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摘要
[目的]观察胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat）特异性成分甘草查尔酮A在全草中的分布情况。[方法]利用超声辅助的乙醇提取法制备新疆胀果甘草根、茎、叶和种子的提取物；利用硅胶薄层色谱法分析以上4种样品的斑点特征；利用制备薄层法分离薄层板上的特殊斑点并对所分离的单体成分进行结构分析。[结果]胀果甘草乙醇提取物在展开剂为乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸（6∶4∶1）的薄层色谱条件下所显示的一种特殊亮黄色斑点被鉴定为甘草查尔酮A，此斑点仅存在于胀果甘草根和茎的提取物中，而不存在于叶和种子提取物中。[结论]甘草查尔酮A在甘草中主要分布在根和茎中。此结果为胀果甘草茎的药用开发及胀果甘草的快速品种鉴定奠定了一定的基础。
关键词胀果甘草；甘草查尔酮A； 鉴定分析；甘草全草
中图分类号S567.7+1文献标识码A文章编号0517-6611（2015）26-064-03
Abstract[Objective] To observe the distribution of licochalcone A （LicoA） in the whole plant of Glycyrrhiza inflata Bat （GIB）. [Method] The extracts of the root， stem， leaf and seed of GIB plant were prepared by using the ultrasonic assisted ethanol extraction method； their silica gel thin-layer chromatographic （TLC） characteristics were analyzed； the special TLC spot was isolated and structurally characterized. [Result] The special TLC spots of GIB ethanol extract was characterized by mobile phase of acetic acetate/petroleum ether/methyl acetate （6∶4∶1） and identified as licochalcone A， which was found in GIB root and stem， but not found in leaf and seed. [Conclusion] Licochalcone A is mainly distributed in the root and stem of Glycyrrhiza inflata Bats. This result could provide useful information for the research and medicinal development of the stem of Glycyrrhiza inflata Bat and rapid identification of licorice specie.
Key words Glycyrrhiza inflata Bat； Licochalcone A； Identification and analysis； Whole plant of licorice
甘草在我国药用历史悠久，在传统医学中广泛应用。中医学认为甘草有益气补中、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效。甘草的品种较多，而《中国药典》（2010 年版一部）记载其原植物有 3 种，即乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat）和光果甘草（Glycyrrhiza glabra L），其中胀果甘草在新疆、甘肃等西部地区分布资源较为丰富[1]。
甘草的化学成分是其药用功效的主要物质基础。国内外已从甘草中分离出100多种黄酮类化合物、60多种三萜类化合物以及香豆素类、生物碱类、有机酸类等成分[2]。因不同种类甘草的化学成分有一定的区别，而其药用价值可能不完全相同。因此其品种鉴定是非常重要的。
甘草查尔酮A （Licochalcone A，LicoA）是甘草中的一种查尔酮类化合物，被视为胀果甘草的种属特异性成分，主要存在于胀果甘草中[3]。近期的药理学和生物学研究表明，LicoA具有抗氧化[4]、抗炎[5]、抗菌[6]、抗肿瘤[7]和调节免疫[8]等多种生物活性，在食品和医药工业中有广泛的用途。近期的试验研究显示，LicoA显示明显的抗前列腺癌和抗乳腺癌活性，并能抑制癌细胞的扩散转移[9-11]，该结果促进了胀果甘草在抗癌新药研究中的潜在价值。然而，LicoA主要存在于胀果甘草根中，且其含量低（约为0.416%）[12]。有学者探索LicoA的人工合成工艺，然而因其结构式较复杂、合成路线较长，且需要用一些昂贵的化学试剂，从而合成成本比天然提取更高[13]，这限制了LicoA的深入药理学研究及应用开发。 为寻找LicoA的新资源或新来源，该研究就LicoA在胀果甘草根、茎、叶和种子中的分布情况进行了观察研究，并探讨甘草全草的综合开发利用思路。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1
药材。新疆胀果甘草（2012年8月分別采集于新疆甘草基地巴楚县），根据药材特征初步鉴定品种，并由新疆医科大学药学院帕丽达·阿不力孜教授进行生药学鉴定为胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat）。
1.1.2
仪器。IR Prestige21红外光谱仪（SHIMADZU），UnityInova600超导核磁共振谱仪（美国Varian公司），AB104N电子天平（MettlerToledo Group），DT200型电子分析天平（常熟市衡器厂），N1001型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司），SK2510HP型数控超声清洗仪（上海科导超声仪有限公司），ZF2C暗箱式紫外分析仪（上海安亭电子仪器厂），WRS1A型数字式熔点测定仪（上海精密科学仪器有限公司）。 1.1.3
试剂。乙酸乙酯、石油醚、无水乙醇、甲酸等均为分析纯；甘草查尔酮A对照品（美国Sigma公司，批号803529），蒸馏水（新疆医科大学蒸馏水供应中心提供），进口硅胶薄层GF254层析板（德国Merck）。
1.2方法
1.2.1
甘草总黄酮提取物的制备。将干燥胀果甘草根、茎、叶和种子分别经粉碎、过20目筛，各取一定量的样品粉末（根1 g、茎3 g、叶和种子各2 g），分别在15 ml的70%乙醇中室温浸泡10 min后，放入水浴锅中，50 ℃下超声10 min，并过滤，得约6 ml的4种供试品溶液，分别编号为T-A（提取物A，根的提取液）、T-B（茎的提取液）、T-C（叶的提取液）和T-D（种子的提取液）。
1.2.2
甘草查尔酮A对照品溶液的制备。精密称取甘草查尔酮A对照品约10 mg，放置10 ml的容量瓶中用70%的乙醇溶解定容，制成浓度为1 mg/ml的对照品溶液备用。
1.2.3
甘草提取物的薄层鉴定。用毛细管将以上所制备的4种样品提取物溶液（T-A、T-B、T-C、T-D）和甘草查尔酮A对照品溶液（LicoA），以体积比乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸（6∶4∶1）混合展开剂进行展开，分别点样于进口硅胶GF-254薄层板上，并在365 nm的紫外灯下观察薄层斑点特征。
1.2.4
胀果甘草提取物中特殊斑点的分离鉴定。根据以上薄层鉴定的结果，先初步观察到胀果甘草根和茎存在LicoA对照品特征的相同样品斑点，再利用制备薄层法，对此种样品斑点进行分离纯化鉴定。具体操作过程：分别称取胀果甘草根和茎的粉末各10 g，分别加在50 ml的70%乙醇中室温浸泡4 h后，放入超声清洗仪，50 ℃的温度下提取30 min，提取2次，并合并过滤，各得约70 ml的提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩至干，得浸膏，利用自制的硅胶制备薄层板（20 cm×20 cm，0.3 mm）进行展开（乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸6∶4∶1），在紫外光365 nm下显色，对甘草查尔酮A斑点的色带标记，并刮取，用甲醇处理，减压浓缩至干，2种样品的黄色提取物固体分别用乙酸乙酯-石油醚重结晶，各得少量亮黄色针状结晶，过滤，干燥，并用光谱方法进行结构鉴定。
2结果与分析
2.1胀果甘草不同部位薄层色谱特征
胀果甘草不同部位乙醇提取物（T-A、T-B、T-C、T-D）的薄层色谱特征如图1所示；这些提取物中根和茎具有与对照物甘草查尔酮A（LicoA）相应的亮黄色荧光斑点（Rf=0.68），即初步证明含有LicoA成分。
2.2单体成分的光谱鉴定结果
经薄层鉴定结果可观察到胀果甘草不同部位的乙醇提取物中，只有根和茎中具有符合于LicoA的1个亮黄色荧光斑点。经过薄层并重结晶的方法得到外观与对照品（LicoA）相似的亮黄色结晶，经过光谱鉴定和理化鉴定后，亮黄色针状结晶，紫外光365 nm下呈亮黄色荧光斑点，易溶于乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，不溶于水，熔点为156.3～158.2 ℃；与FeCl3溶液反应生成黄色沉淀，与盐酸-镁粉反应显微红色，遇到硫酸显桔红色，遇碱性显色试剂显橙色。IR（红外光谱，KBr压片）υ分别为837、904、1 006、1 039、1 078、1 166、1 215、1 261、1 290、1 346、1 446、1 510、1 556、1 587、1 604、1 650、2 964、3 217 cm-1。1H-NMR（核磁共振谱，Varian 600 MHz，CDCl3）δ分别为1.45（6H，s，CH3-4’’，5’’）、2.19（2H，s，OH-4，4’）、3.87（3H，s，OCH3）、5.32（1H，dd，J=10.1Hz，H-3’’）、5.32（1H，dd，J=10.1Hz，H-3’’）、5.35（1H，dd，J=18.1Hz，H-3’’）、6.20（1H，dd，J=18，10Hz，H-2’’）、6.45（1H，s，H-3）、6.96（2H，d，J=8.5Hz，H-3’，5’）、7.47（1H，s，H-6）、7.58（1H，d，J=16Hz，H-α）、7.98（2H，d，J=8.5Hz，H-2’，6’）、8.03（1H，d，J=16Hz，H-β）。NMR图谱中可以观察到1.45（6H，s，CH3-4’’，5’’）为2个甲基的信号，2.19（2H，s，OH-4，4’）是2个酚羟基，3.87（3H，s，OCH3）是一个甲氧基，6.20（1H，dd，J=18，10Hz，H-2’’）、5.35（1H，dd，J=18.1Hz，H-3’’）和5.32（1H，dd，J=10.1Hz，H-3’’）这三组信号还给出一组末端双键质子信息， 7.98（2H，d，J=8.5Hz，H-2’，6’）和8.03（1H，d，J=16Hz，H-β）为典型的查尔酮特征信号。氢谱还给出一组AA’XX’偶合的A环芳氢信号6.96（2H，d，J=8.5Hz，H-3’，5’）和7.98（2H，d，J=8.5Hz，H-2’，6’），以及B環2个孤立芳环质子信号6.45（1H，s，H-3）和7.47（1H，s，H-6）。上述理化鉴定结果与Wanga等[14]的研究结果一致。因此，将此单体成分鉴定为甘草查尔酮A，其化学结构如图2所示。
3讨论
胀果甘草是中国药典收录的甘草品种之一，主要分布于新疆、甘肃、内蒙古一带。近期研究显示，胀果甘草和胀果甘草药渣中的总黄酮具有较强的抗癌活性，其作用机制为诱导肿瘤细胞早期凋亡，经进一步研究显示，其发挥抗肿瘤作用的主要有效成分为LicoA，尤其是宫颈癌细胞对LicoA的抗癌活性更为敏感[15-16]。可见，单体成分LicoA及胀果甘草资源在抗癌新药研究中具有潜在的深入研究价值。然而，LicoA在胀果甘草中的含量很低、人工合成方法的工艺路线复杂、制备成本很高[12-13]，这促使人们寻找LicoA 的新资源和新来源，以便促进相关的药理学研究。
[目的]观察胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat）特异性成分甘草查尔酮A在全草中的分布情况。[方法]利用超声辅助的乙醇提取法制备新疆胀果甘草根、茎、叶和种子的提取物；利用硅胶薄层色谱法分析以上4种样品的斑点特征；利用制备薄层法分离薄层板上的特殊斑点并对所分离的单体成分进行结构分析。[结果]胀果甘草乙醇提取物在展开剂为乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸（6∶4∶1）的薄层色谱条件下所显示的一种特殊亮黄色斑点被鉴定为甘草查尔酮A，此斑点仅存在于胀果甘草根和茎的提取物中，而不存在于叶和种子提取物中。[结论]甘草查尔酮A在甘草中主要分布在根和茎中。此结果为胀果甘草茎的药用开发及胀果甘草的快速品种鉴定奠定了一定的基础。
关键词胀果甘草；甘草查尔酮A； 鉴定分析；甘草全草
中图分类号S567.7+1文献标识码A文章编号0517-6611（2015）26-064-03
Abstract[Objective] To observe the distribution of licochalcone A （LicoA） in the whole plant of Glycyrrhiza inflata Bat （GIB）. [Method] The extracts of the root， stem， leaf and seed of GIB plant were prepared by using the ultrasonic assisted ethanol extraction method； their silica gel thin-layer chromatographic （TLC） characteristics were analyzed； the special TLC spot was isolated and structurally characterized. [Result] The special TLC spots of GIB ethanol extract was characterized by mobile phase of acetic acetate/petroleum ether/methyl acetate （6∶4∶1） and identified as licochalcone A， which was found in GIB root and stem， but not found in leaf and seed. [Conclusion] Licochalcone A is mainly distributed in the root and stem of Glycyrrhiza inflata Bats. This result could provide useful information for the research and medicinal development of the stem of Glycyrrhiza inflata Bat and rapid identification of licorice specie.
Key words Glycyrrhiza inflata Bat； Licochalcone A； Identification and analysis； Whole plant of licorice
甘草在我国药用历史悠久，在传统医学中广泛应用。中医学认为甘草有益气补中、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效。甘草的品种较多，而《中国药典》（2010 年版一部）记载其原植物有 3 种，即乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat）和光果甘草（Glycyrrhiza glabra L），其中胀果甘草在新疆、甘肃等西部地区分布资源较为丰富[1]。
甘草的化学成分是其药用功效的主要物质基础。国内外已从甘草中分离出100多种黄酮类化合物、60多种三萜类化合物以及香豆素类、生物碱类、有机酸类等成分[2]。因不同种类甘草的化学成分有一定的区别，而其药用价值可能不完全相同。因此其品种鉴定是非常重要的。
甘草查尔酮A （Licochalcone A，LicoA）是甘草中的一种查尔酮类化合物，被视为胀果甘草的种属特异性成分，主要存在于胀果甘草中[3]。近期的药理学和生物学研究表明，LicoA具有抗氧化[4]、抗炎[5]、抗菌[6]、抗肿瘤[7]和调节免疫[8]等多种生物活性，在食品和医药工业中有广泛的用途。近期的试验研究显示，LicoA显示明显的抗前列腺癌和抗乳腺癌活性，并能抑制癌细胞的扩散转移[9-11]，该结果促进了胀果甘草在抗癌新药研究中的潜在价值。然而，LicoA主要存在于胀果甘草根中，且其含量低（约为0.416%）[12]。有学者探索LicoA的人工合成工艺，然而因其结构式较复杂、合成路线较长，且需要用一些昂贵的化学试剂，从而合成成本比天然提取更高[13]，这限制了LicoA的深入药理学研究及应用开发。 为寻找LicoA的新资源或新来源，该研究就LicoA在胀果甘草根、茎、叶和种子中的分布情况进行了观察研究，并探讨甘草全草的综合开发利用思路。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1
药材。新疆胀果甘草（2012年8月分別采集于新疆甘草基地巴楚县），根据药材特征初步鉴定品种，并由新疆医科大学药学院帕丽达·阿不力孜教授进行生药学鉴定为胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat）。
1.1.2
仪器。IR Prestige21红外光谱仪（SHIMADZU），UnityInova600超导核磁共振谱仪（美国Varian公司），AB104N电子天平（MettlerToledo Group），DT200型电子分析天平（常熟市衡器厂），N1001型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司），SK2510HP型数控超声清洗仪（上海科导超声仪有限公司），ZF2C暗箱式紫外分析仪（上海安亭电子仪器厂），WRS1A型数字式熔点测定仪（上海精密科学仪器有限公司）。 1.1.3
试剂。乙酸乙酯、石油醚、无水乙醇、甲酸等均为分析纯；甘草查尔酮A对照品（美国Sigma公司，批号803529），蒸馏水（新疆医科大学蒸馏水供应中心提供），进口硅胶薄层GF254层析板（德国Merck）。
1.2方法
1.2.1
甘草总黄酮提取物的制备。将干燥胀果甘草根、茎、叶和种子分别经粉碎、过20目筛，各取一定量的样品粉末（根1 g、茎3 g、叶和种子各2 g），分别在15 ml的70%乙醇中室温浸泡10 min后，放入水浴锅中，50 ℃下超声10 min，并过滤，得约6 ml的4种供试品溶液，分别编号为T-A（提取物A，根的提取液）、T-B（茎的提取液）、T-C（叶的提取液）和T-D（种子的提取液）。
1.2.2
甘草查尔酮A对照品溶液的制备。精密称取甘草查尔酮A对照品约10 mg，放置10 ml的容量瓶中用70%的乙醇溶解定容，制成浓度为1 mg/ml的对照品溶液备用。
1.2.3
甘草提取物的薄层鉴定。用毛细管将以上所制备的4种样品提取物溶液（T-A、T-B、T-C、T-D）和甘草查尔酮A对照品溶液（LicoA），以体积比乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸（6∶4∶1）混合展开剂进行展开，分别点样于进口硅胶GF-254薄层板上，并在365 nm的紫外灯下观察薄层斑点特征。
1.2.4
胀果甘草提取物中特殊斑点的分离鉴定。根据以上薄层鉴定的结果，先初步观察到胀果甘草根和茎存在LicoA对照品特征的相同样品斑点，再利用制备薄层法，对此种样品斑点进行分离纯化鉴定。具体操作过程：分别称取胀果甘草根和茎的粉末各10 g，分别加在50 ml的70%乙醇中室温浸泡4 h后，放入超声清洗仪，50 ℃的温度下提取30 min，提取2次，并合并过滤，各得约70 ml的提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩至干，得浸膏，利用自制的硅胶制备薄层板（20 cm×20 cm，0.3 mm）进行展开（乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸6∶4∶1），在紫外光365 nm下显色，对甘草查尔酮A斑点的色带标记，并刮取，用甲醇处理，减压浓缩至干，2种样品的黄色提取物固体分别用乙酸乙酯-石油醚重结晶，各得少量亮黄色针状结晶，过滤，干燥，并用光谱方法进行结构鉴定。
2结果与分析
2.1胀果甘草不同部位薄层色谱特征
胀果甘草不同部位乙醇提取物（T-A、T-B、T-C、T-D）的薄层色谱特征如图1所示；这些提取物中根和茎具有与对照物甘草查尔酮A（LicoA）相应的亮黄色荧光斑点（Rf=0.68），即初步证明含有LicoA成分。
2.2单体成分的光谱鉴定结果
经薄层鉴定结果可观察到胀果甘草不同部位的乙醇提取物中，只有根和茎中具有符合于LicoA的1个亮黄色荧光斑点。经过薄层并重结晶的方法得到外观与对照品（LicoA）相似的亮黄色结晶，经过光谱鉴定和理化鉴定后，亮黄色针状结晶，紫外光365 nm下呈亮黄色荧光斑点，易溶于乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，不溶于水，熔点为156.3～158.2 ℃；与FeCl3溶液反应生成黄色沉淀，与盐酸-镁粉反应显微红色，遇到硫酸显桔红色，遇碱性显色试剂显橙色。IR（红外光谱，KBr压片）υ分别为837、904、1 006、1 039、1 078、1 166、1 215、1 261、1 290、1 346、1 446、1 510、1 556、1 587、1 604、1 650、2 964、3 217 cm-1。1H-NMR（核磁共振谱，Varian 600 MHz，CDCl3）δ分别为1.45（6H，s，CH3-4’’，5’’）、2.19（2H，s，OH-4，4’）、3.87（3H，s，OCH3）、5.32（1H，dd，J=10.1Hz，H-3’’）、5.32（1H，dd，J=10.1Hz，H-3’’）、5.35（1H，dd，J=18.1Hz，H-3’’）、6.20（1H，dd，J=18，10Hz，H-2’’）、6.45（1H，s，H-3）、6.96（2H，d，J=8.5Hz，H-3’，5’）、7.47（1H，s，H-6）、7.58（1H，d，J=16Hz，H-α）、7.98（2H，d，J=8.5Hz，H-2’，6’）、8.03（1H，d，J=16Hz，H-β）。NMR图谱中可以观察到1.45（6H，s，CH3-4’’，5’’）为2个甲基的信号，2.19（2H，s，OH-4，4’）是2个酚羟基，3.87（3H，s，OCH3）是一个甲氧基，6.20（1H，dd，J=18，10Hz，H-2’’）、5.35（1H，dd，J=18.1Hz，H-3’’）和5.32（1H，dd，J=10.1Hz，H-3’’）这三组信号还给出一组末端双键质子信息， 7.98（2H，d，J=8.5Hz，H-2’，6’）和8.03（1H，d，J=16Hz，H-β）为典型的查尔酮特征信号。氢谱还给出一组AA’XX’偶合的A环芳氢信号6.96（2H，d，J=8.5Hz，H-3’，5’）和7.98（2H，d，J=8.5Hz，H-2’，6’），以及B環2个孤立芳环质子信号6.45（1H，s，H-3）和7.47（1H，s，H-6）。上述理化鉴定结果与Wanga等[14]的研究结果一致。因此，将此单体成分鉴定为甘草查尔酮A，其化学结构如图2所示。
3讨论
胀果甘草是中国药典收录的甘草品种之一，主要分布于新疆、甘肃、内蒙古一带。近期研究显示，胀果甘草和胀果甘草药渣中的总黄酮具有较强的抗癌活性，其作用机制为诱导肿瘤细胞早期凋亡，经进一步研究显示，其发挥抗肿瘤作用的主要有效成分为LicoA，尤其是宫颈癌细胞对LicoA的抗癌活性更为敏感[15-16]。可见，单体成分LicoA及胀果甘草资源在抗癌新药研究中具有潜在的深入研究价值。然而，LicoA在胀果甘草中的含量很低、人工合成方法的工艺路线复杂、制备成本很高[12-13]，这促使人们寻找LicoA 的新资源和新来源，以便促进相关的药理学研究。