【摘 要】
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目的:模拟人椎间盘髓核(nucleus pulposus,NP)酸性环境,研究酸诱导的内质网应激活化以及内质网应激在酸诱导的髓核细胞损伤中的作用机制.方法:体外单层培养人正常髓核细胞(nu
【机 构】
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东南大学附属中大医院脊柱外科中心东南大学医学院 210009 南京市
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目的:模拟人椎间盘髓核(nucleus pulposus,NP)酸性环境,研究酸诱导的内质网应激活化以及内质网应激在酸诱导的髓核细胞损伤中的作用机制.方法:体外单层培养人正常髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)系,以pH值7.4为对照,pH值7.0和6.5分别模拟正常和退变椎间盘酸性环境,培养12～72h,建立酸诱导的髓核细胞损伤模型.采用CCK8法检测髓核细胞增殖情况,透射电镜检测髓核细胞中内质网应激活化情况,免疫荧光检测内质网应激特异性标志物糖调节蛋白78 (78 kDa glucose-regulated protein,GRP78)和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)表达.应用4-PBA(内质网应激阻断剂)阻断内质网应激后,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期;β半乳糖苷酶染色检测细胞老化.Western blot检测LC3、GATA4、p53、p21、p16、Bax、Bcl-2和Caspase3蛋白变化情况.结果:与对照组相比,酸刺激下(pH6.5组)髓核细胞整体增殖力较对照组明显下降;透射电镜下可见内质网扩张明显,膜表面积增加,内质网线粒体膜结构形成,伴线粒体肿胀;细胞免疫荧光检测提示GRP78和CHOP表达明显增加(P＜0.05).应用4-PBA后,细胞凋亡率增加,且能够显著增加酸诱导的G1期停滞及β半乳糖苷酶阳性染色率(P＜0.05).Western blot检测发现,酸刺激下,髓核细胞LC3、GATA4、p53、p21、p16、Bax和Caspase3表达增高(P＜0.05),Bcl-2表达降低(P＜0.05);应用4-PBA后可降低LC3比值和Bcl-2表达水平,并显著升高GATA4、p53、p21、p16、Bax和Caspase3(P＜0.05).结论:酸性微环境能够活化内质网应激,在酸诱导的人髓核细胞急性损伤中起保护作用.
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