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摘要 [目的]筛选对黄瓜疫病有较好稳定防治能力的生防菌。[方法]采用系列稀释法和平板涂布法對黄瓜疫病菌拮抗细菌进行初步分离，进一步通过平板对峙法对其进行筛选，并通过形态学、生理生化特征、16S rDNA序列分析方法对拮抗效果较好的细菌进行了鉴定。[结果]共分离到黄瓜疫病病原菌的拮抗细菌56株，有4株细菌对黄瓜疫病病原菌显示出较强的拮抗效果，其中LY38菌株对黄瓜疫病病原菌拮抗带宽为6.5 mm，抑菌率高达81.2%，通过鉴定可以确定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。[结论]为黄瓜疫病的田间生物防治提供了参考。
关键词 黄瓜疫病；拮抗细菌；鉴定；枯草芽孢杆菌
中图分类号 S436.421.1 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）20-06692-02
Isolation and Identification of Antagonistic Bacteria against Phytophthora melonis
WU Shandong et al （Hunan Provincial Institute of Microbiology，Changsha，Hunan 410009）
Abstract [Objective] The aim was to obtain good antagonistic bacteria against P.melonis. [Method] Some antagonistic bacteria against P. melonis were isolated from soil by using serial dilution method and spreadplate method， further screened on plate. Then efficient antagonistic bacteria against P. melonis were identified by using morphology， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis. [Result] Fiftysix bacteria were initially isolated by the serial dilutions and plate coating method and have an antagonistic effect on cucumber blight pathogen. Four of them were further identified by the plate confrontation method and showed strong antagonistic effect on cucumber blight pathogen. LY38 showed the antagonism bandwidth of 6.2 mm on cucumber blight pathogen and the inhibition rate of 81.2%. The LY38 strain was identified as Bacillus subtilis. [Conclusion] The research result provides reference for field biological control of P. melonis.
Key words Phytophthora melonis； antagonistic bacteria；Identification；Bacillus subtilis
黄瓜疫病是一种黄瓜毁灭性土传病害，由疫霉菌（Phytophthora melonis）侵染所引起[1]，苗期至成株期均可染病，一旦发病，可造成黄瓜大面积死亡，减产幅度在20%～30%，是影响黄瓜生产的重要因素之一，病菌以28～30 ℃为最适生长温度。目前，该病的防治以化学药剂为主，但由于病菌的抗药性，防治效果越来越差。在土壤中引进拮抗性微生物防治植物土传病害的研究已有60多年，并取得一定成果[2]。抗生素2507是新研制的可防治黄瓜疫病和丝瓜霜霉病等多种病害的药剂，田间防治效果达到70%～80%[3]。林壁润等筛选出对黄瓜疫病有拮抗作用的细菌菌株P78，其摇瓶发酵液在温室人工接种条件下防治黄瓜疫病效果平均达95.2%[4]。笔者从土壤中分离并鉴定了对黄瓜疫病有较好稳定防治能力的生防菌，以期为黄瓜疫病的田间生物防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株。黄瓜疫病菌由湖南省微生物研究院提供。
1.1.2 供试培养基。
PDA培养基：1 000 ml培养基中含马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，pH自然。牛肉膏蛋白胨培养基：1 000 ml培养基中含牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g，pH 7.2～7.4。LB培养基：1 000 ml培养基中含胰蛋白胨10 g、氯化钠10 g、酵母提取物5 g，pH 7.0。
1.2 方法
1.2.1 拮抗细菌的分离与纯化。
选择黄瓜疫病发病田块，从未发病植株的根际取土样，称10 g土壤直接放入盛有90 ml无菌水（带玻璃珠）的三角瓶内，振荡10 min。依梯度稀释至10-8。从10-6、10-7、10-8各吸取稀释液1 ml，分别加入灭菌培养皿中。每个稀释浓度3次重复。待样品都加入培养皿后，分别注入预先溶化并冷却至45 ℃的牛肉膏蛋白胨培养基15～20 ml，使菌悬液和培养基充分均匀混合。将接种好的培养皿倒置放入30 ℃恒温培养箱中培养2～3 d。挑取单菌落移接到试管斜面上。再将分离所得原始菌株划线培养，挑取单菌落，按此重复3次，直至在平板上不再出现异样菌落时，转移到试管斜面上，4 ℃保存。 1.2.2 拮抗细菌的筛选[5]。
采用平板对峙法。将黄瓜疫病病原菌在PDA平板上活化，用打孔器在菌落边缘打取菌块，接种在平板中央（菌丝面朝下），28 ℃培养1 d后在距菌丝边缘2 cm处分别点接4株待测细菌，对照不接菌株，28 ℃培养2～3 d，观察有无拮抗带的出现。
1.2.3 拮抗细菌的代谢物质对黄瓜疫病病原菌的抑制作用测定。
将拮抗细菌接入LB液体培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养48 h，然后将发酵液在4 ℃、6 000 r/min条件下离心15 min，取上清液，再经细菌过滤器（直径0.22 μm）过滤，收集滤液。取3 ml滤液与12 ml培养基混合，摇匀制成平板。接种直径为5 mm的病原菌菌饼于平板中央，同时用无菌水作对照，每处理3次重复，于28 ℃培养，72 h后测量菌落直径，计算抑菌率。
抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100[6]
1.2.4 拮抗菌株的鉴定。
依据东秀珠等编著的《常见细菌系统鉴定手册》[7]对拮抗细菌进行鉴定。
1.2.5 拮抗菌16S rDNA序列分析。
提取DNA后，对16S rDNA目的片断PCR进行扩增[8]。引物序列：（F） 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’；（R）5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’。PCR反应体系（50 μl）：去离子水39 μl，PCR buffer 5 μl，dNTP 2 μl，上、下游引物各1 μl，模板DNA 1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性50 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物回收插入PMD18T载体后由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。序列输入GenBank数据库进行比对，选择同源性高的序列使用MEGA5.1软件构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 黄瓜疫病菌拮抗细菌的抑菌作用
从土样中共分离得到细菌56株，经过对峙法筛选共获得有拮抗效果的菌株4株，其中LX38对黄瓜疫病菌表现出稳定的拮抗活性，且生长较快，拮抗带宽为6.5 mm，抑菌率为81.2%（表1）。选择LX38做进一步分析研究。
2.2 拮抗细菌LY38的鉴定
2.2.1 LX38菌株的菌落与形态特征。
LY38菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上28 ℃培养36 h后，菌落圆形或不规则形，表面褐色，较暗，有皱褶。革兰氏染色呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌。菌体杆状，有鞭毛，油镜下观察有椭圆形芽孢。
2.2.2 拮抗茵LX38生理生化特征。LX38生理生化特征见表2。
3 结论与讨论
该试验从黄瓜根际土壤样品中分离到具有黄瓜疫病菌拮抗活性的菌株共4株，并对拮抗性最强的LY38进行形态特征、培养特征、生理生化特性的分析和16S rDNA序列测定，参照东秀珠等编著的《常见细菌系统鉴定手册》[7]，将菌株LY38鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
作物病害的生物防治越来越引起国内外学者的重视，采用有益细菌防治土传病害是一条较理想的生物防治途径。相对而言，生物农药的开发费用大大低于化学农药，更由于微生物源农药源于自然，与环境的相容性高，对人畜较安全，故人们在尽力开发化学农药的同时，积极应用生物工程技术，从事微生物源农药的研制开发[9]。枯草芽孢杆菌对环境有很强的抗逆能力，同时对多种植物病原菌有很强的拮抗作用，具有很好的开发前景。至于枯草芽孢杆菌LY38的抗菌机理及抗菌物质组成，尚需进一步研究。
参考文献
[1]
魏惠军，王艳飞，杜胜利，等.黄瓜疫病菌毒素的产生和生物测定初报[J].天津农业科学，1998，4（3）：4-7.
[2] 葛红莲，郭亚辉，郭坚华，等.复合菌剂G23防治黄瓜疫病的田间试验[J].安徽农业科学，2007，35（21）：6481-6482.
[3] 林壁润，谢双大.抗生素2507对黄瓜疫病菌的抗生作用[J].植物保护学报，2001，28（2）：113-117.
[4] 林壁润，谢双大.拮抗细菌P78对黄瓜疫病及丝瓜霜霉病的防治作用[J].中国生物防治，1999，15（3）：114-117.
[5] 张亚，廖晓兰，曾晓楠，等.鸭粪中1株水稻纹枯病菌拮抗细菌的鉴定[J].植物病理学报，2010，40（5）：517-521.
[6] 宋僅星，于士军，蒋岚，等.适应水稻秸秆还田的抗稻纹枯病拮抗菌株的筛选[J].植物保护，2012，38（1）：80-84.
[7] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.
[8] 别小妹，陆兆新，房耀维，等.利用16S rDNA序列分析鉴定一株产抗菌物质的微生物菌株[J].食品科学，2006，27（11）：466-470.
[9] 张一宾.对中国农药发展之浅见[J].农药，1998，37（5）：1-2.
关键词 黄瓜疫病；拮抗细菌；鉴定；枯草芽孢杆菌
中图分类号 S436.421.1 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）20-06692-02
Isolation and Identification of Antagonistic Bacteria against Phytophthora melonis
WU Shandong et al （Hunan Provincial Institute of Microbiology，Changsha，Hunan 410009）
Abstract [Objective] The aim was to obtain good antagonistic bacteria against P.melonis. [Method] Some antagonistic bacteria against P. melonis were isolated from soil by using serial dilution method and spreadplate method， further screened on plate. Then efficient antagonistic bacteria against P. melonis were identified by using morphology， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis. [Result] Fiftysix bacteria were initially isolated by the serial dilutions and plate coating method and have an antagonistic effect on cucumber blight pathogen. Four of them were further identified by the plate confrontation method and showed strong antagonistic effect on cucumber blight pathogen. LY38 showed the antagonism bandwidth of 6.2 mm on cucumber blight pathogen and the inhibition rate of 81.2%. The LY38 strain was identified as Bacillus subtilis. [Conclusion] The research result provides reference for field biological control of P. melonis.
Key words Phytophthora melonis； antagonistic bacteria；Identification；Bacillus subtilis
黄瓜疫病是一种黄瓜毁灭性土传病害，由疫霉菌（Phytophthora melonis）侵染所引起[1]，苗期至成株期均可染病，一旦发病，可造成黄瓜大面积死亡，减产幅度在20%～30%，是影响黄瓜生产的重要因素之一，病菌以28～30 ℃为最适生长温度。目前，该病的防治以化学药剂为主，但由于病菌的抗药性，防治效果越来越差。在土壤中引进拮抗性微生物防治植物土传病害的研究已有60多年，并取得一定成果[2]。抗生素2507是新研制的可防治黄瓜疫病和丝瓜霜霉病等多种病害的药剂，田间防治效果达到70%～80%[3]。林壁润等筛选出对黄瓜疫病有拮抗作用的细菌菌株P78，其摇瓶发酵液在温室人工接种条件下防治黄瓜疫病效果平均达95.2%[4]。笔者从土壤中分离并鉴定了对黄瓜疫病有较好稳定防治能力的生防菌，以期为黄瓜疫病的田间生物防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株。黄瓜疫病菌由湖南省微生物研究院提供。
1.1.2 供试培养基。
PDA培养基：1 000 ml培养基中含马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，pH自然。牛肉膏蛋白胨培养基：1 000 ml培养基中含牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g，pH 7.2～7.4。LB培养基：1 000 ml培养基中含胰蛋白胨10 g、氯化钠10 g、酵母提取物5 g，pH 7.0。
1.2 方法
1.2.1 拮抗细菌的分离与纯化。
选择黄瓜疫病发病田块，从未发病植株的根际取土样，称10 g土壤直接放入盛有90 ml无菌水（带玻璃珠）的三角瓶内，振荡10 min。依梯度稀释至10-8。从10-6、10-7、10-8各吸取稀释液1 ml，分别加入灭菌培养皿中。每个稀释浓度3次重复。待样品都加入培养皿后，分别注入预先溶化并冷却至45 ℃的牛肉膏蛋白胨培养基15～20 ml，使菌悬液和培养基充分均匀混合。将接种好的培养皿倒置放入30 ℃恒温培养箱中培养2～3 d。挑取单菌落移接到试管斜面上。再将分离所得原始菌株划线培养，挑取单菌落，按此重复3次，直至在平板上不再出现异样菌落时，转移到试管斜面上，4 ℃保存。 1.2.2 拮抗细菌的筛选[5]。
采用平板对峙法。将黄瓜疫病病原菌在PDA平板上活化，用打孔器在菌落边缘打取菌块，接种在平板中央（菌丝面朝下），28 ℃培养1 d后在距菌丝边缘2 cm处分别点接4株待测细菌，对照不接菌株，28 ℃培养2～3 d，观察有无拮抗带的出现。
1.2.3 拮抗细菌的代谢物质对黄瓜疫病病原菌的抑制作用测定。
将拮抗细菌接入LB液体培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养48 h，然后将发酵液在4 ℃、6 000 r/min条件下离心15 min，取上清液，再经细菌过滤器（直径0.22 μm）过滤，收集滤液。取3 ml滤液与12 ml培养基混合，摇匀制成平板。接种直径为5 mm的病原菌菌饼于平板中央，同时用无菌水作对照，每处理3次重复，于28 ℃培养，72 h后测量菌落直径，计算抑菌率。
抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100[6]
1.2.4 拮抗菌株的鉴定。
依据东秀珠等编著的《常见细菌系统鉴定手册》[7]对拮抗细菌进行鉴定。
1.2.5 拮抗菌16S rDNA序列分析。
提取DNA后，对16S rDNA目的片断PCR进行扩增[8]。引物序列：（F） 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’；（R）5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’。PCR反应体系（50 μl）：去离子水39 μl，PCR buffer 5 μl，dNTP 2 μl，上、下游引物各1 μl，模板DNA 1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性50 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物回收插入PMD18T载体后由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。序列输入GenBank数据库进行比对，选择同源性高的序列使用MEGA5.1软件构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 黄瓜疫病菌拮抗细菌的抑菌作用
从土样中共分离得到细菌56株，经过对峙法筛选共获得有拮抗效果的菌株4株，其中LX38对黄瓜疫病菌表现出稳定的拮抗活性，且生长较快，拮抗带宽为6.5 mm，抑菌率为81.2%（表1）。选择LX38做进一步分析研究。
2.2 拮抗细菌LY38的鉴定
2.2.1 LX38菌株的菌落与形态特征。
LY38菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上28 ℃培养36 h后，菌落圆形或不规则形，表面褐色，较暗，有皱褶。革兰氏染色呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌。菌体杆状，有鞭毛，油镜下观察有椭圆形芽孢。
2.2.2 拮抗茵LX38生理生化特征。LX38生理生化特征见表2。
3 结论与讨论
该试验从黄瓜根际土壤样品中分离到具有黄瓜疫病菌拮抗活性的菌株共4株，并对拮抗性最强的LY38进行形态特征、培养特征、生理生化特性的分析和16S rDNA序列测定，参照东秀珠等编著的《常见细菌系统鉴定手册》[7]，将菌株LY38鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
作物病害的生物防治越来越引起国内外学者的重视，采用有益细菌防治土传病害是一条较理想的生物防治途径。相对而言，生物农药的开发费用大大低于化学农药，更由于微生物源农药源于自然，与环境的相容性高，对人畜较安全，故人们在尽力开发化学农药的同时，积极应用生物工程技术，从事微生物源农药的研制开发[9]。枯草芽孢杆菌对环境有很强的抗逆能力，同时对多种植物病原菌有很强的拮抗作用，具有很好的开发前景。至于枯草芽孢杆菌LY38的抗菌机理及抗菌物质组成，尚需进一步研究。
参考文献
[1]
魏惠军，王艳飞，杜胜利，等.黄瓜疫病菌毒素的产生和生物测定初报[J].天津农业科学，1998，4（3）：4-7.
[2] 葛红莲，郭亚辉，郭坚华，等.复合菌剂G23防治黄瓜疫病的田间试验[J].安徽农业科学，2007，35（21）：6481-6482.
[3] 林壁润，谢双大.抗生素2507对黄瓜疫病菌的抗生作用[J].植物保护学报，2001，28（2）：113-117.
[4] 林壁润，谢双大.拮抗细菌P78对黄瓜疫病及丝瓜霜霉病的防治作用[J].中国生物防治，1999，15（3）：114-117.
[5] 张亚，廖晓兰，曾晓楠，等.鸭粪中1株水稻纹枯病菌拮抗细菌的鉴定[J].植物病理学报，2010，40（5）：517-521.
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[7] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.
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[9] 张一宾.对中国农药发展之浅见[J].农药，1998，37（5）：1-2.