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摘要：目的：探讨特应性皮炎(AD)皮损处病原菌分布特点，并检测主要病原菌的药物敏感性。方法：多中心随机双盲对AD患者皮损处采取微生物标本，并收取同期住院的非AD患者皮肤创伤处微生物标本，分别作AD组与对照组，标本接种于血平板、普通巧克力平板和麦康凯平板分区划线分离培养，应用MircoScan walkaway96进行鉴定，并对所分离到的主要病原菌应用微量稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)值，结果按美国临床实验室标准化研究所中的标准，耐甲氧西林用琼脂筛选试验证实(苯唑西林6μg/mL)。结果：于2010年9月-2011年9月从皮肤科门诊343例年龄2～15岁之间AD患者皮损部位获得331株病原菌。AD皮损处细菌检出率为96.5％，其中金葡菌176株占53.2％，其中MRSA65株，所占金葡菌的36.9%；对照组1373例患者分离到的病原菌总1195株，革兰阴性杆菌为主，金黄色葡萄球菌为197株，仅占所有病原菌的16.5%，其中MRSA119株，所占比例高达60.4%。AD组金黄色葡萄球菌感染率远高于对照组(X2=133.38,P<0.001)，但MRSA所占金黄色葡萄球菌的比例却显著低于对照组(X2=39.263,P<0.01)。AD组金黄色葡萄球菌对四环素、克林霉素、庆大、环丙沙星、左旋氧氟沙星、阿莫西林/棒酸、亚胺培南、头胞唑啉和复方新诺明等的耐药率低于对照组，其中AD组MSSA菌株对红霉素、四环素、氯霉素、克林霉素等抗生素MIC均值高于对照组。结论：金葡菌感染与AD病情密切相关，AD患者高比例的金葡菌更可能是社区获得或源自身感染。针对金葡菌感染的AD患者，为保留万古霉素仅用于危及生命的感染，可选用奎奴普丁/达福普汀、利福平、复方新诺明和Linezolid等敏感抗生素控制感染，防止感染灶的扩散与病情加重。
关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 特应性皮炎 金黄色葡萄球菌 超抗原
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1879(2012)08-0001-03
特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一种慢性、瘙痒性、炎症性皮肤病，患者由于皮肤屏障的缺损，皮肤病变部位往往存在微生物感染性因素，常常诱发条件致病菌甚至致病菌的定植与感染，由于尚不确定的因素往往存在金黄色葡萄球菌的定植[1,2]，金黄色葡萄球菌的超抗原和毒素又可加重AD皮肤炎症[3-5]，进一步促进皮肤及软组织感染；近年来AD患者皮肤及软组织金黄色葡萄球菌特别是MRSA的发病率不断攀升引起人们的广泛关注；同时AD患者皮肤慢性炎症灶正成为病原菌特别是金黄色葡萄球菌也是一个重要传染源，对控制社区获得性感染带来很大压力。在亚洲许多国家AD患者金黄色葡萄球菌特别MRSA感染率很少有报到[6]。在中国，近十多年来，我国流行病学调查也显示AD患者皮肤的细菌感染率有升高趋势[7]，其中金黄色葡萄球菌已成为重要的病原体，但本地区AD皮肤感染菌群分布状况、金黄色葡萄球菌在AD皮肤感染中所占地位及其在药敏等方面生物特性尚不清楚。因此，在本研究中，进行小儿AD患者皮肤病变部位的病原菌分布特征、金黄色葡萄球菌定植率及耐药状况等生物学特性的研究，旨在从流行病学角度探讨AD患者皮损处定值的金黄色葡萄球菌生物学特性与药敏模式，以便利用所获信息制定适当的控制措施。
1 材料与方法
1.1 患者与细菌分离。于2010年9月-2011年9月来本院(包括芳村、大学城、二沙和大院等四个三甲分院)皮肤科就诊的患者，依据Hanifin和Rejka的AD诊断标准[8]，选取临床上具有AD的典型症状和体征，年龄2～15岁的患者343名AD患者，病程1至12年；男44例(65.7％)，女23例(34.3％)；其中2～5岁29例(43.3％)，6～10岁18例(26.9％)，11～15岁14例(20.9％)；并收取同期住院、无过敏史的、年龄2～15岁的1373名非AD患者皮肤创伤微生物检测标本，分别作AD组与对照组。首次病原菌分离记录每位患者基本资料以及临床诊断，先前抗生素治疗，住院治疗史和居住地等信息。无菌棉签经无菌生理盐水浸湿后，于AD组与对照组儿童皮损处反复涂擦数次，然后将棉签投入2.5mL稀释液中，反复振荡，取10μL(所收集菌液的1/250)接种，所有标本均接种于血琼脂、普通巧克力和麦康凯琼脂板，在37℃在需氧条件下培养48h。所有菌株均进行选取择正式鉴定板前的基本实验以确定菌属，其中球菌属进行过氧化氢酶和凝固酶实验；革兰阴性杆菌行氧化酶实验。
应用西门子的MicroScan Walkaway 96 system(Dade Behring,West Sacramento,CA)鉴定所分离的细菌。所有经鉴定的菌株被储存在含有15%(vol/vol)甘油的脑心浸液肉汤。
1.2 细菌的抗生素敏感性。抗生素敏感性测定应用Siemens的MIC板(MicroScan Pos Combo 20A；MicroScan Neg MIC 30,Siemens,USA)进行。藥敏结果判定依据临床实验室标准化研究所指南。其中革兰阳性球菌检测庆大霉素，青霉素，苯唑西林，氨苄西林，头孢唑啉，亚胺培南，环丙沙星，氯霉素，左旋氧氟沙星，红霉素，克林霉素，四环素，复方新诺明，哌拉西林/他唑巴坦，利福平，利奈唑胺，喹奴普汀/达福普汀，阿莫西林/棒酸和万古霉素等到抗生素；革兰阴性杆菌检测阿阿米卡星，庆大霉素，氨苄西林，氨苄西林/舒巴坦，哌西林，头孢唑啉，头胞噻肟，头胞他啶，头胞西丁，头胞贡松，氯曲南，亚胺培南，环丙沙星，左旋氧氟沙星，妥布霉素，复方新诺明，替卡西林/棒酸，哌拉西林/他唑巴坦，头胞吡肟和阿莫西林/棒酸等到抗生素。
对于葡萄球菌，用MH平板进行D-test实验，检测红霉素诱导克林霉素耐药性。所有甲氧西林耐药株均用含4% NaCl和(6 μg/ml)oxacillin的Mueller–Hinton琼脂平板进行琼脂筛选试验证实，同时用甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌株NCTC 6571与耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌株 NCTC 12493进行质控。 1.3 统计分析。数据分析使用SPSS 13.0软件统计(SPSS 13.0 Command Syntax Reference.SPSS Inc.,Chicago,2004)，计量资料的比较采用配对t检验，计数资料的比较采用卡方检验。不同组别间的金黄色葡萄球菌耐药性差异的显著性评估用卡方检验。P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 菌群分布及构成比。从343名AD组患者皮损部位共分离培养出细菌331株，患者细菌定植率为96.5％；331株细菌中，包括金葡菌176株占53.2％，其中65株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)占金葡菌总数的36.9%。铜绿假单胞菌22株占6.6％，大肠杆菌20株占6.0％，表葡菌17株占5.1％，肺炎克雷伯菌17株占5.1％，白色假丝酵母菌10株占3.0％，鲍曼不动杆菌9株占2.7％，其他菌60株占19.0％。同期对照组患者分离到的病原菌总1195株，以大肠埃希菌382株、铜绿假单胞菌239株、肺炎克雷伯菌205株等革兰阴性杆菌为主，共占69.1%。金黄色葡萄球菌197株，占16.5%，MRSA119株，所占比例高达60.4%。其它菌172株，占14.4%。AD组金黄色葡萄球菌感染率远高于对照组(X2=133.38，P=0.000)，而MRSA的比例却显著低于对照组(X2=39.263，P<0.01)。
2.2 金黄色葡萄球菌的抗生素耐药率。AD组金黄色葡萄球菌所有菌株中，对青霉素和氨苄西林耐药率>75%，产β-内酰胺酶株达91%；对红霉素耐药率>50%，对四环素、克林霉素和庆大霉素耐药率>30%，环丙沙星、左旋氧氟沙星、阿莫西林/棒酸、亚胺培南、氯霉素、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑啉、利福平、喹奴普汀/达福普汀、复方新诺明耐药率<30%，未见对利奈唑胺和万古霉素耐药的菌株。而对照组金黄色葡萄球菌所有菌株中，97%为产β-内酰胺酶株，其中对氨苄西林和青霉素耐药率分别为97.4%和97%，对红霉素、环丙沙星、左旋氧氟沙星、四环素、庆大霉素和克林霉素耐药率>50%，对阿莫西林/棒酸、亚胺培南和头孢唑啉耐药率>30%，而对复方新诺明，氯霉素，利福平，哌拉西林/他唑巴坦，喹奴普汀/达福普汀耐药率<30%，也未发现利奈唑胺和万古霉素的耐药株。具体两组间金黄色葡萄球菌对各主要抗生素的耐药率对比如下图1。
依据对甲氧西林敏感性，两组金黄色葡萄球菌分别分为甲氧西林敏感组（MSSA）与甲氧西林耐药组(MRSA)。其中AD组有111株MSSA，MRSA为65株；对照组中197株S.aureus中，MSSA菌为76株，MRSA菌为119株。
卡方检验结果显示，AD组和对照组的MSSA对氨卞西林(X2=2.443,P=0.118)、红霉素(X2=1.572,P=0.210)、环丙沙星(X2=3.250,P=0.071)、左氧(X2=2.358,P=0.125)、庆大霉素(X2=0.171,P=0.679)、氯霉素(X2=2.093,P=0.148)、利福平(X2=0.246,P=0.620)、奎奴普丁/达福普汀、利奈唑胺和万古霉素等抗生素的耐药率不存在差异；然而非AD组MSSA对克林霉素(X2=5.342,P=0.021)、红霉素(X2=3.919,P=0.048)、青霉素G(X2=4.121,P=0.042)耐药率显著低于AD组MSSA。其中AD组MSSA菌株对氨苄西林与青霉素G耐药率超过75%，对红霉素、四环素和克林霉素耐药率<50%，对氯霉素、庆大霉素、左旋氧氟沙星、环丙沙星、利福平、哌拉西林/他唑巴坦和复方新诺明耐药率<30%，AD组所有MSSA菌株对奎奴普丁/达福普汀、利奈唑胺和万古霉素均敏感，AD组MSSA株相对于MRSA株，克林霉素、红霉素和四环素的MIC50分别从0.5mg/L、0.5mg/L、4.0mg/L增加到了4.0mg/L、8.0mg/L、16.0mg/L；但对照组MSSA菌株对氨苄西林与青霉素G耐药率超过90%，对红霉素耐药率为30.5%，对其余抗生素耐药率均<30%，其中对利奈唑胺与万古霉素全部敏感。相对于对照组MSSA菌株对庆大霉素MIC50=1.0mg/L、MIC90=8.0mg/L，AD组MSSA菌株的MIC50=16.0mg/L、MIC90=16.0mg/L，AD组MSSA菌株对庆大霉素显著较均对照组MSSA菌株耐药。AD组与对照组的MSSA株对各主要抗生素的敏感性见图2。
AD组和对照组MRSA对不同抗生素耐药率比对检验结果显示，对照组MRSA对克林霉素(X2=8.454,P=0.004)、四环素(X2=4.827,P=0.028)、环丙沙星(X2=22.699,P=0.000)、左氧氟沙星(X2=24.621,P=0.000)、慶大霉素(X2=4.546,P=0.033)、红霉素(X2=6.295,P=0.011)等抗生素的耐药率明显高于AD组MRSA菌株。其中AD组MRSA菌株对红霉素、庆大霉素耐药率超过75%，对左旋氧氟沙星、环丙沙星、四环素、克林霉素耐药率超过50%，而对奎奴普丁/达福普汀、利福平和氯霉素耐药率低于30%，对复方新诺明、利奈唑胺和万古霉素尚未出现耐药株。对照组的MRSA菌株对红霉素、庆大霉素、左旋氧氟沙星、环丙沙星、四环素和克林霉素的耐药率超过75%，但奎奴普丁/达福普汀、利福平、氯霉素和复方新诺明耐药率低于30%，同样尚无耐利奈唑胺和万古霉素的菌株出现，具体见图4。各主要抗生素对两组MRSA的MIC均值、MIC范围、MIC50、MIC90见图3。相对于对照组的MRSA菌株，AD组的MRSA菌株表现出对奎奴普丁/达福普汀耐药性有所升高(MIC50=1.0mg/L、MIC90=2.0mg/L)。
综合来看，AD患者组的MRSA与MSSA菌株对奎奴普丁/达福普汀、利福平、复方新诺明、利奈唑胺和万古霉素均非常敏感。
3 讨论
特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一种慢性、瘙痒性、炎症性皮肤病；继发微生物感染，可进一步加重本病。国外报道[1-3,5]在AD皮损处，金葡菌的检出率高达76％～100％，患者外观正常皮肤上仅检出率为2％～25％。金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)具有分泌超抗原、溶细胞素等多种成份[3-5]。α-毒素，溶细胞素破坏局部组织，超抗原可与IgE-FcεRI结合并形成复合物，激发局部组织肥大细胞释放组胺等炎症介质，引起瘙痒和炎症反应，加重病情，并在皮肤炎症的持续和反复发作过程中起重要作用[1-4]。近十多年来，我国特别是南方地区，因气候、环境等多因素，儿童AD发病率明显上升，部分患者甚至出现继发败血症性休克、组织坏死等严重并发症[2-4]。因此，检测并分析南方地区儿童AD患者皮损局部微生物分布及其主要病原菌的药敏等生物学特性对防治AD感染，控制病情具有重要意义。 本研究的AD组皮损部位共分离出的331株细菌中，主要为金葡菌176株(53.2％)，阳性率略低于国外报道，却显著高于同期对照组所有分离的病原菌中金黄色葡萄球菌所占例16.5%，提示金葡菌感染在AD的发病及疾病的持续和反复发作过程中起着更为重要的作用。的确，AD患者正常皮肤破坏，表皮剥脱，角质层破坏，使细胞外基质(excellular matrix，ECM)蛋白如纤维结合素和层粘连蛋白得以暴露[3,5]。金葡菌细胞壁上存在与不同组织的上皮细胞起作用的蛋白，称为微生物识别粘附基质分子的表面成分(microbial surface components recognizing adhesive matrix moleculars，MSCRAMMs)，如金葡菌蛋白A、层粘连蛋白结合蛋白A和B、纤维蛋白原结合蛋白、纤维结合素结合蛋白、胶原结合素等[5]，这些表面分子与皮肤中的ECM蛋白有高度的亲和力，通过表面蛋白，金葡菌易于粘附到受损皮肤组织中，进而定植与感染；同时，局部炎症可诱导大量前炎症因子释放，高水平TNF-a和T细胞生长因子上调皮肤中的层粘连蛋白和胶原，进一步增加对金葡菌的粘附[3-5]。另一方面，具有抗细菌的作用皮肤表面脂质成份(游离脂肪酸)因表皮剥脱与角质层破坏而丢失，也有利于金葡菌可侵入皮肤[8,9]。局部定值的金葡菌细胞还可以通过与角质形成细胞间的一些原纤维和无定形物质可形成细菌生物膜，导致金葡菌粘附与规避机体炎症细胞的呑噬，而利于细菌繁殖[2-5]。金葡菌还可以分泌具有超抗原作用的外毒素，这些外毒素包括金葡菌肠毒素A-D(SEA-D)、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)及表皮剥脱毒素，它们通过激活多克隆T细胞产生外毒素特异性IgE抗体加剧和持续与AD相关的炎症[3-5]。此外，外毒素穿过表皮破损处，还可通过传统抗原机制激活抗原特异性T细胞或在体内诱导产生特异性IgE，使嗜碱细胞和肥大细胞脱颗粒，释放组胺等炎症介质，引起迟发性超敏反应，加重AD相关的炎症[2-4]。以上因素，有利于金葡萄菌在皮损炎症部位有效定植与增殖。近来有研究发现，AD发病时，皮肤Th2型炎症反应环境可以促进金葡菌与纤维连接蛋白的粘连，从免疫学机制上为金葡菌与AD相关性也提供了依据[2-5]。
与对照组相比，两组大多数金黄色葡萄球菌株均产β-内酰胺酶，因此对青霉素和氨苄青霉素耐药率均高达90%以上；但AD组耐甲氧西林金黄色葡萄菌（MRSA）占检出金黄色葡萄菌比率(36.9%)低于对照组60.4%。Higaki等检测一组AD患儿颊部和鼻腔部位的葡萄球菌，结果10例AD患儿9例颊部检出金葡菌，7例鼻腔检出金葡菌[1-5]；健康对照组8例中仅1例颊部检出金葡菌，鼻腔无一例检出金葡菌，噬菌体分型技术证明鼻腔、指甲下和皮损中金葡菌类型一致；Seigaar对AD的随访发现，在164次AD发作中有97％与金葡菌感染有关，AD患者未受累皮肤金葡菌的分离率达70％，慢性湿疹样皮损区为90％，渗出性皮损区为100％[2-4]。有报道显示在本地区社区获得性肺炎中，MRSA占检出的金黄色葡萄菌的38%，AD组中MRSA占检出金黄色葡萄菌比率(36.9%)与这一比例相当，提示AD患者的金黄色葡萄菌主要来源并非院内感染所致，多数可能源于自身感染或为社区获得性。
进一步我们比较了对照组与AD组间的金黄色葡萄菌对主要抗生素的MIC均值，虽然两组虽有一定的差异(见图1)，但这种差异更可能是由于MRSA菌株与MSSA菌株构成比不同所致。依据对耐甲氧西林的敏感性把两组的金葡菌进一步分为MSSA菌株组与MRSA菌株组，再行药敏分析结果显示：AD组的MSSA组与对照组的MSSA组相比，对红霉素、四环素、克林霉素、氯霉素和庆大霉素的耐药率高，而左旋氧氟沙星与环丙沙星等到氟喹诺酮类抗菌素显示出良好的抗菌活性。MRSA菌株相对于MSSA菌株多耐现象更为多见，因为耐甲氧西林的金黄色葡萄菌对氟喹诺酮类，大环内酯类，氨基糖苷类，四环素和利福平等抗生素也常常耐药。我们的研究结果也显示了MRSA菌株对红霉素、四环素、利福平、庆大霉素和氯霉素耐药性率均超过50%，但AD组的MRSA株对红霉素、慶大霉素、左旋氧氟沙星、环丙沙星、克林霉素、四环素和氯霉素等抗生素的耐药率低于对照组的MRSA株。这些抗生素主要是干扰蛋白质的合成其中红霉素、克林霉素、氯霉素主要与核糖体50S亚单位结合，抑制肽链的延长，从而抑制细菌生长；庆大霉素、四环素则主要与核糖体30S亚单位结合，抑制肽链的延长或致核糖体结构改变，致蛋白合成异常。左旋氧氟沙星、环丙沙星快速抑制DNA合成，调节DNA起始复制和翻译的拓朴异构酶，最终阻止核糖体的蛋白合成；干扰蛋白质合成意味着细胞存活所必需的酶不能被合成，但AD组的MRSA株表现出对干扰蛋白质合成的抗生素敏感率较高是何因素，目前尚不清楚，有待进一步研究。
综合MSSA与MRSA菌株的药敏结果可以发现，万古霉素保持着非常理想的抗菌活性，一直无耐万古霉素的金黄色葡萄球菌出现；同时，可能是因为临床上应用较少，AD组与对照组的金黄色葡萄菌对利福平、复方新诺明以及新近进入临床的利奈唑胺和喹诺普汀/达福普汀保持着极低的耐药水平。在治疗金黄色葡萄菌尤其在治疗MRSA严重皮肤感染时，尤其是当药敏结果尚不清楚之前，为保留万古霉素仅用于危及生命的感染，奎奴普汀/达福普汀、利奈唑胺、利福平和复方新诺明是除万古霉素以外最有希望的、可供选择的、用于治疗AD患者金黄色葡萄球菌皮肤重症感染的抗生素[8,9]。
参考文献
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关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 特应性皮炎 金黄色葡萄球菌 超抗原
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1879(2012)08-0001-03
特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一种慢性、瘙痒性、炎症性皮肤病，患者由于皮肤屏障的缺损，皮肤病变部位往往存在微生物感染性因素，常常诱发条件致病菌甚至致病菌的定植与感染，由于尚不确定的因素往往存在金黄色葡萄球菌的定植[1,2]，金黄色葡萄球菌的超抗原和毒素又可加重AD皮肤炎症[3-5]，进一步促进皮肤及软组织感染；近年来AD患者皮肤及软组织金黄色葡萄球菌特别是MRSA的发病率不断攀升引起人们的广泛关注；同时AD患者皮肤慢性炎症灶正成为病原菌特别是金黄色葡萄球菌也是一个重要传染源，对控制社区获得性感染带来很大压力。在亚洲许多国家AD患者金黄色葡萄球菌特别MRSA感染率很少有报到[6]。在中国，近十多年来，我国流行病学调查也显示AD患者皮肤的细菌感染率有升高趋势[7]，其中金黄色葡萄球菌已成为重要的病原体，但本地区AD皮肤感染菌群分布状况、金黄色葡萄球菌在AD皮肤感染中所占地位及其在药敏等方面生物特性尚不清楚。因此，在本研究中，进行小儿AD患者皮肤病变部位的病原菌分布特征、金黄色葡萄球菌定植率及耐药状况等生物学特性的研究，旨在从流行病学角度探讨AD患者皮损处定值的金黄色葡萄球菌生物学特性与药敏模式，以便利用所获信息制定适当的控制措施。
1 材料与方法
1.1 患者与细菌分离。于2010年9月-2011年9月来本院(包括芳村、大学城、二沙和大院等四个三甲分院)皮肤科就诊的患者，依据Hanifin和Rejka的AD诊断标准[8]，选取临床上具有AD的典型症状和体征，年龄2～15岁的患者343名AD患者，病程1至12年；男44例(65.7％)，女23例(34.3％)；其中2～5岁29例(43.3％)，6～10岁18例(26.9％)，11～15岁14例(20.9％)；并收取同期住院、无过敏史的、年龄2～15岁的1373名非AD患者皮肤创伤微生物检测标本，分别作AD组与对照组。首次病原菌分离记录每位患者基本资料以及临床诊断，先前抗生素治疗，住院治疗史和居住地等信息。无菌棉签经无菌生理盐水浸湿后，于AD组与对照组儿童皮损处反复涂擦数次，然后将棉签投入2.5mL稀释液中，反复振荡，取10μL(所收集菌液的1/250)接种，所有标本均接种于血琼脂、普通巧克力和麦康凯琼脂板，在37℃在需氧条件下培养48h。所有菌株均进行选取择正式鉴定板前的基本实验以确定菌属，其中球菌属进行过氧化氢酶和凝固酶实验；革兰阴性杆菌行氧化酶实验。
应用西门子的MicroScan Walkaway 96 system(Dade Behring,West Sacramento,CA)鉴定所分离的细菌。所有经鉴定的菌株被储存在含有15%(vol/vol)甘油的脑心浸液肉汤。
1.2 细菌的抗生素敏感性。抗生素敏感性测定应用Siemens的MIC板(MicroScan Pos Combo 20A；MicroScan Neg MIC 30,Siemens,USA)进行。藥敏结果判定依据临床实验室标准化研究所指南。其中革兰阳性球菌检测庆大霉素，青霉素，苯唑西林，氨苄西林，头孢唑啉，亚胺培南，环丙沙星，氯霉素，左旋氧氟沙星，红霉素，克林霉素，四环素，复方新诺明，哌拉西林/他唑巴坦，利福平，利奈唑胺，喹奴普汀/达福普汀，阿莫西林/棒酸和万古霉素等到抗生素；革兰阴性杆菌检测阿阿米卡星，庆大霉素，氨苄西林，氨苄西林/舒巴坦，哌西林，头孢唑啉，头胞噻肟，头胞他啶，头胞西丁，头胞贡松，氯曲南，亚胺培南，环丙沙星，左旋氧氟沙星，妥布霉素，复方新诺明，替卡西林/棒酸，哌拉西林/他唑巴坦，头胞吡肟和阿莫西林/棒酸等到抗生素。
对于葡萄球菌，用MH平板进行D-test实验，检测红霉素诱导克林霉素耐药性。所有甲氧西林耐药株均用含4% NaCl和(6 μg/ml)oxacillin的Mueller–Hinton琼脂平板进行琼脂筛选试验证实，同时用甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌株NCTC 6571与耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌株 NCTC 12493进行质控。 1.3 统计分析。数据分析使用SPSS 13.0软件统计(SPSS 13.0 Command Syntax Reference.SPSS Inc.,Chicago,2004)，计量资料的比较采用配对t检验，计数资料的比较采用卡方检验。不同组别间的金黄色葡萄球菌耐药性差异的显著性评估用卡方检验。P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 菌群分布及构成比。从343名AD组患者皮损部位共分离培养出细菌331株，患者细菌定植率为96.5％；331株细菌中，包括金葡菌176株占53.2％，其中65株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)占金葡菌总数的36.9%。铜绿假单胞菌22株占6.6％，大肠杆菌20株占6.0％，表葡菌17株占5.1％，肺炎克雷伯菌17株占5.1％，白色假丝酵母菌10株占3.0％，鲍曼不动杆菌9株占2.7％，其他菌60株占19.0％。同期对照组患者分离到的病原菌总1195株，以大肠埃希菌382株、铜绿假单胞菌239株、肺炎克雷伯菌205株等革兰阴性杆菌为主，共占69.1%。金黄色葡萄球菌197株，占16.5%，MRSA119株，所占比例高达60.4%。其它菌172株，占14.4%。AD组金黄色葡萄球菌感染率远高于对照组(X2=133.38，P=0.000)，而MRSA的比例却显著低于对照组(X2=39.263，P<0.01)。
2.2 金黄色葡萄球菌的抗生素耐药率。AD组金黄色葡萄球菌所有菌株中，对青霉素和氨苄西林耐药率>75%，产β-内酰胺酶株达91%；对红霉素耐药率>50%，对四环素、克林霉素和庆大霉素耐药率>30%，环丙沙星、左旋氧氟沙星、阿莫西林/棒酸、亚胺培南、氯霉素、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑啉、利福平、喹奴普汀/达福普汀、复方新诺明耐药率<30%，未见对利奈唑胺和万古霉素耐药的菌株。而对照组金黄色葡萄球菌所有菌株中，97%为产β-内酰胺酶株，其中对氨苄西林和青霉素耐药率分别为97.4%和97%，对红霉素、环丙沙星、左旋氧氟沙星、四环素、庆大霉素和克林霉素耐药率>50%，对阿莫西林/棒酸、亚胺培南和头孢唑啉耐药率>30%，而对复方新诺明，氯霉素，利福平，哌拉西林/他唑巴坦，喹奴普汀/达福普汀耐药率<30%，也未发现利奈唑胺和万古霉素的耐药株。具体两组间金黄色葡萄球菌对各主要抗生素的耐药率对比如下图1。
依据对甲氧西林敏感性，两组金黄色葡萄球菌分别分为甲氧西林敏感组（MSSA）与甲氧西林耐药组(MRSA)。其中AD组有111株MSSA，MRSA为65株；对照组中197株S.aureus中，MSSA菌为76株，MRSA菌为119株。
卡方检验结果显示，AD组和对照组的MSSA对氨卞西林(X2=2.443,P=0.118)、红霉素(X2=1.572,P=0.210)、环丙沙星(X2=3.250,P=0.071)、左氧(X2=2.358,P=0.125)、庆大霉素(X2=0.171,P=0.679)、氯霉素(X2=2.093,P=0.148)、利福平(X2=0.246,P=0.620)、奎奴普丁/达福普汀、利奈唑胺和万古霉素等抗生素的耐药率不存在差异；然而非AD组MSSA对克林霉素(X2=5.342,P=0.021)、红霉素(X2=3.919,P=0.048)、青霉素G(X2=4.121,P=0.042)耐药率显著低于AD组MSSA。其中AD组MSSA菌株对氨苄西林与青霉素G耐药率超过75%，对红霉素、四环素和克林霉素耐药率<50%，对氯霉素、庆大霉素、左旋氧氟沙星、环丙沙星、利福平、哌拉西林/他唑巴坦和复方新诺明耐药率<30%，AD组所有MSSA菌株对奎奴普丁/达福普汀、利奈唑胺和万古霉素均敏感，AD组MSSA株相对于MRSA株，克林霉素、红霉素和四环素的MIC50分别从0.5mg/L、0.5mg/L、4.0mg/L增加到了4.0mg/L、8.0mg/L、16.0mg/L；但对照组MSSA菌株对氨苄西林与青霉素G耐药率超过90%，对红霉素耐药率为30.5%，对其余抗生素耐药率均<30%，其中对利奈唑胺与万古霉素全部敏感。相对于对照组MSSA菌株对庆大霉素MIC50=1.0mg/L、MIC90=8.0mg/L，AD组MSSA菌株的MIC50=16.0mg/L、MIC90=16.0mg/L，AD组MSSA菌株对庆大霉素显著较均对照组MSSA菌株耐药。AD组与对照组的MSSA株对各主要抗生素的敏感性见图2。
AD组和对照组MRSA对不同抗生素耐药率比对检验结果显示，对照组MRSA对克林霉素(X2=8.454,P=0.004)、四环素(X2=4.827,P=0.028)、环丙沙星(X2=22.699,P=0.000)、左氧氟沙星(X2=24.621,P=0.000)、慶大霉素(X2=4.546,P=0.033)、红霉素(X2=6.295,P=0.011)等抗生素的耐药率明显高于AD组MRSA菌株。其中AD组MRSA菌株对红霉素、庆大霉素耐药率超过75%，对左旋氧氟沙星、环丙沙星、四环素、克林霉素耐药率超过50%，而对奎奴普丁/达福普汀、利福平和氯霉素耐药率低于30%，对复方新诺明、利奈唑胺和万古霉素尚未出现耐药株。对照组的MRSA菌株对红霉素、庆大霉素、左旋氧氟沙星、环丙沙星、四环素和克林霉素的耐药率超过75%，但奎奴普丁/达福普汀、利福平、氯霉素和复方新诺明耐药率低于30%，同样尚无耐利奈唑胺和万古霉素的菌株出现，具体见图4。各主要抗生素对两组MRSA的MIC均值、MIC范围、MIC50、MIC90见图3。相对于对照组的MRSA菌株，AD组的MRSA菌株表现出对奎奴普丁/达福普汀耐药性有所升高(MIC50=1.0mg/L、MIC90=2.0mg/L)。
综合来看，AD患者组的MRSA与MSSA菌株对奎奴普丁/达福普汀、利福平、复方新诺明、利奈唑胺和万古霉素均非常敏感。
3 讨论
特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一种慢性、瘙痒性、炎症性皮肤病；继发微生物感染，可进一步加重本病。国外报道[1-3,5]在AD皮损处，金葡菌的检出率高达76％～100％，患者外观正常皮肤上仅检出率为2％～25％。金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)具有分泌超抗原、溶细胞素等多种成份[3-5]。α-毒素，溶细胞素破坏局部组织，超抗原可与IgE-FcεRI结合并形成复合物，激发局部组织肥大细胞释放组胺等炎症介质，引起瘙痒和炎症反应，加重病情，并在皮肤炎症的持续和反复发作过程中起重要作用[1-4]。近十多年来，我国特别是南方地区，因气候、环境等多因素，儿童AD发病率明显上升，部分患者甚至出现继发败血症性休克、组织坏死等严重并发症[2-4]。因此，检测并分析南方地区儿童AD患者皮损局部微生物分布及其主要病原菌的药敏等生物学特性对防治AD感染，控制病情具有重要意义。 本研究的AD组皮损部位共分离出的331株细菌中，主要为金葡菌176株(53.2％)，阳性率略低于国外报道，却显著高于同期对照组所有分离的病原菌中金黄色葡萄球菌所占例16.5%，提示金葡菌感染在AD的发病及疾病的持续和反复发作过程中起着更为重要的作用。的确，AD患者正常皮肤破坏，表皮剥脱，角质层破坏，使细胞外基质(excellular matrix，ECM)蛋白如纤维结合素和层粘连蛋白得以暴露[3,5]。金葡菌细胞壁上存在与不同组织的上皮细胞起作用的蛋白，称为微生物识别粘附基质分子的表面成分(microbial surface components recognizing adhesive matrix moleculars，MSCRAMMs)，如金葡菌蛋白A、层粘连蛋白结合蛋白A和B、纤维蛋白原结合蛋白、纤维结合素结合蛋白、胶原结合素等[5]，这些表面分子与皮肤中的ECM蛋白有高度的亲和力，通过表面蛋白，金葡菌易于粘附到受损皮肤组织中，进而定植与感染；同时，局部炎症可诱导大量前炎症因子释放，高水平TNF-a和T细胞生长因子上调皮肤中的层粘连蛋白和胶原，进一步增加对金葡菌的粘附[3-5]。另一方面，具有抗细菌的作用皮肤表面脂质成份(游离脂肪酸)因表皮剥脱与角质层破坏而丢失，也有利于金葡菌可侵入皮肤[8,9]。局部定值的金葡菌细胞还可以通过与角质形成细胞间的一些原纤维和无定形物质可形成细菌生物膜，导致金葡菌粘附与规避机体炎症细胞的呑噬，而利于细菌繁殖[2-5]。金葡菌还可以分泌具有超抗原作用的外毒素，这些外毒素包括金葡菌肠毒素A-D(SEA-D)、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)及表皮剥脱毒素，它们通过激活多克隆T细胞产生外毒素特异性IgE抗体加剧和持续与AD相关的炎症[3-5]。此外，外毒素穿过表皮破损处，还可通过传统抗原机制激活抗原特异性T细胞或在体内诱导产生特异性IgE，使嗜碱细胞和肥大细胞脱颗粒，释放组胺等炎症介质，引起迟发性超敏反应，加重AD相关的炎症[2-4]。以上因素，有利于金葡萄菌在皮损炎症部位有效定植与增殖。近来有研究发现，AD发病时，皮肤Th2型炎症反应环境可以促进金葡菌与纤维连接蛋白的粘连，从免疫学机制上为金葡菌与AD相关性也提供了依据[2-5]。
与对照组相比，两组大多数金黄色葡萄球菌株均产β-内酰胺酶，因此对青霉素和氨苄青霉素耐药率均高达90%以上；但AD组耐甲氧西林金黄色葡萄菌（MRSA）占检出金黄色葡萄菌比率(36.9%)低于对照组60.4%。Higaki等检测一组AD患儿颊部和鼻腔部位的葡萄球菌，结果10例AD患儿9例颊部检出金葡菌，7例鼻腔检出金葡菌[1-5]；健康对照组8例中仅1例颊部检出金葡菌，鼻腔无一例检出金葡菌，噬菌体分型技术证明鼻腔、指甲下和皮损中金葡菌类型一致；Seigaar对AD的随访发现，在164次AD发作中有97％与金葡菌感染有关，AD患者未受累皮肤金葡菌的分离率达70％，慢性湿疹样皮损区为90％，渗出性皮损区为100％[2-4]。有报道显示在本地区社区获得性肺炎中，MRSA占检出的金黄色葡萄菌的38%，AD组中MRSA占检出金黄色葡萄菌比率(36.9%)与这一比例相当，提示AD患者的金黄色葡萄菌主要来源并非院内感染所致，多数可能源于自身感染或为社区获得性。
进一步我们比较了对照组与AD组间的金黄色葡萄菌对主要抗生素的MIC均值，虽然两组虽有一定的差异(见图1)，但这种差异更可能是由于MRSA菌株与MSSA菌株构成比不同所致。依据对耐甲氧西林的敏感性把两组的金葡菌进一步分为MSSA菌株组与MRSA菌株组，再行药敏分析结果显示：AD组的MSSA组与对照组的MSSA组相比，对红霉素、四环素、克林霉素、氯霉素和庆大霉素的耐药率高，而左旋氧氟沙星与环丙沙星等到氟喹诺酮类抗菌素显示出良好的抗菌活性。MRSA菌株相对于MSSA菌株多耐现象更为多见，因为耐甲氧西林的金黄色葡萄菌对氟喹诺酮类，大环内酯类，氨基糖苷类，四环素和利福平等抗生素也常常耐药。我们的研究结果也显示了MRSA菌株对红霉素、四环素、利福平、庆大霉素和氯霉素耐药性率均超过50%，但AD组的MRSA株对红霉素、慶大霉素、左旋氧氟沙星、环丙沙星、克林霉素、四环素和氯霉素等抗生素的耐药率低于对照组的MRSA株。这些抗生素主要是干扰蛋白质的合成其中红霉素、克林霉素、氯霉素主要与核糖体50S亚单位结合，抑制肽链的延长，从而抑制细菌生长；庆大霉素、四环素则主要与核糖体30S亚单位结合，抑制肽链的延长或致核糖体结构改变，致蛋白合成异常。左旋氧氟沙星、环丙沙星快速抑制DNA合成，调节DNA起始复制和翻译的拓朴异构酶，最终阻止核糖体的蛋白合成；干扰蛋白质合成意味着细胞存活所必需的酶不能被合成，但AD组的MRSA株表现出对干扰蛋白质合成的抗生素敏感率较高是何因素，目前尚不清楚，有待进一步研究。
综合MSSA与MRSA菌株的药敏结果可以发现，万古霉素保持着非常理想的抗菌活性，一直无耐万古霉素的金黄色葡萄球菌出现；同时，可能是因为临床上应用较少，AD组与对照组的金黄色葡萄菌对利福平、复方新诺明以及新近进入临床的利奈唑胺和喹诺普汀/达福普汀保持着极低的耐药水平。在治疗金黄色葡萄菌尤其在治疗MRSA严重皮肤感染时，尤其是当药敏结果尚不清楚之前，为保留万古霉素仅用于危及生命的感染，奎奴普汀/达福普汀、利奈唑胺、利福平和复方新诺明是除万古霉素以外最有希望的、可供选择的、用于治疗AD患者金黄色葡萄球菌皮肤重症感染的抗生素[8,9]。
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