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摘 要：为了探究大蒜中超氧化物歧化酶的最佳提取条件及提取率，本试验以应县紫皮大蒜为材料，采用双水相萃取法结合正交试验，讨论PEG分子质量、PEG浓度、硫酸铵浓度对大蒜中SOD提取率的影响。试验结果为：PEG分子量为4000，PEG浓度为25%，硫酸铵浓度为30%时，双水相体系的SOD提取率达到最高为46.9%，影响顺序为PEG分子质量的影响最大，硫酸铵浓度次之，PEG浓度最小，3个因素对提取大蒜SOD影响均不显著。该试验结果为大蒜SOD的进一步分离纯化及在工业化生产、食药品研究领域提供理论基础。
关键词：应县紫皮大蒜;SOD;双水相萃取;正交试验;工艺优化
中图分类号：S633.4 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.10.002
Optimization of Aqueous Two-phase Extraction for SOD in Yingxian Purple Garlic
LIU Lizhen1，2， ZHEN Lina1，2， LIU Wenying1，2
（1.College of Life Science，Shanxi Datong University，Datong， Shanxi 037009， China; 2.Applied Biotechnology Institute， Shanxi Datong University， Datong， Shanxi 037009， China）
Abstract： In order to explore the optimal extraction conditions and extraction yield of superoxide dismutase in garlic， this experiment utilized Yingxian purple garlic as the material and studied the effects of different PEG relative molecular masses， PEG mass fractions， and ammonium sulfate mass fractions on the extraction rate of SOD by using a two-phase extraction method combined with an orthogonal test. These results indicated when the PEG molecular mass of 4000 and concentrations of PEG and ammonium sulfate were 25% and 30% ，respectively， the maximum extraction yield of SOD was 46.9% in the double aqueous phases system. The molecular mass of PEG was the most important factor， followed by ammonium sulfate concentration， and PEG concentration exerted the least influence.These three factors had no significant impact on the extraction of SOD from garlic. These experimental results provided a theoretical basis for further separation and purification of garlic SOD， industrial production，and food and drug research.
Key words： Yingxian purple garlic; SOD; aqueous two-phase; orthogonal test; process optimization
大蒜屬百合科葱属植物，《本草纲目》记录，大蒜祛风湿除风邪、治吐血和角弓反张、通五脏及大小便、纳肛中、散痈肿及霍乱[1-2]。McCord等[3]于1969年在动物血细胞中发现了超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD），是广泛存在于生物体内的金属酶，催化O2-自由基歧化，具有消除氧自由基、抗生命氧化衰老、抗辐射抗肿瘤、维持机体代谢平衡和改善机体免疫力等作用，在农业、食药品及化妆品等领域前景广阔[4-5]。目前我国主要从动物的血液和内脏、微生物发酵和植物中提取SOD。动物提取成本高、提取工艺及得到的成分复杂且不易常温保存;而植物中大蒜来源及含量极为丰富、生产成本低、工艺简单，安全性强且含量高[6-7]。值得一提的是，大蒜中的SOD含量及活性是其它植物的数倍，100 g大蒜中SOD含量高达17.6 mg，是人体SOD的重要来源之一[8]。
目前，提取纯化SOD的方法有双水相萃取法、超声波破碎法、热变性法、有机溶剂分级沉淀法、硫酸铵分级盐析法以及膜分离技术法[9-10]。相较于其他方法，双水相技术设备简单，条件适中，回收率高，分相时间短，无残留无毒，能耗低，分离过程更快更经济，提取率高，可连续化操作[11-12]。
应县本地产紫皮大蒜作为富硒农产品，被誉为“天然抗生素”。本研究以紫皮大蒜为原料，利用双水相体系萃取法结合正交试验法，优化了SOD提取工艺并检测其含量和提取率，并旨在为大蒜SOD的进一步分离纯化及在工业化生产以及食药品研究领域提供理论基础。 1 材料和方法
1.1 材料与试剂
紫皮大蒜（山西省农科院高寒作物研究所提供），牛超氧化物歧化酶对照品、PEG400、PEG600、PEG1 000、PEG4 000、PEG6 000、（NH4）2SO4、Na2HPO4、NaH2PO4以及考马斯亮蓝G-250等为分析纯，均购于试剂公司。
1.2 主要仪器
H1850R型高速冷冻离心机，由湖南湘仪仪器有限公司生产;XFB-200型粉碎机，由吉首中诚制药机械厂生产;JA5003A型电子天平，由上海精科天美仪器有限公司生产;UV-1200型紫外可见分光光度计，由上海美普达公司生产;SK-1型涡旋混匀器，由江苏科析有限公司生产;PH-3C型酸度计，由上海仪电科学有限公司生产。
1.3 试验方法
1.3.1 大蒜的选取 选用瓣肉白、无虫害、无霉变、无破损的大蒜500 g，去皮去蒂后用无菌水洗净晾干，粉碎后转至洁净研钵中磨碎成泥状。
1.3.2 粗提液的提取 将1.3.1 的蒜泥分5份，按1∶2加pH7.8的磷酸缓冲液（0.05 mol·L-1）研磨，待SOD完全溶解后5 000 rpm离心10 min，去掉不溶性杂质取上清，缓冲液继续浸泡杂质，反复3次合并提取液，5层纱布过滤得到粗提液。
1.3.3 建立双水相体系 以1.3.2 粗提液为原料，于15 mL离心管中加入不同分子质量PEG，分别和（NH4）2SO4摇匀，3 500 rpm离心10 min，4 ℃静置2 h待分层，测定上、下相中SOD的浓度。
1.3.4 大蒜SOD含量的测定
（1）制作标准曲线
精确称取牛SOD对照品10 mg（0.1 mg·mL-1），稀释成50，25，12.5，6.25，3.125，1.562 5 mg·mL-1等6个不同梯度及对应的空白对照，595 nm 处测定吸光值，重复3次，标准曲线的横纵坐标分别为标准品浓度（P，m·V-1）和其吸光度，回歸方程为Y=41.574X+0.236 9，R2=0.997 5。
（2）考马斯亮蓝法测定SOD的含量
SOD的含量采用考马斯亮蓝测定法[13]。取干净的15 mL离心管15支，样品管3支，标准管和空白管各1支，做3个重复。依次对应加0.1 mL样品液、0.1mL标准液、0.1 mL生理盐水和 5 mL考马斯亮蓝，混合完全后测其吸光度，重复3次。计算方法如下：
式中， Vs为双水相体系中上相的体积，mL;VX为双水相体系中下相的体积，mL;CS为双水相体系上相SOD的浓度，mg·mL-1;CX为双水相体系下相SOD的浓度，mg·mL-1。
1.3.5 单因素试验
（1）PEG分子质量对大蒜SOD提取率的影响
准确称取蒜泥50 g，选取浓度为20%的PEG和25%的（NH4）2SO4组成体系溶液，设定PEG的分子质量为200，400，600，1 000，4 000，6 000。观察不同PEG分子质量对大蒜SOD提取率的影响。
（2）PEG浓度对大蒜SOD提取率的影响
准确称取蒜泥50 g，选取PEG4 000和25%的（NH4）2SO4组成体系溶液，设定PEG浓度为10%，15%，20%，25%，30%，35%。观察不同浓度PEG对大蒜SOD提取率的影响。
（3）（NH4）2SO4浓度对大蒜SOD提取率的影响
准确称取蒜泥50 g，选取分子质量为4 000，浓度为20%的PEG，设定（NH4）2SO4浓度为5%，10%，15%，20%，25%，30%组成体系溶液。观察不同质量分数的 （NH4）2SO4对大蒜SOD提取率的影响。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 PEG分子质量对大蒜SOD提取率的影响 由图1可知，大蒜SOD的提取率随着PEG相对分子质量的不断增大而升高，PEG分子质量为4 000时，大蒜SOD的提取率最大为42.3%，之后PEG分子质量继续加大，大蒜SOD的提取率反而下降。可能是聚合物分子量的增加促进了酶在两相间的传递，当分子量增加到一定程度时，由于高聚物分子体积排斥作用的结果[14]，反而阻碍其传递，导致提取率下降。因此在进行正交试验时，分别选取PEG分子质量为1 000，4 000，6 000做3个水平。
2.1.2 PEG浓度对大蒜SOD提取率的影响 由图2可知，大蒜SOD的提取率随着PEG4 000浓度的不断加大而提高，浓度为20%时提取率为最大值43.9%，之后继续加大PEG浓度，SOD的萃取率反而下降。可能是PEG质量分数较低时，下相的盐析作用占主导，随着PEG浓度的继续增加，SOD主要分配在富含PEG的上相中，导致SOD的提取率不断上升[14]，浓度上升到一定程度时，提取率开始下降。因此在做正交试验时，选取PEG4 000的浓度分别为15%，20%，25%进行优化。
2.1.3 （NH4）2SO4浓度对大蒜SOD提取率的影响 由图3可知，随着（NH4）2SO4浓度的增加，大蒜SOD的提取率在不断上升，浓度为25%时，提取率达到最大值38.1%，之后继续加大（NH4）2SO4浓度，SOD的提取率反而下降。可能的原因是随着（NH4）2SO4浓度的增大，对水分子的争夺致下相体积增大，上相PEG的浓度相对增加，SOD的萃取率也相应增加[15]，当（NH4）2SO4质量分数增加到一定程度时，提取率开始下降。因此在做正交试验时，选取（NH4）2SO4的质量分数为20%，25%，30%进行优化。
2.2 正交试验结果
结合单因素试验结果，以PEG分子质量、PEG质量分数和（NH4）2SO4质量分数为考察因素，以大蒜SOD提取率为指标，选择3因素3水平做正交试验及验证性试验，结果如表1所示。 由表2可知，提取大蒜SOD的最佳组合为A2B3C3，即PEG分子量为 4 000，PEG浓度为25%，（NH4）2SO4浓度为30%时，大蒜SOD的提取率最大。由极差值R得出，双水相法萃取大蒜SOD的影响顺序为A >C >B，即PEG分子质量的影响最大，（NH4）2SO4浓度次之，PEG浓度最小。最优组合经验证，得出的提取率为46.9%。
由表 3可以得出，双水相法提取大蒜SOD的 3个因素对SOD的提取率影响不显著。
3 结论与讨论
SOD作为生物体的首要清除剂，反应生物体的抵抗能力[16]，天然植物大蒜中SOD的含量较为丰富，广泛应用于食药品、农医等领域[17]。本试验运用双水相萃取法提取应县紫皮大蒜中的SOD，根据正交试验及方差分析结果得出的最佳条件：PEG分子量为4 000，PEG质量分数为25%，（NH4）2SO4浓度为30%时，SOD的提取率最高，达46.9%。影响顺序为PEG分子质量的影响最大，（NH4）2SO4浓度次之，PEG浓度最小，3个因素对提取大蒜SOD影响均不显著。这与张丽华等[14]的研究一致，可能是由于超氧化物歧化酶在两相中扩散及两相间传递的阻力随着高聚物分子量的增大而变大，体积排斥作用的加大阻碍酶进入富含PEG的相中而转向另一相。而高聚物分子量越小，提取液在两相间的分配系数越大，越易分配到富含该聚合物的相中[15]。
谢芳等[15]的研究结果表明，PEG质量分数较低时，下相的盐析作用占主导，使SOD主要分配在富含PEG的上相。随着双水相体系中上相PEG浓度的增加，表面的张力加大，脂溶性成分的溶出，加剧了溶质的传递及扩散阻力，抑制了SOD进入上相而导致SOD萃取减少。（NH4）2SO4质量分数的增大对水分子的争夺致下相体积增大，上相PEG的浓度相对增加，SOD的萃取率也相应增加。（NH4）2SO4浓度太高或太低时，此双水相萃取系统均不能成相。太低时， PEG和（NH4）2SO4出现盐溶现象，SOD易分配到下相;太高时，出现盐析现象，SOD易分配到上相[15，18]。可靠的试验结果，可以大规模地开发、生产大蒜 SOD 的附加产品，增加大蒜的综合利用价值，提高大蒜的附加值和社会经济效益，为大蒜SOD的分离纯化等进一步研究提供理论依据。
参考文献：
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关键词：应县紫皮大蒜;SOD;双水相萃取;正交试验;工艺优化
中图分类号：S633.4 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.10.002
Optimization of Aqueous Two-phase Extraction for SOD in Yingxian Purple Garlic
LIU Lizhen1，2， ZHEN Lina1，2， LIU Wenying1，2
（1.College of Life Science，Shanxi Datong University，Datong， Shanxi 037009， China; 2.Applied Biotechnology Institute， Shanxi Datong University， Datong， Shanxi 037009， China）
Abstract： In order to explore the optimal extraction conditions and extraction yield of superoxide dismutase in garlic， this experiment utilized Yingxian purple garlic as the material and studied the effects of different PEG relative molecular masses， PEG mass fractions， and ammonium sulfate mass fractions on the extraction rate of SOD by using a two-phase extraction method combined with an orthogonal test. These results indicated when the PEG molecular mass of 4000 and concentrations of PEG and ammonium sulfate were 25% and 30% ，respectively， the maximum extraction yield of SOD was 46.9% in the double aqueous phases system. The molecular mass of PEG was the most important factor， followed by ammonium sulfate concentration， and PEG concentration exerted the least influence.These three factors had no significant impact on the extraction of SOD from garlic. These experimental results provided a theoretical basis for further separation and purification of garlic SOD， industrial production，and food and drug research.
Key words： Yingxian purple garlic; SOD; aqueous two-phase; orthogonal test; process optimization
大蒜屬百合科葱属植物，《本草纲目》记录，大蒜祛风湿除风邪、治吐血和角弓反张、通五脏及大小便、纳肛中、散痈肿及霍乱[1-2]。McCord等[3]于1969年在动物血细胞中发现了超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD），是广泛存在于生物体内的金属酶，催化O2-自由基歧化，具有消除氧自由基、抗生命氧化衰老、抗辐射抗肿瘤、维持机体代谢平衡和改善机体免疫力等作用，在农业、食药品及化妆品等领域前景广阔[4-5]。目前我国主要从动物的血液和内脏、微生物发酵和植物中提取SOD。动物提取成本高、提取工艺及得到的成分复杂且不易常温保存;而植物中大蒜来源及含量极为丰富、生产成本低、工艺简单，安全性强且含量高[6-7]。值得一提的是，大蒜中的SOD含量及活性是其它植物的数倍，100 g大蒜中SOD含量高达17.6 mg，是人体SOD的重要来源之一[8]。
目前，提取纯化SOD的方法有双水相萃取法、超声波破碎法、热变性法、有机溶剂分级沉淀法、硫酸铵分级盐析法以及膜分离技术法[9-10]。相较于其他方法，双水相技术设备简单，条件适中，回收率高，分相时间短，无残留无毒，能耗低，分离过程更快更经济，提取率高，可连续化操作[11-12]。
应县本地产紫皮大蒜作为富硒农产品，被誉为“天然抗生素”。本研究以紫皮大蒜为原料，利用双水相体系萃取法结合正交试验法，优化了SOD提取工艺并检测其含量和提取率，并旨在为大蒜SOD的进一步分离纯化及在工业化生产以及食药品研究领域提供理论基础。 1 材料和方法
1.1 材料与试剂
紫皮大蒜（山西省农科院高寒作物研究所提供），牛超氧化物歧化酶对照品、PEG400、PEG600、PEG1 000、PEG4 000、PEG6 000、（NH4）2SO4、Na2HPO4、NaH2PO4以及考马斯亮蓝G-250等为分析纯，均购于试剂公司。
1.2 主要仪器
H1850R型高速冷冻离心机，由湖南湘仪仪器有限公司生产;XFB-200型粉碎机，由吉首中诚制药机械厂生产;JA5003A型电子天平，由上海精科天美仪器有限公司生产;UV-1200型紫外可见分光光度计，由上海美普达公司生产;SK-1型涡旋混匀器，由江苏科析有限公司生产;PH-3C型酸度计，由上海仪电科学有限公司生产。
1.3 试验方法
1.3.1 大蒜的选取 选用瓣肉白、无虫害、无霉变、无破损的大蒜500 g，去皮去蒂后用无菌水洗净晾干，粉碎后转至洁净研钵中磨碎成泥状。
1.3.2 粗提液的提取 将1.3.1 的蒜泥分5份，按1∶2加pH7.8的磷酸缓冲液（0.05 mol·L-1）研磨，待SOD完全溶解后5 000 rpm离心10 min，去掉不溶性杂质取上清，缓冲液继续浸泡杂质，反复3次合并提取液，5层纱布过滤得到粗提液。
1.3.3 建立双水相体系 以1.3.2 粗提液为原料，于15 mL离心管中加入不同分子质量PEG，分别和（NH4）2SO4摇匀，3 500 rpm离心10 min，4 ℃静置2 h待分层，测定上、下相中SOD的浓度。
1.3.4 大蒜SOD含量的测定
（1）制作标准曲线
精确称取牛SOD对照品10 mg（0.1 mg·mL-1），稀释成50，25，12.5，6.25，3.125，1.562 5 mg·mL-1等6个不同梯度及对应的空白对照，595 nm 处测定吸光值，重复3次，标准曲线的横纵坐标分别为标准品浓度（P，m·V-1）和其吸光度，回歸方程为Y=41.574X+0.236 9，R2=0.997 5。
（2）考马斯亮蓝法测定SOD的含量
SOD的含量采用考马斯亮蓝测定法[13]。取干净的15 mL离心管15支，样品管3支，标准管和空白管各1支，做3个重复。依次对应加0.1 mL样品液、0.1mL标准液、0.1 mL生理盐水和 5 mL考马斯亮蓝，混合完全后测其吸光度，重复3次。计算方法如下：
式中， Vs为双水相体系中上相的体积，mL;VX为双水相体系中下相的体积，mL;CS为双水相体系上相SOD的浓度，mg·mL-1;CX为双水相体系下相SOD的浓度，mg·mL-1。
1.3.5 单因素试验
（1）PEG分子质量对大蒜SOD提取率的影响
准确称取蒜泥50 g，选取浓度为20%的PEG和25%的（NH4）2SO4组成体系溶液，设定PEG的分子质量为200，400，600，1 000，4 000，6 000。观察不同PEG分子质量对大蒜SOD提取率的影响。
（2）PEG浓度对大蒜SOD提取率的影响
准确称取蒜泥50 g，选取PEG4 000和25%的（NH4）2SO4组成体系溶液，设定PEG浓度为10%，15%，20%，25%，30%，35%。观察不同浓度PEG对大蒜SOD提取率的影响。
（3）（NH4）2SO4浓度对大蒜SOD提取率的影响
准确称取蒜泥50 g，选取分子质量为4 000，浓度为20%的PEG，设定（NH4）2SO4浓度为5%，10%，15%，20%，25%，30%组成体系溶液。观察不同质量分数的 （NH4）2SO4对大蒜SOD提取率的影响。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 PEG分子质量对大蒜SOD提取率的影响 由图1可知，大蒜SOD的提取率随着PEG相对分子质量的不断增大而升高，PEG分子质量为4 000时，大蒜SOD的提取率最大为42.3%，之后PEG分子质量继续加大，大蒜SOD的提取率反而下降。可能是聚合物分子量的增加促进了酶在两相间的传递，当分子量增加到一定程度时，由于高聚物分子体积排斥作用的结果[14]，反而阻碍其传递，导致提取率下降。因此在进行正交试验时，分别选取PEG分子质量为1 000，4 000，6 000做3个水平。
2.1.2 PEG浓度对大蒜SOD提取率的影响 由图2可知，大蒜SOD的提取率随着PEG4 000浓度的不断加大而提高，浓度为20%时提取率为最大值43.9%，之后继续加大PEG浓度，SOD的萃取率反而下降。可能是PEG质量分数较低时，下相的盐析作用占主导，随着PEG浓度的继续增加，SOD主要分配在富含PEG的上相中，导致SOD的提取率不断上升[14]，浓度上升到一定程度时，提取率开始下降。因此在做正交试验时，选取PEG4 000的浓度分别为15%，20%，25%进行优化。
2.1.3 （NH4）2SO4浓度对大蒜SOD提取率的影响 由图3可知，随着（NH4）2SO4浓度的增加，大蒜SOD的提取率在不断上升，浓度为25%时，提取率达到最大值38.1%，之后继续加大（NH4）2SO4浓度，SOD的提取率反而下降。可能的原因是随着（NH4）2SO4浓度的增大，对水分子的争夺致下相体积增大，上相PEG的浓度相对增加，SOD的萃取率也相应增加[15]，当（NH4）2SO4质量分数增加到一定程度时，提取率开始下降。因此在做正交试验时，选取（NH4）2SO4的质量分数为20%，25%，30%进行优化。
2.2 正交试验结果
结合单因素试验结果，以PEG分子质量、PEG质量分数和（NH4）2SO4质量分数为考察因素，以大蒜SOD提取率为指标，选择3因素3水平做正交试验及验证性试验，结果如表1所示。 由表2可知，提取大蒜SOD的最佳组合为A2B3C3，即PEG分子量为 4 000，PEG浓度为25%，（NH4）2SO4浓度为30%时，大蒜SOD的提取率最大。由极差值R得出，双水相法萃取大蒜SOD的影响顺序为A >C >B，即PEG分子质量的影响最大，（NH4）2SO4浓度次之，PEG浓度最小。最优组合经验证，得出的提取率为46.9%。
由表 3可以得出，双水相法提取大蒜SOD的 3个因素对SOD的提取率影响不显著。
3 结论与讨论
SOD作为生物体的首要清除剂，反应生物体的抵抗能力[16]，天然植物大蒜中SOD的含量较为丰富，广泛应用于食药品、农医等领域[17]。本试验运用双水相萃取法提取应县紫皮大蒜中的SOD，根据正交试验及方差分析结果得出的最佳条件：PEG分子量为4 000，PEG质量分数为25%，（NH4）2SO4浓度为30%时，SOD的提取率最高，达46.9%。影响顺序为PEG分子质量的影响最大，（NH4）2SO4浓度次之，PEG浓度最小，3个因素对提取大蒜SOD影响均不显著。这与张丽华等[14]的研究一致，可能是由于超氧化物歧化酶在两相中扩散及两相间传递的阻力随着高聚物分子量的增大而变大，体积排斥作用的加大阻碍酶进入富含PEG的相中而转向另一相。而高聚物分子量越小，提取液在两相间的分配系数越大，越易分配到富含该聚合物的相中[15]。
谢芳等[15]的研究结果表明，PEG质量分数较低时，下相的盐析作用占主导，使SOD主要分配在富含PEG的上相。随着双水相体系中上相PEG浓度的增加，表面的张力加大，脂溶性成分的溶出，加剧了溶质的传递及扩散阻力，抑制了SOD进入上相而导致SOD萃取减少。（NH4）2SO4质量分数的增大对水分子的争夺致下相体积增大，上相PEG的浓度相对增加，SOD的萃取率也相应增加。（NH4）2SO4浓度太高或太低时，此双水相萃取系统均不能成相。太低时， PEG和（NH4）2SO4出现盐溶现象，SOD易分配到下相;太高时，出现盐析现象，SOD易分配到上相[15，18]。可靠的试验结果，可以大规模地开发、生产大蒜 SOD 的附加产品，增加大蒜的综合利用价值，提高大蒜的附加值和社会经济效益，为大蒜SOD的分离纯化等进一步研究提供理论依据。
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