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[摘 要]建立栀子金花丸中黄芩苷的含量测定方法。方法 采用未涂层弹性融硅石英毛细管柱(60 cm× 75 μm,有效长度52 cm),以40 mmol·L-1硼砂溶液(pH9.0)为运行缓冲液;分离电压为12 kV;重力进样10 s(高度15 cm);检测波长为280 nm;以对硝基苯甲酸为内标。结果 黄芩苷质量浓度在7.5~52.5 μg·mL-1范围内具有良好的线性关系(r=0.999 6),黄芩苷平均回收率为96.7%,RSD值为1.62%(n=6)。结论 该方法专属性强,结果准确可靠、重现性好,可用于栀子金花丸的质量控制。
[关键词]毛细管电泳法;栀子金花丸;黄芩苷
中图分类号:TQ151.7文献标识码:A文章编号:1009-914X(2013)21-0247-01
栀子金花丸是由栀子、黄芩、黄连、黄柏等8味药材制成的中药成方制剂,具有清热泻火、凉血解毒之功效。临床用于肺胃热盛,口舌生疮,牙龈肿痛,目赤眩晕,咽喉肿痛,吐血衄血,大便秘结等的治疗。栀子金花丸的现行标准采用HPLC法测定制剂中栀子苷的含量,亦有其他文献报道采用HPLC法测定其中黄芩苷、栀子苷、绿原酸等成分的含量 ,但采用毛细管电泳法对栀子金花丸进行质量控制的方法尚未见报道。本文采用毛细管电泳法测定栀子金花丸中黄芩苷的含量,为更好地控制栀子金花丸质量提供了依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
CL1030型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司),KNAUER K2501紫外-可见检测器(德国),HW2000色谱工作站2.17版(南京千谱软件有限公司)。ORION MODEL 828型pH计(美国)。DL 360超声波清洗器[宁波石浦海天电子仪器厂,频率(4.5±0.225)kHZ,功率240 W]。未涂层弹性融硅石英毛细管柱(河北锐年永沣色谱器件有限公司)。
1.2 试药
黄芩苷(中国药品生物制品检定所,批号110715-200815)。栀子金花丸(山东孔圣堂制药有限公司,批号090457、090546、090741,规格 9 g·袋-1)。甲醇为色谱纯;硼砂、对硝基苯甲酸、NaOH均为分析纯;水为双蒸水。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 内标溶液的制备 精密称取对硝基苯甲酸适量,加水制成100 μg·mL-1的內标贮备液。
2.1.2 对照品贮备液的制备 精密称取在60 ℃减压干燥4 h的黄芩苷对照品15 mg,置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品贮备液(黄芩苷质量浓度为150 μg·mL-1)。
2.1.3 供试品溶液的制备 取栀子金花丸样品,研碎,取约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%(体积分数)甲醇50 mL,称定重量,超声处理40 min,放冷,再称定重量,用70%(体积分数)甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液10 mL至蒸发皿中,水浴挥干,再用70%(体积分数)甲醇溶解转移至10 mL量瓶中,加入内标溶液2.5 mL,用70%(体积分数)甲醇稀释至刻度,摇匀,0.45 μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。
2.1.4 阴性对照液的制备 取处方组成中除黄芩外的其余药材,制成不含黄芩的阴性对照品,按“2.1.3”项下方法处理,即得。
2.1.5 运行缓冲液的制备 精密称取硼砂适量,加水制成40 mmol·L-1硼砂溶液(pH=9.0),0.45 μm微孔滤膜滤过,作为运行缓冲液。
2.2 电泳条件
采用未涂层弹性融硅石英毛细管柱(60cm×75μm,有效长度52cm);以40 mmol·L-1硼砂溶液(pH9.0)为运行缓冲液;分离电压为12kV;重力进样10 s(高度15cm);检测波长为280nm;温度为室温,湿度小于70%。毛细管柱在使用前依次用0.1mol·L-1 NaOH溶液和水冲洗15~20min,再用运行缓冲液冲洗约5 min。以对硝基苯甲酸为内标。
2.3 方法学考察
2.3.1 标准曲线的制备 分别吸取对照品贮备液适量,加甲醇稀释成黄芩苷质量浓度为7.5、15.0、22.5、30.0、37.5、45.0、52.5μg·mL-1,内标物质量浓度为25.0μg·mL-1的溶液。依次重力进样10s,每个浓度测定3次以上。以对照品与内标峰面积的比值为纵坐标(Y),黄芩苷质量浓度(ρ)为横坐标进行线性回归,得回归方程Y=0.0350ρ-0.0383,r=0.999 6。表明黄芩苷在7.5~52.5μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.3.2 精密度试验 取质量浓度为30.0g·mL-1的黄芩苷对照品溶液,按“2.2”项下电泳条件,连续测定5次,记录峰面积并计算RSD值。结果黄芩苷峰面积的RSD=1.99%,表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液(批号090741),在0、2、4、6、8、12 h分别重力进样10 s,记录峰面积并计算RSD。结果黄芩苷峰面积的RSD=1.65%,表明供试品溶液在12h内稳定。
2.3.4 重复性试验 取同一批号(批号090741)的栀子金花丸样品6份,按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液,依法测定。结果栀子金花丸中黄芩苷的平均含量为1.63 mg·g-1,RSD=1.62%(n=6)。表明重复性良好。
2.4 样品测定
取栀子金花丸样品3批,按“2.1.3”项下方法处理后依法测定,记录峰面积,代入回归方程计算样品中黄芩苷的含量。
3 讨论
3.1 提取方法的选择
参考有关文献中黄芩苷的提取方法,本实验先后以50%(体积分数)甲醇、70%(体积分数)甲醇、甲醇为溶剂进行超声提取。结果表明,样品采用70%(体积分数)甲醇超声提取基本完全,且黄芩苷与杂质峰分离度较好。同时考察了不同提取时间(30、40、50min)对提取效率的影响,结果显示超声40min时提取率已达最高,超声时间延长而提取率并未提高。因此,确定以70%(体积分数)甲醇为提取溶剂,超声提取40min。
3.2 内标物的选择
毛细管电泳有重现性差的缺点,因此采用内标法定量。苯甲酸钠、对氨基苯甲酸以及对硝基苯甲酸在280 nm波长处均有吸收。预实验结果表明,苯甲酸钠在体系中不出峰;对氨基苯甲酸灵敏度低,且出峰时间与黄芩苷过于接近,容易产生干扰;对硝基苯甲酸峰型好,虽出峰时间与黄芩苷接近,但在样品中无干扰,故选其作为内标物。
3.3 运行缓冲液的选择黄芩苷极性较强,容易离子化
而在硼砂溶液中,黄芩苷中邻二羟基基团更易形成络离子,加快离子化。因此选择硼砂溶液为运行缓冲液,并通过实验确定其最佳浓度为40 mmol·L-1。
3.4 采用毛细管电泳法测定栀子金花丸中黄芩苷含量,与高效液相色谱法相比具有样品用量少,分析成本低等优点,并减少了对环境的污染,可用于栀子金花丸的质量控制
参考文献
[1] 国药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部[M].北京:中国医药科技出版社,2010:879-880.
[2] 高晓燕,卢建秋.栀子金花丸中栀子苷、黄芩苷、番泻苷A和番泻苷B的含量测定方法研究[J].中国中药杂志,2009,34(20):2649-2651.
[3] 宋粉云,龚红全,林琳,等.毛细管电泳法测定银黄胶囊及银黄颗粒中黄芩苷和绿原酸的含量[J].广东药学院学报,2007,23(3):231-233.
[关键词]毛细管电泳法;栀子金花丸;黄芩苷
中图分类号:TQ151.7文献标识码:A文章编号:1009-914X(2013)21-0247-01
栀子金花丸是由栀子、黄芩、黄连、黄柏等8味药材制成的中药成方制剂,具有清热泻火、凉血解毒之功效。临床用于肺胃热盛,口舌生疮,牙龈肿痛,目赤眩晕,咽喉肿痛,吐血衄血,大便秘结等的治疗。栀子金花丸的现行标准采用HPLC法测定制剂中栀子苷的含量,亦有其他文献报道采用HPLC法测定其中黄芩苷、栀子苷、绿原酸等成分的含量 ,但采用毛细管电泳法对栀子金花丸进行质量控制的方法尚未见报道。本文采用毛细管电泳法测定栀子金花丸中黄芩苷的含量,为更好地控制栀子金花丸质量提供了依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
CL1030型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司),KNAUER K2501紫外-可见检测器(德国),HW2000色谱工作站2.17版(南京千谱软件有限公司)。ORION MODEL 828型pH计(美国)。DL 360超声波清洗器[宁波石浦海天电子仪器厂,频率(4.5±0.225)kHZ,功率240 W]。未涂层弹性融硅石英毛细管柱(河北锐年永沣色谱器件有限公司)。
1.2 试药
黄芩苷(中国药品生物制品检定所,批号110715-200815)。栀子金花丸(山东孔圣堂制药有限公司,批号090457、090546、090741,规格 9 g·袋-1)。甲醇为色谱纯;硼砂、对硝基苯甲酸、NaOH均为分析纯;水为双蒸水。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 内标溶液的制备 精密称取对硝基苯甲酸适量,加水制成100 μg·mL-1的內标贮备液。
2.1.2 对照品贮备液的制备 精密称取在60 ℃减压干燥4 h的黄芩苷对照品15 mg,置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品贮备液(黄芩苷质量浓度为150 μg·mL-1)。
2.1.3 供试品溶液的制备 取栀子金花丸样品,研碎,取约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%(体积分数)甲醇50 mL,称定重量,超声处理40 min,放冷,再称定重量,用70%(体积分数)甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液10 mL至蒸发皿中,水浴挥干,再用70%(体积分数)甲醇溶解转移至10 mL量瓶中,加入内标溶液2.5 mL,用70%(体积分数)甲醇稀释至刻度,摇匀,0.45 μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。
2.1.4 阴性对照液的制备 取处方组成中除黄芩外的其余药材,制成不含黄芩的阴性对照品,按“2.1.3”项下方法处理,即得。
2.1.5 运行缓冲液的制备 精密称取硼砂适量,加水制成40 mmol·L-1硼砂溶液(pH=9.0),0.45 μm微孔滤膜滤过,作为运行缓冲液。
2.2 电泳条件
采用未涂层弹性融硅石英毛细管柱(60cm×75μm,有效长度52cm);以40 mmol·L-1硼砂溶液(pH9.0)为运行缓冲液;分离电压为12kV;重力进样10 s(高度15cm);检测波长为280nm;温度为室温,湿度小于70%。毛细管柱在使用前依次用0.1mol·L-1 NaOH溶液和水冲洗15~20min,再用运行缓冲液冲洗约5 min。以对硝基苯甲酸为内标。
2.3 方法学考察
2.3.1 标准曲线的制备 分别吸取对照品贮备液适量,加甲醇稀释成黄芩苷质量浓度为7.5、15.0、22.5、30.0、37.5、45.0、52.5μg·mL-1,内标物质量浓度为25.0μg·mL-1的溶液。依次重力进样10s,每个浓度测定3次以上。以对照品与内标峰面积的比值为纵坐标(Y),黄芩苷质量浓度(ρ)为横坐标进行线性回归,得回归方程Y=0.0350ρ-0.0383,r=0.999 6。表明黄芩苷在7.5~52.5μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.3.2 精密度试验 取质量浓度为30.0g·mL-1的黄芩苷对照品溶液,按“2.2”项下电泳条件,连续测定5次,记录峰面积并计算RSD值。结果黄芩苷峰面积的RSD=1.99%,表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液(批号090741),在0、2、4、6、8、12 h分别重力进样10 s,记录峰面积并计算RSD。结果黄芩苷峰面积的RSD=1.65%,表明供试品溶液在12h内稳定。
2.3.4 重复性试验 取同一批号(批号090741)的栀子金花丸样品6份,按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液,依法测定。结果栀子金花丸中黄芩苷的平均含量为1.63 mg·g-1,RSD=1.62%(n=6)。表明重复性良好。
2.4 样品测定
取栀子金花丸样品3批,按“2.1.3”项下方法处理后依法测定,记录峰面积,代入回归方程计算样品中黄芩苷的含量。
3 讨论
3.1 提取方法的选择
参考有关文献中黄芩苷的提取方法,本实验先后以50%(体积分数)甲醇、70%(体积分数)甲醇、甲醇为溶剂进行超声提取。结果表明,样品采用70%(体积分数)甲醇超声提取基本完全,且黄芩苷与杂质峰分离度较好。同时考察了不同提取时间(30、40、50min)对提取效率的影响,结果显示超声40min时提取率已达最高,超声时间延长而提取率并未提高。因此,确定以70%(体积分数)甲醇为提取溶剂,超声提取40min。
3.2 内标物的选择
毛细管电泳有重现性差的缺点,因此采用内标法定量。苯甲酸钠、对氨基苯甲酸以及对硝基苯甲酸在280 nm波长处均有吸收。预实验结果表明,苯甲酸钠在体系中不出峰;对氨基苯甲酸灵敏度低,且出峰时间与黄芩苷过于接近,容易产生干扰;对硝基苯甲酸峰型好,虽出峰时间与黄芩苷接近,但在样品中无干扰,故选其作为内标物。
3.3 运行缓冲液的选择黄芩苷极性较强,容易离子化
而在硼砂溶液中,黄芩苷中邻二羟基基团更易形成络离子,加快离子化。因此选择硼砂溶液为运行缓冲液,并通过实验确定其最佳浓度为40 mmol·L-1。
3.4 采用毛细管电泳法测定栀子金花丸中黄芩苷含量,与高效液相色谱法相比具有样品用量少,分析成本低等优点,并减少了对环境的污染,可用于栀子金花丸的质量控制
参考文献
[1] 国药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部[M].北京:中国医药科技出版社,2010:879-880.
[2] 高晓燕,卢建秋.栀子金花丸中栀子苷、黄芩苷、番泻苷A和番泻苷B的含量测定方法研究[J].中国中药杂志,2009,34(20):2649-2651.
[3] 宋粉云,龚红全,林琳,等.毛细管电泳法测定银黄胶囊及银黄颗粒中黄芩苷和绿原酸的含量[J].广东药学院学报,2007,23(3):231-233.