侧行下颌骨外板劈开，颗粒状珊瑚羟基磷灰石、血管内皮生长因子及纤维蛋白胶复合物（CHA+VEGF+FS）植入术；右侧行下颌骨外板劈开，颗粒状珊瑚羟基磷灰石及纤维蛋白胶复合物（CHA+FS）植入术。
1.2 手术方法
1.2.1 血管内皮生长因子的溶解、稀释、分装：将血管内皮生长因子（rmVEGF165）粉末离心后用1ml无菌双蒸水对血管内皮生长因子粉末溶解，后用少量无菌双蒸水小心冲洗管壁，盖上盖子，上下震荡，充分溶解。溶解后将溶液稀释至10ml，然后将其分为10份，分装至1ml的无菌离心管，密封后-20℃储存备用。血管内皮生长因子溶液的浓度为1 000ng/ml。
1.2.2 术中操作：全身麻醉成功后，肌注青霉素80万单位。称量体重。取右侧卧位，开口，保持呼吸道通畅。术区备皮，注意不要划伤皮肤。以0.5%碘伏消毒3遍，常规铺无菌治疗巾。取左侧下颌下缘切口，长约8cm，局部注射0.5%利多卡因，切开皮肤、皮下至骨膜，于骨膜下剥离，小心操作，尽量使骨膜完整保留，显露下颌骨角区、部分体部骨质及颏孔。自角区至颏孔后1cm，用美蓝标记截骨线（见图1），以细牙科钻小心将下颌骨外板截透直到有血液从骨缝渗出，确保将外板水平截骨线及下颌骨后缘的交界处骨质、角体部垂直截骨线及下颌骨下缘的交界处骨质截透。截骨时要注意不要伤及下牙槽神经以及牙根。用骨凿自下颌骨下缘将下颌骨角体部外板凿下，完整取出截下的下颌骨角体部外板，盐水纱布包裹备用。庆大霉素盐水冲洗术区，仔细止血。将体积为5cc的颗粒状珊瑚磷灰石人工骨（见图2）小心放置于取下的下颌骨外板内侧面，后将解冻好的rmVEGF165溶液1ml均匀地滴加在珊瑚人工骨表面后，用配制好的猪源性纤维蛋白较粘合剂（见图3）1.5ml将颗粒状珊瑚人工骨包裹塑形固定后，形成CHA+VEGF+FS复合物。将下颌骨外板及CHA+VEGF+FS复合物回植，适当加压，钛钉、钛板坚强内固定，植入厚度约为5mm（见图4）。对侧作为正常对照。庆大霉素盐水冲洗术区，骨膜层、皮下组织、皮肤表层分层缝合，闭合切口。B组操作基本同上，左侧植入CHA+VEGF+FS复合物，右侧植入CHA+FS复合物。
1.3 术后观察及检测指标：于术后3个月每组随机挑选1头动物处死，经大体观察后，取下颌骨的珊瑚人工骨植入区大小2cm的骨质标本行组织学（HE染色、天狼星红、弹力纤维特殊染色）观察，另8头动物于术后6个月处死，处理同上。
2 结果
2.1 大体情况观察：所有动物术后恢复良好，饮食正常，切口愈合良好，无感染、血肿等并发症发生。术后3个月，两侧下颌骨术区创面基本愈合，术区下缘骨质不平整，局部可见凹陷，软组织附着紧密（见图5～6）。术后6个月，两侧均可见下颌骨人工骨材料植入区愈合良好，下缘凹凸不平，可见少量软组织附着，咬肌附着紧密（见图7～8）。
2.2 组织学观察结果
2.2.1 HE染色结果：正常骨组织HE染色表现骨皮质致密，可见大量板层结构（见图9）。术后3个月，（CHA+VEGF+FS）侧：可见比较成熟的新生骨，新生骨趋于成熟，开始可见板层结构，其中可见大量骨陷凹，骨小梁数量增多、排列紊乱，骨小梁间隙出现大量血管，同时可见少许脂肪组织形成，但仍可见纤细的纤维细胞（见图10）；（CHA+FS）侧：新生骨小梁组织，骨小梁数目较多、排列紊乱，可见骨陷凹，骨小梁间隙可见血管成分较少，并可见大量纤细的纤维细胞及其中散在的骨样基质，骨小梁纤维细胞取代修复材料，多核巨细胞成团出现并观察到吞噬现象。其骨小梁未见板层结构等新生骨成熟现象（见图11）。
术后6个月，（CHA+VEGF+FS）侧：可见新生骨逐渐改建完成，形成髓腔，其间大量脂肪组织，钙化好，有大量板层骨相互融合成片（见图12）。（CHA+FS）侧：亦可见新生骨改建接近完成，形成髓腔，有大量板层骨相互融合成片，较（CHA+VEGF+FS）侧无明显差异（见图13）。
2.2.2 天狼星红染色结果：正常骨组织排列较规则，连续少见中断现象，染色为红色，胶原排列致密，相邻骨板纤维走向呈现相互交叉的三维排列，甚少见分层现象（见图14）。术后3个月，（CHA+VEGF+FS）侧：可见I型胶原红染面积所占测试区面积较高，排列欠规则，但胶原排列致密，少见分层现象（见图15）；（CHA+FS）侧：可见骨胶原排列较稀疏，连续性较差并有可见断裂分层现象，着色较浅并不均一，红染的面积所占测试区面积稍低（见图16）。 术后6个月，（CHA+VEGF+FS）侧：可见排列较规则，连續性好，染色为红色，着色较深，红染的面积所占测试区面积高，胶原排列致密，较少见分层现象（见图17）；（CHA+FS）侧：可见胶原纤维排列紧密，但形态稍不规则，红染加深，红染面积占测试区的比例明显增高，纤维走向趋于正常（见图18）。
2.2.3 弹力纤维染色结果：利用弹力纤维特殊染色对取材标本中的血管管腔的弹力纤维进行特异性染色，在高倍镜下（20×），随机选取5个视野，进行血管计数，后取平均值，可观察到术后3个月（CHA+VEGF+FS）侧血管计数（62.30±3.72）较（CHA+FS）侧血管计数多（43.80±3.66），差异有统计学意义（P=0.021<0.05）；但与正常骨组织比较差异无统计学意义（P=0.165>0.05）。 术后6个月（CHA+VEGF+FS）侧血管计数（38.00±3.29）较（CHA+FS）侧血管计数多（26.30±2.12），但差异无统计学意义（P=0.285>0.05）；与正常骨组织比较差异无统计学意义（P=0.064>0.05）。
3 讨论
3.1 珊瑚人工骨充填方法的选择：目前珊瑚人工骨常用的植入方式为贴附移植[9-10]，但该方法只能与受区骨组织有一个骨性接触面，归来等[11]通过对比分析植入方式的不同对成骨的影响，发现嵌入植骨及包埋植骨均较贴附植骨的效果更好，其原因是由于珊瑚人工骨与受区骨组织获得了两个或两个以上的接触面。因此归来等[7]首次提出了应用下颌骨外板劈开珊瑚人工骨充填矫治半侧颜面短小畸形，将材料与受区骨组织的接触面从单平面的转变为双平面，提高了成骨效能，并取得了良好的治疗效果。另外，珊瑚人工骨材料还可以与富含骨髓的下颌骨松质骨或髓腔直接接触。研究表明，骨髓是由造血干细胞及基质干细胞组成，而起到分化成骨作用的主要由是基质干细胞，它含有两种骨母细胞：定向成骨骨母细胞和诱导成骨骨母细胞，无论有无外界影响，骨髓细胞均向骨细胞分化，为材料的成骨及降解提供了良好的环境，从而实现更好的成骨及对材料的降解吸收[12-14]。
3.2 珊瑚人工骨的血管化策略：虽然应用“夹心法”为珊瑚人工骨的成骨提供了更好的环境，但是研究表明采用较大的珊瑚人工骨植入后，由于珊瑚人工骨早期内部血管化程度较低，维持成骨细胞活力的各种营养物质无法通过血管运输及时到达，以致该区域骨传导无法正常进行，当珊瑚人工骨被完全吸收时，新生骨还没有产生，以致材料骨替代最大化的目的难以达到[15-16]。在此过程中，移植物的血管化过程是关键环节[17]，材料植入体内，只有尽快建立血运，才能减少骨吸收[18]，从而实现材料利用的最大化。
血管内皮生长因子作为效用最强的促血管内皮生长及血管新生的诱导因子[19]，因此也得到广泛应用。但由于VEGF半衰期短，代谢降解快，且如果大剂量给药，容易导致局部血管畸形的产生[20]。基于此，试图引入纤维蛋白胶作为药物缓释载体[21]，由于其在体内一般在1～2周内逐渐被机体降解吸收，所以对珊瑚人工骨的多孔结构特性没有影响。在VEGF的使用剂量上，目前并没有统一的标准[22]，参考之前的研究结果及前期预实验选择1 000ng/ml作为该研究的使用剂量，从术后大体、组织学观察未见局部血管畸形等并发症的发生，证实该使用剂量在安全剂量范围内。
3.3 组织学结果分析：本实验中发现术后3个月，（CHA+VEGF+FS）侧新生骨的成熟程度较高，出现这种情况的原因考虑主要是出于以下几点：①由于珊瑚人工骨复合物侧早期引入了外源性的VEGF，使得局部通过VEGF对成骨细胞的趋化作用较珊瑚人工骨侧更强，成骨细胞数目增加，并且VEGF通过促进血管内皮细胞分泌IGF-1及ET-1来刺激成骨细胞生长[23]，使得成骨细胞无论从“质”或“量”上都得到了提升；②通过弹力纤维特殊染色血管计数发现，术后3个月（CHA+VEGF+FS）侧血管计数为62.3±3.72，高于（CHA+FS）侧的43.8±3.66，两侧比较差异有统计学意义（P=0.021），说明通过外源性的VEGF引入，（CHA+VEGF+FS）侧珊瑚人工骨血管化程度较高，较多的成纤维细胞也随着丰富的血运到此，而成纤维细胞作为骨重建中生成骨胶原蛋白的初始细胞，为（CHA+VEGF+FS）复合物启动骨重建中的胶原蛋白合成的过程提供了大量的原料[24-26]，通过天狼星红染色也观察到（CHA+VEGF+FS）侧I型胶原红染面积所占测试区比例较（CHA+FS）侧高，提示（CHA+VEGF+FS）侧胶原含量较高，说明骨重建期珊瑚人工骨的血管化程度是与骨I型胶原的含量大小及走向规律与否呈正相关。胶原形成后，其本身具有良好的诱导成骨作用，从而加速了骨再生过程，对新生骨的成熟也起到积极作用；③成骨细胞常生长在骨表面与胶原纤维之间，合成并分泌胶原纤维及有机基质，合成的胶原纤维作为模板，在富含钙和磷的环境中发生类骨质的钙化，成骨细胞包埋其中成为骨细胞，形成骨组织[26]。本研究中，（CHA+VEGF+FS）侧增多的成骨细胞和胶原相辅相成，快速启动骨基质的矿化过程，经过矿化形成编织骨，而后I型胶原的排列方向顺应受力的方向出现有序的斜形螺旋形排列。同时为了加强在各个方向上的抗张强度，相邻两个骨板的胶原纤维排列逐渐紧密，最终使编织骨转变为板层骨，使得该时间点（CHA+VEGF+FS）侧新生骨较成熟。术后6个月，（CHA+VEGF+FS）侧和（CHA+FS）侧天狼星红染色显示红染面积占测量区面积的百分比均较术后3个月时增大，且红染加深，胶原形态逐渐也趋于正常骨组织，同时HE染色也显示两组并无明显差异，表明新生骨改建逐渐趋于成熟，提示骨再生过程逐渐完成。发现术后前3个月是影响珊瑚人工骨成骨的关键时期，而通过VEGF的引入对加快珊瑚人工骨的骨生成过程有着确切的积极作用。
4 结论
本实验通过组织学观察发现CHA+VEGF+FS复合物早期血管化程度高，在骨再生的过程中更早地实现骨成熟。论证了下颌骨外板劈开，CHA+VEGF+FS复合物植入术可以作为矫治半侧颜面短小导致的下颌骨发育不良畸形的有效手段之一，为其应用于临床打下基础。 [參考文献]
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[收稿日期]2018-06-11 [修回日期]2018-08-20
編辑/朱婉蓉
[关键词]下颌骨外板劈开术；珊瑚人工骨；半侧颜面短小；血管内皮生长因子；纤维蛋白胶
[中图分类号]R782.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）09-0117-04
The Foundation Research of “Sandwich” Method Combined with Exogenous VEGF for the Treatment of Hemifacial Microsomia
XU Jia，LI Xi，QIAO Jia，LIU Jian-feng，NIU Feng，GUI Lai
（The 6th Department of Plastic Surgery Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100144，China）
Abstract： Objective To discuss the morphological changes in the process of vascular endothelial growth factor and fibrin glue and coral artificial bone complex combined with the osteotomy of outer mandibular cortex，in order to carry out a further study and provide theoretical basis for clinical application in the future. Methods 10 miniature pigs were selected as the experimental animals and then were divided into 2 groups randomly： group A and group B. In group A， the outer cortex of mandibular body and angle was split in one side and the compound of CHA+VEGF+FS was implanted into the gap between the outer and inner cortex of mandible， and the other side was control group. In group B， two kinds of compounds （the left side： the compound of CHA+VEGF+FS， the right side： the compound of CHA+FS ） was implanted into the gaps with the same methods separately.The osteogenesis of this method was assessed by the morphological， histological observation. Results We found that CHA+VEGF+FS complex can promote the vascularization of coral artificial bone earlier， along with reducing the ineffective degradation of coral artificial bone during the process of bone regeneration. Conclusion The results of this pilot study indicate that the osteotomy of the outer mandibular cortex combined with the compound of CHA+VEGF+FS can provide a sufficient osteogenesis for the artificial coral bone during the process of bone regeneration， and finally， it can be used as one of the effective methods to correct the dysplasia of the mandible caused by hemifacial microsomia.
Key words： osteotomy of the outer mandibular cortex； coralline hydroxyapatite； hemifacial microsomia； vascular endothelial growth factor； fibrin sealant 半侧颜面短小的治疗过程中，下颌骨宽度的重建是一个具有挑战性的難题。目前自体骨被认为是骨修复材料的较好选择[1-2]，但是由于较高的骨吸收率限制了它的应用[3-4]。珊瑚人工骨具有很好的组织相容性，具有很强的骨传导能力，吸收后能完全被新生骨替代。因此，作为外源性骨源已有较多的临床和实验研究的报道[5-6]。既往珊瑚人工骨植入方式多为贴附植骨，但成骨效率不高。归来等[7]提出下颌骨外板劈开天然珊瑚人工骨植入即“夹心法”用以矫治半侧颜面短小畸形，取得了良好效果。
尽管如此，在植入较大的珊瑚人工骨后，其内部早期血管化程度较低，维持成骨细胞活力的各种营养物质无法通过血管运输及时到达，以致骨传导作用中断，当珊瑚人工骨被吸收时，新生骨还没有产生，以致难以实现骨替代最大化[8]。因此为了探寻更好的下颌骨外板劈开珊瑚人工骨充填术中珊瑚人工骨的植入条件、方式和环境，实现珊瑚人工骨早期血管化程度的提升，从而达到更优的成骨效果，设计了本实验研究。
1 材料和方法
1.1 实验分组：成年小型猪10头，随机分为A、B两组，A组左侧行下颌骨外板劈开，颗粒状珊瑚羟基磷灰石（Coralline hydroxyapatite，CHA）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）及纤维蛋白胶（Fibrin sealant，FS）复合物植入术，右侧为正常对照组。B组左侧行下颌骨外板劈开，颗粒状珊瑚羟基磷灰石、血管内皮生长因子及纤维蛋白胶复合物（CHA+VEGF+FS）植入术；右侧行下颌骨外板劈开，颗粒状珊瑚羟基磷灰石及纤维蛋白胶复合物（CHA+FS）植入术。
1.2 手术方法
1.2.1 血管内皮生长因子的溶解、稀释、分装：将血管内皮生长因子（rmVEGF165）粉末离心后用1ml无菌双蒸水对血管内皮生长因子粉末溶解，后用少量无菌双蒸水小心冲洗管壁，盖上盖子，上下震荡，充分溶解。溶解后将溶液稀释至10ml，然后将其分为10份，分装至1ml的无菌离心管，密封后-20℃储存备用。血管内皮生长因子溶液的浓度为1 000ng/ml。
1.2.2 术中操作：全身麻醉成功后，肌注青霉素80万单位。称量体重。取右侧卧位，开口，保持呼吸道通畅。术区备皮，注意不要划伤皮肤。以0.5%碘伏消毒3遍，常规铺无菌治疗巾。取左侧下颌下缘切口，长约8cm，局部注射0.5%利多卡因，切开皮肤、皮下至骨膜，于骨膜下剥离，小心操作，尽量使骨膜完整保留，显露下颌骨角区、部分体部骨质及颏孔。自角区至颏孔后1cm，用美蓝标记截骨线（见图1），以细牙科钻小心将下颌骨外板截透直到有血液从骨缝渗出，确保将外板水平截骨线及下颌骨后缘的交界处骨质、角体部垂直截骨线及下颌骨下缘的交界处骨质截透。截骨时要注意不要伤及下牙槽神经以及牙根。用骨凿自下颌骨下缘将下颌骨角体部外板凿下，完整取出截下的下颌骨角体部外板，盐水纱布包裹备用。庆大霉素盐水冲洗术区，仔细止血。将体积为5cc的颗粒状珊瑚磷灰石人工骨（见图2）小心放置于取下的下颌骨外板内侧面，后将解冻好的rmVEGF165溶液1ml均匀地滴加在珊瑚人工骨表面后，用配制好的猪源性纤维蛋白较粘合剂（见图3）1.5ml将颗粒状珊瑚人工骨包裹塑形固定后，形成CHA+VEGF+FS复合物。将下颌骨外板及CHA+VEGF+FS复合物回植，适当加压，钛钉、钛板坚强内固定，植入厚度约为5mm（见图4）。对侧作为正常对照。庆大霉素盐水冲洗术区，骨膜层、皮下组织、皮肤表层分层缝合，闭合切口。B组操作基本同上，左侧植入CHA+VEGF+FS复合物，右侧植入CHA+FS复合物。
1.3 术后观察及检测指标：于术后3个月每组随机挑选1头动物处死，经大体观察后，取下颌骨的珊瑚人工骨植入区大小2cm的骨质标本行组织学（HE染色、天狼星红、弹力纤维特殊染色）观察，另8头动物于术后6个月处死，处理同上。
2 结果
2.1 大体情况观察：所有动物术后恢复良好，饮食正常，切口愈合良好，无感染、血肿等并发症发生。术后3个月，两侧下颌骨术区创面基本愈合，术区下缘骨质不平整，局部可见凹陷，软组织附着紧密（见图5～6）。术后6个月，两侧均可见下颌骨人工骨材料植入区愈合良好，下缘凹凸不平，可见少量软组织附着，咬肌附着紧密（见图7～8）。
2.2 组织学观察结果
2.2.1 HE染色结果：正常骨组织HE染色表现骨皮质致密，可见大量板层结构（见图9）。术后3个月，（CHA+VEGF+FS）侧：可见比较成熟的新生骨，新生骨趋于成熟，开始可见板层结构，其中可见大量骨陷凹，骨小梁数量增多、排列紊乱，骨小梁间隙出现大量血管，同时可见少许脂肪组织形成，但仍可见纤细的纤维细胞（见图10）；（CHA+FS）侧：新生骨小梁组织，骨小梁数目较多、排列紊乱，可见骨陷凹，骨小梁间隙可见血管成分较少，并可见大量纤细的纤维细胞及其中散在的骨样基质，骨小梁纤维细胞取代修复材料，多核巨细胞成团出现并观察到吞噬现象。其骨小梁未见板层结构等新生骨成熟现象（见图11）。
术后6个月，（CHA+VEGF+FS）侧：可见新生骨逐渐改建完成，形成髓腔，其间大量脂肪组织，钙化好，有大量板层骨相互融合成片（见图12）。（CHA+FS）侧：亦可见新生骨改建接近完成，形成髓腔，有大量板层骨相互融合成片，较（CHA+VEGF+FS）侧无明显差异（见图13）。
2.2.2 天狼星红染色结果：正常骨组织排列较规则，连续少见中断现象，染色为红色，胶原排列致密，相邻骨板纤维走向呈现相互交叉的三维排列，甚少见分层现象（见图14）。术后3个月，（CHA+VEGF+FS）侧：可见I型胶原红染面积所占测试区面积较高，排列欠规则，但胶原排列致密，少见分层现象（见图15）；（CHA+FS）侧：可见骨胶原排列较稀疏，连续性较差并有可见断裂分层现象，着色较浅并不均一，红染的面积所占测试区面积稍低（见图16）。 术后6个月，（CHA+VEGF+FS）侧：可见排列较规则，连續性好，染色为红色，着色较深，红染的面积所占测试区面积高，胶原排列致密，较少见分层现象（见图17）；（CHA+FS）侧：可见胶原纤维排列紧密，但形态稍不规则，红染加深，红染面积占测试区的比例明显增高，纤维走向趋于正常（见图18）。
2.2.3 弹力纤维染色结果：利用弹力纤维特殊染色对取材标本中的血管管腔的弹力纤维进行特异性染色，在高倍镜下（20×），随机选取5个视野，进行血管计数，后取平均值，可观察到术后3个月（CHA+VEGF+FS）侧血管计数（62.30±3.72）较（CHA+FS）侧血管计数多（43.80±3.66），差异有统计学意义（P=0.021<0.05）；但与正常骨组织比较差异无统计学意义（P=0.165>0.05）。 术后6个月（CHA+VEGF+FS）侧血管计数（38.00±3.29）较（CHA+FS）侧血管计数多（26.30±2.12），但差异无统计学意义（P=0.285>0.05）；与正常骨组织比较差异无统计学意义（P=0.064>0.05）。
3 讨论
3.1 珊瑚人工骨充填方法的选择：目前珊瑚人工骨常用的植入方式为贴附移植[9-10]，但该方法只能与受区骨组织有一个骨性接触面，归来等[11]通过对比分析植入方式的不同对成骨的影响，发现嵌入植骨及包埋植骨均较贴附植骨的效果更好，其原因是由于珊瑚人工骨与受区骨组织获得了两个或两个以上的接触面。因此归来等[7]首次提出了应用下颌骨外板劈开珊瑚人工骨充填矫治半侧颜面短小畸形，将材料与受区骨组织的接触面从单平面的转变为双平面，提高了成骨效能，并取得了良好的治疗效果。另外，珊瑚人工骨材料还可以与富含骨髓的下颌骨松质骨或髓腔直接接触。研究表明，骨髓是由造血干细胞及基质干细胞组成，而起到分化成骨作用的主要由是基质干细胞，它含有两种骨母细胞：定向成骨骨母细胞和诱导成骨骨母细胞，无论有无外界影响，骨髓细胞均向骨细胞分化，为材料的成骨及降解提供了良好的环境，从而实现更好的成骨及对材料的降解吸收[12-14]。
3.2 珊瑚人工骨的血管化策略：虽然应用“夹心法”为珊瑚人工骨的成骨提供了更好的环境，但是研究表明采用较大的珊瑚人工骨植入后，由于珊瑚人工骨早期内部血管化程度较低，维持成骨细胞活力的各种营养物质无法通过血管运输及时到达，以致该区域骨传导无法正常进行，当珊瑚人工骨被完全吸收时，新生骨还没有产生，以致材料骨替代最大化的目的难以达到[15-16]。在此过程中，移植物的血管化过程是关键环节[17]，材料植入体内，只有尽快建立血运，才能减少骨吸收[18]，从而实现材料利用的最大化。
血管内皮生长因子作为效用最强的促血管内皮生长及血管新生的诱导因子[19]，因此也得到广泛应用。但由于VEGF半衰期短，代谢降解快，且如果大剂量给药，容易导致局部血管畸形的产生[20]。基于此，试图引入纤维蛋白胶作为药物缓释载体[21]，由于其在体内一般在1～2周内逐渐被机体降解吸收，所以对珊瑚人工骨的多孔结构特性没有影响。在VEGF的使用剂量上，目前并没有统一的标准[22]，参考之前的研究结果及前期预实验选择1 000ng/ml作为该研究的使用剂量，从术后大体、组织学观察未见局部血管畸形等并发症的发生，证实该使用剂量在安全剂量范围内。
3.3 组织学结果分析：本实验中发现术后3个月，（CHA+VEGF+FS）侧新生骨的成熟程度较高，出现这种情况的原因考虑主要是出于以下几点：①由于珊瑚人工骨复合物侧早期引入了外源性的VEGF，使得局部通过VEGF对成骨细胞的趋化作用较珊瑚人工骨侧更强，成骨细胞数目增加，并且VEGF通过促进血管内皮细胞分泌IGF-1及ET-1来刺激成骨细胞生长[23]，使得成骨细胞无论从“质”或“量”上都得到了提升；②通过弹力纤维特殊染色血管计数发现，术后3个月（CHA+VEGF+FS）侧血管计数为62.3±3.72，高于（CHA+FS）侧的43.8±3.66，两侧比较差异有统计学意义（P=0.021），说明通过外源性的VEGF引入，（CHA+VEGF+FS）侧珊瑚人工骨血管化程度较高，较多的成纤维细胞也随着丰富的血运到此，而成纤维细胞作为骨重建中生成骨胶原蛋白的初始细胞，为（CHA+VEGF+FS）复合物启动骨重建中的胶原蛋白合成的过程提供了大量的原料[24-26]，通过天狼星红染色也观察到（CHA+VEGF+FS）侧I型胶原红染面积所占测试区比例较（CHA+FS）侧高，提示（CHA+VEGF+FS）侧胶原含量较高，说明骨重建期珊瑚人工骨的血管化程度是与骨I型胶原的含量大小及走向规律与否呈正相关。胶原形成后，其本身具有良好的诱导成骨作用，从而加速了骨再生过程，对新生骨的成熟也起到积极作用；③成骨细胞常生长在骨表面与胶原纤维之间，合成并分泌胶原纤维及有机基质，合成的胶原纤维作为模板，在富含钙和磷的环境中发生类骨质的钙化，成骨细胞包埋其中成为骨细胞，形成骨组织[26]。本研究中，（CHA+VEGF+FS）侧增多的成骨细胞和胶原相辅相成，快速启动骨基质的矿化过程，经过矿化形成编织骨，而后I型胶原的排列方向顺应受力的方向出现有序的斜形螺旋形排列。同时为了加强在各个方向上的抗张强度，相邻两个骨板的胶原纤维排列逐渐紧密，最终使编织骨转变为板层骨，使得该时间点（CHA+VEGF+FS）侧新生骨较成熟。术后6个月，（CHA+VEGF+FS）侧和（CHA+FS）侧天狼星红染色显示红染面积占测量区面积的百分比均较术后3个月时增大，且红染加深，胶原形态逐渐也趋于正常骨组织，同时HE染色也显示两组并无明显差异，表明新生骨改建逐渐趋于成熟，提示骨再生过程逐渐完成。发现术后前3个月是影响珊瑚人工骨成骨的关键时期，而通过VEGF的引入对加快珊瑚人工骨的骨生成过程有着确切的积极作用。
4 结论
本实验通过组织学观察发现CHA+VEGF+FS复合物早期血管化程度高，在骨再生的过程中更早地实现骨成熟。论证了下颌骨外板劈开，CHA+VEGF+FS复合物植入术可以作为矫治半侧颜面短小导致的下颌骨发育不良畸形的有效手段之一，为其应用于临床打下基础。 [參考文献]
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[收稿日期]2018-06-11 [修回日期]2018-08-20
編辑/朱婉蓉