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【摘要】 目的：通过对肝癌大鼠进行肝动脉区域灌注化疗，研究其对肿瘤血管生成的影响。方法：建立大鼠肝癌模型后，将造模2周后的肝内荷瘤大鼠18只，按照随机数字表法分为对照组、外周静脉组和肝动脉组各6只。大鼠的5-FU给药剂量为20 mg/kg，连续给药4 d。化疗结束后第7天摘取肝脏肿瘤，采用免疫组化法检测VEGF和CD34在肝癌组织中的表达。通过VEGF蛋白染色测定积分光密度（IOD），CD34标记血管内皮细胞检测肿瘤内微血管密度（MVD）。结果：对照组VEGF表达（IOD值）为（46351.48±2926.24），明显高于外周静脉组（43678.84±2852.76）和肝动脉组（35518.86±2657.16），且肝动脉组的肝癌VEGF表达明显低于外周静脉组，差异均有统计学意义（P<0.05）。而肝动脉组肝癌组织CD34蛋白表达和MVD最低（36.26±8.43），均明显低于外周静脉组（62.08±10.77）和对照组（69.74±16.60），差异均有统计学意义（P<0.05）。而外周静脉组和对照组的CD34蛋白表达和MVD比较差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：肝动脉灌注化疗能有效抑制肝癌组织VEGF表达，降低MVD，从而抑制肿瘤血管生成。
【关键词】 肝癌； 肝动脉灌注化疗； 血管生成； 血管内皮生长因子； 微血管密度
肝动脉灌注化疗是肝癌常用的区域灌注化疗方法，目前常作为肝癌术后治疗和不能切除的晚期肝癌治疗的重要手段。既往的研究提示经肝动脉区域灌注化疗可显著提高肝脏组织药物浓度，同时达到减少药物在外周血和全身其他部位分布[1]。化疗药物抑制肿瘤血管生成是抗肿瘤的重要机制，本文以5-Fu为化疗代表药物，通过对肝癌大鼠进行肝动脉区域灌注化疗，研究其对肿瘤血管生成的影响，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 试剂与药品 兔抗鼠CD34多克隆抗体，VEGF多克隆抗体，武汉博士德有限公司生产。DAB显色试剂盒，SP即用型试剂盒，PBS缓冲液，福州迈新有限公司生产。5-FU由南通精华制药公司提供，批号：070402，规格10 mL：0.25 g。
1.2 肿瘤细胞株和实验动物 CBRH-7919大鼠肝癌细胞株，中山大学细胞保藏中心提供。（1）BALB/c雄性裸鼠2只，17.1～19.6 g重，作种鼠皮下接种肿瘤细胞。（2）Wistar雄性大鼠18只，（120±15）g重，作肝内种植肿瘤用。上述动物均为SPF（无特定病原）级，由中山大学动物中心提供。
1.3 方法
1.3.1 大鼠肝癌模型的建立 将培养好的大鼠肝癌细胞注射于裸小鼠背部皮下，2周后成瘤并取出，切成l mm×l mm×1 mm瘤块。然后采用肝内隧道植入法将瘤块接种于Wistar大鼠肝左叶。手术当天始腹腔注射氢化可的松2 mg/只/d×5 d。术后密切观察造模后荷瘤大鼠的生物学行为、死亡情况等。
1.3.2 实验分组及给药 造模2周后，将18只荷瘤大鼠按照随机数字表法分为对照组（不作任何处理）、外周静脉组（经尾静脉注射）、肝动脉组（经胃十二指肠动脉插管至肝动脉给药），6只/组。大鼠的5-FU给药剂量为20 mg/kg，连续给药4 d。
1.3.3 标本采集和处理 化疗结束后第7天处死大鼠摘除肝脏肿瘤组织，并置于10%福尔马林中固定后石蜡包埋。将瘤体石蜡标本块切片，厚度约5 μm。脱蜡后通过微波加热法修复抗原，予免疫组织化学染色。每例标本取2张切片，滴加CD34抗体和VEGF多抗各1滴。
1.3.4 VEGF检测 标本经染色封片后在显微镜下（×200）观察，细胞浆显示棕黄色颗粒为VEGF阳性细胞。每张切片选阳性表达最高的5个高倍视野（×400）照相，采用IPP 图像分析软件将VEGF蛋白染色的黄色区域作为AOI（area of interest）测定分析光密度。取5个视野的积分光密度（IOD）平均值作为该标本的表达强度计量值。
1.3.5 MVD检测 参照Weidner的标准计算各组肿瘤内的微血管密度（MVD）：低倍镜下（×100）寻找切片中棕黄染色密度最高的区域，即为富含血管组织的“热点”区。再在高倍镜下（×400）按染色为棕黄色的内皮细胞均记为一条独立血管的标准计算血管数目。每张切片分别选10个不同高倍视野计算MVD，取平均值。
1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组肝癌组织VEGF表达比较 细胞浆内染色为棕黄色为阳性。各组阳性染色深浅不均，肝动脉组较浅，外周静脉组次之，对照组染色最深。图像分析后比较，结果显示对照组VEGF表达明显高于外周静脉组和肝动脉组，且肝动脉组的肝癌VEGF表达明显低于外周静脉组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 各组肝癌组织CD34的表达及MVD结果比较 各组MVD具有相似的分布特征：肿瘤血管内皮细胞被染成棕黄色，且分布不均匀，坏死组织周围及肿瘤边缘MVD相对较高。肝动脉组的肝癌组织CD34蛋白表达和MVD最低，均明显低于外周静脉组和对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。而外周静脉组和对照组的CD34蛋白表达和MVD比较差异均无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
区域灌注化疗可以增加癌灶和靶组织器官的化疗药物浓度和/或降低外周血及其他组织的药物分布，是目前实体肿瘤化疗增效减毒的重要措施和手段之一[1-2]。肝动脉灌注化疗由于具有较明显的药动学优势，常作为肝癌化疗的常用手段[3-4]。原发性肝癌（HCC）是典型的富血供恶性肿瘤，它的发生、发展和转移时刻离不开肿瘤新生血管。肿瘤血管生成是HCC生长和转移的先决条件，如果肿瘤组织没有新生血管支持，则因凋亡和坏死而肿瘤不会大于1～2 mm[5]。而肝癌预后则与癌组织的血管生成调节因子水平和微血管密度（MVD）密切相关[6-7]。 VEGF目前被认为是体内最强的一种血管生成因子，其在肝细胞癌中呈高表达，与肿瘤的生长和预后紧密相关[8-10]。肿瘤微血管密度和VEGF的表达水平直接关联，提示VEGF使肿瘤血管生成会导致肝癌的浸润、生长转移和复发。5-FU经多年临床应用显示毒副作用较小的对肝癌细胞敏感性较好的药物，是肝癌化疗目前最常用的药物之一[11-12]。本实验以5-FU作为化疗代表药物进行研究，结果显示两个化疗组VEGF表达均明显低于对照组（P<0.05），提示5-FU能抑制肿瘤细胞合成与分泌VEGF，减低其对血管内皮细胞刺激所致的过度增生，同时通过控制VEGF分泌实现抑制肝癌细胞增殖，从而说明5-FU可使VEGF表达下调，使血管生成受抑制而控制肿瘤生长。肝动脉组的VEGF表达明显低于外周静脉组（P<0.05），说明肝动脉化疗比外周静脉给药更能有效减低VEGF表达。笔者既往的研究显示肝动脉灌注化疗的肝组织药物浓度明显高于经外周静脉给药，综合提示了不仅化疗可以抑制VEGF在肝癌组织中的表达，而且一定程度上5-FU的药物浓度和VEGF在肿瘤组织中表达水平呈负相关[1]。
MVD是反映肝细胞癌肿瘤血管生成情况的一项指标[13-14]。CD34则是目前最敏感的肿瘤血管标记物[15]。本课题采用CD34对血管内皮细胞进行标记来检测肿瘤组织中的的MVD。研究结果显示肝动脉组的肝癌组织MVD最低，均明显低于对照组和外周静脉化疗组，差异均有统计学意义（P<0.05）；但对照组和外周静脉组的MVD比较差异无统计学意义（P>0.05）。提示肝动脉灌注化疗可以有效降低肝癌组织的血管密度，而经外周静脉注射化疗则对降低肝细胞癌肿瘤微血管密度，抑制肿瘤血管生成效果不显著。综上所述，肝动脉灌注化疗能有效抑制肝癌组织VEGF表达，降低肿瘤MVD，从而抑制肿瘤血管生成。
参考文献
[1]郑惊雷，梁力建，胡文杰，等.区域性灌注化疗时5-FU的血液和肝脏组织药物浓度分布特征[J].南方医科大学学报，2008，28（5）：823-827.
[2] Cagol P P，Pasqual E，Bacchetti S.Potential advantages of loco-regional intra-arterial chemotherapy[J].In Vivo，2006，20（6A）：777-779.
[3] Nitta H，Beppu T，Imai K，et al.Adjuvant hepatic arterial infusion chemotherapy after hepatic resection of hepatocellular carcinoma with macroscopic vascular invasion[J].World J Surg，2013，37（5）：1034-1042.
[4] Giunchedi P，Maestri M，Gavini E，et al.Transarterial chemoembolization of hepatocellular carcinoma-agents and drugs：an overview.Part 2[J].Expert Opin Drug Deliv，2013，10（6）：799-810.
[5] Liu Y，Xu L，Zeng Q，et al.Downregulation of FGL2/prothrombinase delays HCCLM6 xenograft tumour growth and decreases tumour angiogenesis[J].Liver Int，2012，32（10）：1585-1595.
[6] Bao Y，Feng W M，Tang C W，et al.Endostatin inhibits angiogenesis in hepatocellular carcinoma after transarterial chemoembolization[J].Hepato-gastroenterology，2012，59（117）：1566-1568.
[7] Sharma B K，Srinivasan R，Kapil S，et al.Serum levels of angiogenic and anti-angiogenic factors：their prognostic relevance in locally advanced hepatocellular carcinoma[J].Mol Cell Biochem，2013，383（1-2）：103-112.
[8] Sengupta B，A Siddiqi S.Hepatocellular carcinoma：important biomarkers and their significance in molecular diagnostics and therapy[J].Curr Med Chem，2012，19（22）：3722-3729.
[9] Yegin E G，Siykhymbayev A，Eren F，et al.Prognostic implication of serum vascular endothelial growth factor in advanced hepatocellular carcinoma staging[J].Ann Hepatol，2012，12（6）：915-925.
[10]崔旭辉，薛学义，许宁.沙利度胺抗肿瘤血管生成作用及临床研究进展[J].中国医学创新，2011，8（32）：158-160.
[11]汤钊猷.现代肿瘤学[M].上海：上海医科大学出版社，2000：94-95.
[12] Nagano H，Kobayashi S，Marubashi S，et al.Combined IFN-α and 5-FU treatment as a postoperative adjuvant following surgery for hepatocellular carcinoma with portal venous tumor thrombus[J].Exp Ther Med，2013，5（1）：3-10.
[13] Wang Q，Tian X，Zhang C，et al.Upregulation of vasohibin-1 expression with angiogenesis and poor prognosis of hepatocellular carcinoma after curative surgery[J].Medical Oncology，2012，29（4）：2727-2736.
[14]杜国芳，王丽红，裴毅.重组人血管内皮抑制素抗小鼠肝癌H22作用机制探讨[J].中国医学创新，2013，10（2）：14-15.
[15] Di Carlo I，Fraggetta F，Lombardo R，et al.CD 34 expression in chronic and neoplastic liver diseases[J].Panminerva Med，2002，44（4）：365-367.
（收稿日期：2013-10-23） （本文编辑：欧丽）
【关键词】 肝癌； 肝动脉灌注化疗； 血管生成； 血管内皮生长因子； 微血管密度
肝动脉灌注化疗是肝癌常用的区域灌注化疗方法，目前常作为肝癌术后治疗和不能切除的晚期肝癌治疗的重要手段。既往的研究提示经肝动脉区域灌注化疗可显著提高肝脏组织药物浓度，同时达到减少药物在外周血和全身其他部位分布[1]。化疗药物抑制肿瘤血管生成是抗肿瘤的重要机制，本文以5-Fu为化疗代表药物，通过对肝癌大鼠进行肝动脉区域灌注化疗，研究其对肿瘤血管生成的影响，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 试剂与药品 兔抗鼠CD34多克隆抗体，VEGF多克隆抗体，武汉博士德有限公司生产。DAB显色试剂盒，SP即用型试剂盒，PBS缓冲液，福州迈新有限公司生产。5-FU由南通精华制药公司提供，批号：070402，规格10 mL：0.25 g。
1.2 肿瘤细胞株和实验动物 CBRH-7919大鼠肝癌细胞株，中山大学细胞保藏中心提供。（1）BALB/c雄性裸鼠2只，17.1～19.6 g重，作种鼠皮下接种肿瘤细胞。（2）Wistar雄性大鼠18只，（120±15）g重，作肝内种植肿瘤用。上述动物均为SPF（无特定病原）级，由中山大学动物中心提供。
1.3 方法
1.3.1 大鼠肝癌模型的建立 将培养好的大鼠肝癌细胞注射于裸小鼠背部皮下，2周后成瘤并取出，切成l mm×l mm×1 mm瘤块。然后采用肝内隧道植入法将瘤块接种于Wistar大鼠肝左叶。手术当天始腹腔注射氢化可的松2 mg/只/d×5 d。术后密切观察造模后荷瘤大鼠的生物学行为、死亡情况等。
1.3.2 实验分组及给药 造模2周后，将18只荷瘤大鼠按照随机数字表法分为对照组（不作任何处理）、外周静脉组（经尾静脉注射）、肝动脉组（经胃十二指肠动脉插管至肝动脉给药），6只/组。大鼠的5-FU给药剂量为20 mg/kg，连续给药4 d。
1.3.3 标本采集和处理 化疗结束后第7天处死大鼠摘除肝脏肿瘤组织，并置于10%福尔马林中固定后石蜡包埋。将瘤体石蜡标本块切片，厚度约5 μm。脱蜡后通过微波加热法修复抗原，予免疫组织化学染色。每例标本取2张切片，滴加CD34抗体和VEGF多抗各1滴。
1.3.4 VEGF检测 标本经染色封片后在显微镜下（×200）观察，细胞浆显示棕黄色颗粒为VEGF阳性细胞。每张切片选阳性表达最高的5个高倍视野（×400）照相，采用IPP 图像分析软件将VEGF蛋白染色的黄色区域作为AOI（area of interest）测定分析光密度。取5个视野的积分光密度（IOD）平均值作为该标本的表达强度计量值。
1.3.5 MVD检测 参照Weidner的标准计算各组肿瘤内的微血管密度（MVD）：低倍镜下（×100）寻找切片中棕黄染色密度最高的区域，即为富含血管组织的“热点”区。再在高倍镜下（×400）按染色为棕黄色的内皮细胞均记为一条独立血管的标准计算血管数目。每张切片分别选10个不同高倍视野计算MVD，取平均值。
1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组肝癌组织VEGF表达比较 细胞浆内染色为棕黄色为阳性。各组阳性染色深浅不均，肝动脉组较浅，外周静脉组次之，对照组染色最深。图像分析后比较，结果显示对照组VEGF表达明显高于外周静脉组和肝动脉组，且肝动脉组的肝癌VEGF表达明显低于外周静脉组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 各组肝癌组织CD34的表达及MVD结果比较 各组MVD具有相似的分布特征：肿瘤血管内皮细胞被染成棕黄色，且分布不均匀，坏死组织周围及肿瘤边缘MVD相对较高。肝动脉组的肝癌组织CD34蛋白表达和MVD最低，均明显低于外周静脉组和对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。而外周静脉组和对照组的CD34蛋白表达和MVD比较差异均无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
区域灌注化疗可以增加癌灶和靶组织器官的化疗药物浓度和/或降低外周血及其他组织的药物分布，是目前实体肿瘤化疗增效减毒的重要措施和手段之一[1-2]。肝动脉灌注化疗由于具有较明显的药动学优势，常作为肝癌化疗的常用手段[3-4]。原发性肝癌（HCC）是典型的富血供恶性肿瘤，它的发生、发展和转移时刻离不开肿瘤新生血管。肿瘤血管生成是HCC生长和转移的先决条件，如果肿瘤组织没有新生血管支持，则因凋亡和坏死而肿瘤不会大于1～2 mm[5]。而肝癌预后则与癌组织的血管生成调节因子水平和微血管密度（MVD）密切相关[6-7]。 VEGF目前被认为是体内最强的一种血管生成因子，其在肝细胞癌中呈高表达，与肿瘤的生长和预后紧密相关[8-10]。肿瘤微血管密度和VEGF的表达水平直接关联，提示VEGF使肿瘤血管生成会导致肝癌的浸润、生长转移和复发。5-FU经多年临床应用显示毒副作用较小的对肝癌细胞敏感性较好的药物，是肝癌化疗目前最常用的药物之一[11-12]。本实验以5-FU作为化疗代表药物进行研究，结果显示两个化疗组VEGF表达均明显低于对照组（P<0.05），提示5-FU能抑制肿瘤细胞合成与分泌VEGF，减低其对血管内皮细胞刺激所致的过度增生，同时通过控制VEGF分泌实现抑制肝癌细胞增殖，从而说明5-FU可使VEGF表达下调，使血管生成受抑制而控制肿瘤生长。肝动脉组的VEGF表达明显低于外周静脉组（P<0.05），说明肝动脉化疗比外周静脉给药更能有效减低VEGF表达。笔者既往的研究显示肝动脉灌注化疗的肝组织药物浓度明显高于经外周静脉给药，综合提示了不仅化疗可以抑制VEGF在肝癌组织中的表达，而且一定程度上5-FU的药物浓度和VEGF在肿瘤组织中表达水平呈负相关[1]。
MVD是反映肝细胞癌肿瘤血管生成情况的一项指标[13-14]。CD34则是目前最敏感的肿瘤血管标记物[15]。本课题采用CD34对血管内皮细胞进行标记来检测肿瘤组织中的的MVD。研究结果显示肝动脉组的肝癌组织MVD最低，均明显低于对照组和外周静脉化疗组，差异均有统计学意义（P<0.05）；但对照组和外周静脉组的MVD比较差异无统计学意义（P>0.05）。提示肝动脉灌注化疗可以有效降低肝癌组织的血管密度，而经外周静脉注射化疗则对降低肝细胞癌肿瘤微血管密度，抑制肿瘤血管生成效果不显著。综上所述，肝动脉灌注化疗能有效抑制肝癌组织VEGF表达，降低肿瘤MVD，从而抑制肿瘤血管生成。
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[6] Bao Y，Feng W M，Tang C W，et al.Endostatin inhibits angiogenesis in hepatocellular carcinoma after transarterial chemoembolization[J].Hepato-gastroenterology，2012，59（117）：1566-1568.
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[8] Sengupta B，A Siddiqi S.Hepatocellular carcinoma：important biomarkers and their significance in molecular diagnostics and therapy[J].Curr Med Chem，2012，19（22）：3722-3729.
[9] Yegin E G，Siykhymbayev A，Eren F，et al.Prognostic implication of serum vascular endothelial growth factor in advanced hepatocellular carcinoma staging[J].Ann Hepatol，2012，12（6）：915-925.
[10]崔旭辉，薛学义，许宁.沙利度胺抗肿瘤血管生成作用及临床研究进展[J].中国医学创新，2011，8（32）：158-160.
[11]汤钊猷.现代肿瘤学[M].上海：上海医科大学出版社，2000：94-95.
[12] Nagano H，Kobayashi S，Marubashi S，et al.Combined IFN-α and 5-FU treatment as a postoperative adjuvant following surgery for hepatocellular carcinoma with portal venous tumor thrombus[J].Exp Ther Med，2013，5（1）：3-10.
[13] Wang Q，Tian X，Zhang C，et al.Upregulation of vasohibin-1 expression with angiogenesis and poor prognosis of hepatocellular carcinoma after curative surgery[J].Medical Oncology，2012，29（4）：2727-2736.
[14]杜国芳，王丽红，裴毅.重组人血管内皮抑制素抗小鼠肝癌H22作用机制探讨[J].中国医学创新，2013，10（2）：14-15.
[15] Di Carlo I，Fraggetta F，Lombardo R，et al.CD 34 expression in chronic and neoplastic liver diseases[J].Panminerva Med，2002，44（4）：365-367.
（收稿日期：2013-10-23） （本文编辑：欧丽）