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摘要：目的 探讨膝关节骨性关节炎（KOA）患者中医体质类型与转化生长因子-β1（TGF-β1）表达水平的相关性。方法 将161例KOA患者作为病例组，进行中医9种体质类型问卷调查，随机选取50例非血缘关系健康志愿者为对照组，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验分别测定2组血清TGF-β1表达水平并进行比较。结果 与对照组比较，病例组血清TGF-β1水平较低，差异有统计学意义（P<0.05）。病例组气虚质KOA患者TGF-β1表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。特禀质与血瘀质患者均为0例，其他6种体质KOA患者TGF-β1表达水平与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 气虚质KOA的发病与TGF-β1的表达水平下降相关，TGF-β1表达下降可能是气虚质易发KOA的分子生物学机制之一。
关键词：中医体质类型；膝关节骨性关节炎；转化生长因子-β1；气虚质
Abstract：Objective To discuss the relationship between TCM constitutional types and the levels of transforming growth factor beta 1 （TGF-β1） of patients with knee osteoarthritis （KOA）. Methods A total of 161 patients with KOA as a case group filled out questionnaires about 9 TCM constitution types， and 50 cases of unrelated healthy volunteers were selected randomly as control group. The serum samples of two groups were collected. The levels of TGF-β1 were detected and compared by double antibody sandwich ELISA. Results Compared with the control group， the level of TGF-β1 in the case group decreased， with statistical significance （P<0.05）. Compared with the control group， the levels of TGF-β1 significantly decreased in the case group of qi deficiency type， with statistical significance （P<0.05）. There were no types of special intrinsic and blood stasis. Compared with the control group， the levels of TGF-β1 in the other six types of patients with KOA had no statistical significance （P>0.05）. Conclusion The incidence of KOA with qi deficiency type may be related to the decrease of TGF-β1 level. The decreasing level of TGF-β1 may be one of the mechanisms of molecular biology that qi deficiency was linked to KOA.
Key words：TCM constitution type；knee osteoarthritis；TGF-β1；qi deficiency constitution
膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种常见的退行性关节软骨疾病，属中医“骨痹”范畴。本病早期治疗方法甚多，但治疗效果并不理想。有研究显示，中医药依据整体观念防治KOA具有一定优势[1]，结合中医体质有可能为KOA的防治提供新的思路和方法。前期我们从中医体质学角度研究KOA发病特点，发现阳虚质、气虚质、气郁质是KOA的高发体质类型[2]。然而，KOA高发体质发病机理尚需进一步通过现代医学技术对其进行更深入的探讨。近年来，许多研究表明，转化生长因子-β1（TGF-β1）可以介导软骨合成、抑制胶原和蛋白多糖分解，在诱导软骨分化和维持软骨表型上起着重要作用[3]，已有研究显示TGF-β1表达量的变化与KOA的发病相关联[4]。因此，本研究以TGF-β1为切入点，从分子生物学角度阐释中医体质与KOA发病的相关性。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2011年6月-2013年1月甘肃省中医院关节骨科和骨伤病科住院患者161例作为病例组。其中男30例，女131例；平均年龄（50.24±10.70）岁；病程最短6个月，最长16年，平均（96.03±8.52）月。对照组为同期在敦煌路和建兰路社区随机选取的50例非血缘关系健康志愿者，其中男12名，女38名，平均年龄（53.09±9.55）岁。2组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 诊断与纳入标准
①符合中华医学会骨科学分会制定的“骨关节炎诊治指南（2007年版）”[5]中KOA诊断标准；②年龄40～70岁；③愿意接受本次科研调查，并签署知情同意书。
1.3 排除标准
①依从性差，未能按照要求回答者；②合并其他膝关节疾病，如骨肿瘤、关节结核、化脓性关节炎等；③诊断为创伤性关节炎者；④精神病、智力障碍等不能合作者；⑤采集项目不完整，缺项多于20%。 1.4 中医体质分类及判定标准
依据“中医体质分类与判定”标准[6]，分为平和质、气虚质、阳虚质、阴虚质、痰湿质、湿热质、血瘀质、气郁质、特禀质9种中医体质类型。平和质为正常体质，其他8种体质为偏颇体质。被调查者回答《中医体质分类与判定表》中的全部问题，每一问题按5级评分，计算原始分及转化分，进而确定体质类型。原始分=各条目分值相加，转化分=[（原始分-条目分）/（条目分×4）]×100。平和质判定标准：转化分≥60分、其他8种体质转化分均<30分判定为“是”，转化分≥60分、其他8种体质转化分均<40分判定为“基本是”，不满足上述条件者判定为“否”。偏颇体质判定标准：转化分≥40分判定为“是”，转化分30～39分判定为“倾向是”，转化分<30分判定为“否”。
1.5 调查内容
调查2组一般资料（年龄、性别、婚姻状况、文化程度、职业、吸烟史、过敏史）、既往健康情况、骨性关节炎相关因素及合并症情况、病程、中医体质相关要素等。
1.6 转化生长因子-β1检测
1.6.1 样本采集 2组均于清晨空腹抽取静脉血2 mL，室温静置10～20 min，2000～3000 r/min离心20 min，仔细收集上清液，-80 ℃保存备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
1.6.2 检测方法 ①标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设置标准品孔10孔，参照稀释及加样说明，稀释后各孔加样量均为50 ?L，浓度分别为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0 pg/mL。另设空白孔和待测样品孔。待测样品孔中先加样品稀释液40 ?L，再加待测样品10 ?L（样品最终稀释度为5倍）。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。参照试剂盒（北京凯诺春天生物科技有限公司，批号20llO301A）说明依次进行温育、洗涤和加酶。②显色：每孔先加入显色剂A 50 ?L，再加入显色剂B 50 ?L，震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。③终止：每孔加终止液50 ?L，终止反应。④上机测定：于全波长荧光酶标仪（Safire2，瑞士）上以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔吸光度（OD值）。⑤计算：以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品含量。
1.7 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。计量资料以 —x±s表示，符合正态分布者采用t检验，不符合正态分布者采用Wilcoxon秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病例组中医体质类型分布
161例KOA患者通过问卷调查判定中医体质类型，其中气虚质31例、阴虚质13例、阳虚质34例、痰湿质11例、湿热质19例、气郁质32例、平和质21例、血瘀质0例、特禀质0例。
3 讨论
KOA是中老年人常见的慢性进行性骨关节病，发病年龄呈年轻化趋势，病因和发病机制尚不明确，普遍认为其发病与年龄、性别、肥胖、炎症、遗传、环境等因素有关[7]。本病的主要病理基础为关节软骨的退行性变及代偿性的软骨下骨质硬化，而软骨的退行性变或损伤是不可逆的[8]，所以目前对本病的治疗仍具有一定的盲目性，治疗方法虽多，但效果均不理想。研究显示，TGF-β1可以促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化[9]，促进软骨特异性基质的合成，并保护软骨基质不被各种蛋白酶水解破坏[10]，对软骨代谢有正性调节作用。基于TGF-β1的生物学特性，其对软骨代谢及退变软骨的修复具有至关重要的作用。
本研究显示，病例组TGF-β1表达量低于对照组，表明KOA的发病与TGF-β1水平相关。7种体质类型KOA患者中，仅气虚质KOA患者TGF-β1表达量低于对照组（P<0.05），说明TGF-β1水平降低所致的软骨代谢异常可能是诱发气虚质KOA的主要分子机制之一。其他6种体质类型的KOA患者TGF-β1水平与对照组比较差异无统计学意义，说明并不是所有中医体质类型KOA的发病都与TGF-β1表达异常相关。可以推断，气虚质作为KOA的高发体质类型，其分子生物学机制可能与TGF-β1表达水平异常相关。
中医体质学说以中医理论为指导，研究人类各种体质的特征，体质类型的生理、病理特点，并以此分析疾病的反应状态。而KOA的发生与发展，都与遗传、环境等诸多因素有着密切的联系。气虚质是因元气不足，以气息低弱及机体、脏腑功能低下为主要特征的体质状态。气虚所致的机体功能减退可使各脏器细胞功能减退，阻碍了体内各种功能蛋白的产生及发挥作用。且膝关节软骨内无血液供应，其营养主要来自滑液，气虚则无力推动精、血、津液至全身各关节，使营养成分不能到达关节软骨，使其濡养不足；气虚又可累及中焦，化源不足，气化失司，导致筋脉失于濡养，关节失利，继而发病。TGF-β1是参与软骨代谢的重要生长因子，而气虚所致的脏腑功能低下可使TGF-β1的合成受到影响，由于精、血、津液对关节软骨的濡养不足，TGF-β1水平下降，使关节软骨周围的细胞外基质合成减少，同时大量Ⅰ、Ⅱ型胶原及非胶原蛋白被蛋白酶水解，都是导致关节软骨退行性变的内在因素。由此我们推断，TGF-β1代谢异常可能是气虚质者高发KOA的分子生物学机制。
本研究从分子生物学水平探讨KOA高发体质类型与TGF-β1的相关性，旨在更好地揭示KOA高发体质——气虚质的发病机理，为中医药“辨体论治”提供依据，为KOA的调体治疗奠定基础。但由于本研究调查对象样本及范围相对局限，其结果外推性有限，有待于进一步进行多中心、大样本的调查，尤其是运用现代分子生物学技术阐明其高发体质发病机理，为预防和治疗该病提供更好的依据。
参考文献：
[1] 赵振文，李盛华，柴喜平，等.陇中牌中药洗剂配合膝关节镜治疗膝骨性关节炎的临床对照研究[J].中国中医骨伤科杂志，2012，20（5）：22-23. [2] 周明旺，梁雄勇，李盛华，等.中医体质与甘肃地区膝骨性关节炎相关性研究[J].中国中医骨伤科杂志，2013，21（5）：22-24.
[3] Tachi K， Takami M， Sato H， et al. Enhancement of bone morphogenetic protein-2-induced ectopic bone formation by transforming growth factor-β1[J]. Tissue Eng Part A，2011， 17（5/6）：597-606.
[4] Hajishengallis G， Wang M， Liang S. Induction of distinct TLR2-mediated proinflammatory and proadhesive signaling pathways in response to Porphyromonas gingivalis fimbriae[J]. J Immunol， 2009，182（1）：6690-6696.
[5] 中华医学会骨科学分会.骨关节炎诊治指南（2007年版）[J].中华关节外科杂志，2007，1（4）：281-284.
[6] 中华中医药学会.中医体质分类与判定（ZYYXH/T157-2009）[J].世界中西医结合杂志，2009，4（4）：303-304.
[7] Lee R， Kean WF. Obesity and knee osteoarthritis[J]. Inflammo Pharmacology，2012，20（2）：53-58.
[8] 郭铁峰，周明旺，李盛华，等.转化生长因子-β1（TGF-β1）对软骨组织代谢影响的研究进展[J].中国组织工程研究，2013，17（15）：2827-2834.
[9] 易成清，曹云，马成辉，等.pAD-TGF-β1对骨组织工程种子细胞转归的转基因保护[J].国际骨科学杂志，2011，32（2）：127-128.
[10] 郭静，张文丽，李琪佳，等.基质金属蛋白酶9及TGF-β1 mRNA和蛋白在骨关节炎中的表达[J].中国修复重建外科杂志，2011，25（8）：992-997.
（收稿日期：2013-08-05）
（修回日期：2014-04-14；编辑：陈静）
关键词：中医体质类型；膝关节骨性关节炎；转化生长因子-β1；气虚质
Abstract：Objective To discuss the relationship between TCM constitutional types and the levels of transforming growth factor beta 1 （TGF-β1） of patients with knee osteoarthritis （KOA）. Methods A total of 161 patients with KOA as a case group filled out questionnaires about 9 TCM constitution types， and 50 cases of unrelated healthy volunteers were selected randomly as control group. The serum samples of two groups were collected. The levels of TGF-β1 were detected and compared by double antibody sandwich ELISA. Results Compared with the control group， the level of TGF-β1 in the case group decreased， with statistical significance （P<0.05）. Compared with the control group， the levels of TGF-β1 significantly decreased in the case group of qi deficiency type， with statistical significance （P<0.05）. There were no types of special intrinsic and blood stasis. Compared with the control group， the levels of TGF-β1 in the other six types of patients with KOA had no statistical significance （P>0.05）. Conclusion The incidence of KOA with qi deficiency type may be related to the decrease of TGF-β1 level. The decreasing level of TGF-β1 may be one of the mechanisms of molecular biology that qi deficiency was linked to KOA.
Key words：TCM constitution type；knee osteoarthritis；TGF-β1；qi deficiency constitution
膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种常见的退行性关节软骨疾病，属中医“骨痹”范畴。本病早期治疗方法甚多，但治疗效果并不理想。有研究显示，中医药依据整体观念防治KOA具有一定优势[1]，结合中医体质有可能为KOA的防治提供新的思路和方法。前期我们从中医体质学角度研究KOA发病特点，发现阳虚质、气虚质、气郁质是KOA的高发体质类型[2]。然而，KOA高发体质发病机理尚需进一步通过现代医学技术对其进行更深入的探讨。近年来，许多研究表明，转化生长因子-β1（TGF-β1）可以介导软骨合成、抑制胶原和蛋白多糖分解，在诱导软骨分化和维持软骨表型上起着重要作用[3]，已有研究显示TGF-β1表达量的变化与KOA的发病相关联[4]。因此，本研究以TGF-β1为切入点，从分子生物学角度阐释中医体质与KOA发病的相关性。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2011年6月-2013年1月甘肃省中医院关节骨科和骨伤病科住院患者161例作为病例组。其中男30例，女131例；平均年龄（50.24±10.70）岁；病程最短6个月，最长16年，平均（96.03±8.52）月。对照组为同期在敦煌路和建兰路社区随机选取的50例非血缘关系健康志愿者，其中男12名，女38名，平均年龄（53.09±9.55）岁。2组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 诊断与纳入标准
①符合中华医学会骨科学分会制定的“骨关节炎诊治指南（2007年版）”[5]中KOA诊断标准；②年龄40～70岁；③愿意接受本次科研调查，并签署知情同意书。
1.3 排除标准
①依从性差，未能按照要求回答者；②合并其他膝关节疾病，如骨肿瘤、关节结核、化脓性关节炎等；③诊断为创伤性关节炎者；④精神病、智力障碍等不能合作者；⑤采集项目不完整，缺项多于20%。 1.4 中医体质分类及判定标准
依据“中医体质分类与判定”标准[6]，分为平和质、气虚质、阳虚质、阴虚质、痰湿质、湿热质、血瘀质、气郁质、特禀质9种中医体质类型。平和质为正常体质，其他8种体质为偏颇体质。被调查者回答《中医体质分类与判定表》中的全部问题，每一问题按5级评分，计算原始分及转化分，进而确定体质类型。原始分=各条目分值相加，转化分=[（原始分-条目分）/（条目分×4）]×100。平和质判定标准：转化分≥60分、其他8种体质转化分均<30分判定为“是”，转化分≥60分、其他8种体质转化分均<40分判定为“基本是”，不满足上述条件者判定为“否”。偏颇体质判定标准：转化分≥40分判定为“是”，转化分30～39分判定为“倾向是”，转化分<30分判定为“否”。
1.5 调查内容
调查2组一般资料（年龄、性别、婚姻状况、文化程度、职业、吸烟史、过敏史）、既往健康情况、骨性关节炎相关因素及合并症情况、病程、中医体质相关要素等。
1.6 转化生长因子-β1检测
1.6.1 样本采集 2组均于清晨空腹抽取静脉血2 mL，室温静置10～20 min，2000～3000 r/min离心20 min，仔细收集上清液，-80 ℃保存备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
1.6.2 检测方法 ①标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设置标准品孔10孔，参照稀释及加样说明，稀释后各孔加样量均为50 ?L，浓度分别为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0 pg/mL。另设空白孔和待测样品孔。待测样品孔中先加样品稀释液40 ?L，再加待测样品10 ?L（样品最终稀释度为5倍）。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。参照试剂盒（北京凯诺春天生物科技有限公司，批号20llO301A）说明依次进行温育、洗涤和加酶。②显色：每孔先加入显色剂A 50 ?L，再加入显色剂B 50 ?L，震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。③终止：每孔加终止液50 ?L，终止反应。④上机测定：于全波长荧光酶标仪（Safire2，瑞士）上以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔吸光度（OD值）。⑤计算：以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品含量。
1.7 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。计量资料以 —x±s表示，符合正态分布者采用t检验，不符合正态分布者采用Wilcoxon秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病例组中医体质类型分布
161例KOA患者通过问卷调查判定中医体质类型，其中气虚质31例、阴虚质13例、阳虚质34例、痰湿质11例、湿热质19例、气郁质32例、平和质21例、血瘀质0例、特禀质0例。
3 讨论
KOA是中老年人常见的慢性进行性骨关节病，发病年龄呈年轻化趋势，病因和发病机制尚不明确，普遍认为其发病与年龄、性别、肥胖、炎症、遗传、环境等因素有关[7]。本病的主要病理基础为关节软骨的退行性变及代偿性的软骨下骨质硬化，而软骨的退行性变或损伤是不可逆的[8]，所以目前对本病的治疗仍具有一定的盲目性，治疗方法虽多，但效果均不理想。研究显示，TGF-β1可以促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化[9]，促进软骨特异性基质的合成，并保护软骨基质不被各种蛋白酶水解破坏[10]，对软骨代谢有正性调节作用。基于TGF-β1的生物学特性，其对软骨代谢及退变软骨的修复具有至关重要的作用。
本研究显示，病例组TGF-β1表达量低于对照组，表明KOA的发病与TGF-β1水平相关。7种体质类型KOA患者中，仅气虚质KOA患者TGF-β1表达量低于对照组（P<0.05），说明TGF-β1水平降低所致的软骨代谢异常可能是诱发气虚质KOA的主要分子机制之一。其他6种体质类型的KOA患者TGF-β1水平与对照组比较差异无统计学意义，说明并不是所有中医体质类型KOA的发病都与TGF-β1表达异常相关。可以推断，气虚质作为KOA的高发体质类型，其分子生物学机制可能与TGF-β1表达水平异常相关。
中医体质学说以中医理论为指导，研究人类各种体质的特征，体质类型的生理、病理特点，并以此分析疾病的反应状态。而KOA的发生与发展，都与遗传、环境等诸多因素有着密切的联系。气虚质是因元气不足，以气息低弱及机体、脏腑功能低下为主要特征的体质状态。气虚所致的机体功能减退可使各脏器细胞功能减退，阻碍了体内各种功能蛋白的产生及发挥作用。且膝关节软骨内无血液供应，其营养主要来自滑液，气虚则无力推动精、血、津液至全身各关节，使营养成分不能到达关节软骨，使其濡养不足；气虚又可累及中焦，化源不足，气化失司，导致筋脉失于濡养，关节失利，继而发病。TGF-β1是参与软骨代谢的重要生长因子，而气虚所致的脏腑功能低下可使TGF-β1的合成受到影响，由于精、血、津液对关节软骨的濡养不足，TGF-β1水平下降，使关节软骨周围的细胞外基质合成减少，同时大量Ⅰ、Ⅱ型胶原及非胶原蛋白被蛋白酶水解，都是导致关节软骨退行性变的内在因素。由此我们推断，TGF-β1代谢异常可能是气虚质者高发KOA的分子生物学机制。
本研究从分子生物学水平探讨KOA高发体质类型与TGF-β1的相关性，旨在更好地揭示KOA高发体质——气虚质的发病机理，为中医药“辨体论治”提供依据，为KOA的调体治疗奠定基础。但由于本研究调查对象样本及范围相对局限，其结果外推性有限，有待于进一步进行多中心、大样本的调查，尤其是运用现代分子生物学技术阐明其高发体质发病机理，为预防和治疗该病提供更好的依据。
参考文献：
[1] 赵振文，李盛华，柴喜平，等.陇中牌中药洗剂配合膝关节镜治疗膝骨性关节炎的临床对照研究[J].中国中医骨伤科杂志，2012，20（5）：22-23. [2] 周明旺，梁雄勇，李盛华，等.中医体质与甘肃地区膝骨性关节炎相关性研究[J].中国中医骨伤科杂志，2013，21（5）：22-24.
[3] Tachi K， Takami M， Sato H， et al. Enhancement of bone morphogenetic protein-2-induced ectopic bone formation by transforming growth factor-β1[J]. Tissue Eng Part A，2011， 17（5/6）：597-606.
[4] Hajishengallis G， Wang M， Liang S. Induction of distinct TLR2-mediated proinflammatory and proadhesive signaling pathways in response to Porphyromonas gingivalis fimbriae[J]. J Immunol， 2009，182（1）：6690-6696.
[5] 中华医学会骨科学分会.骨关节炎诊治指南（2007年版）[J].中华关节外科杂志，2007，1（4）：281-284.
[6] 中华中医药学会.中医体质分类与判定（ZYYXH/T157-2009）[J].世界中西医结合杂志，2009，4（4）：303-304.
[7] Lee R， Kean WF. Obesity and knee osteoarthritis[J]. Inflammo Pharmacology，2012，20（2）：53-58.
[8] 郭铁峰，周明旺，李盛华，等.转化生长因子-β1（TGF-β1）对软骨组织代谢影响的研究进展[J].中国组织工程研究，2013，17（15）：2827-2834.
[9] 易成清，曹云，马成辉，等.pAD-TGF-β1对骨组织工程种子细胞转归的转基因保护[J].国际骨科学杂志，2011，32（2）：127-128.
[10] 郭静，张文丽，李琪佳，等.基质金属蛋白酶9及TGF-β1 mRNA和蛋白在骨关节炎中的表达[J].中国修复重建外科杂志，2011，25（8）：992-997.
（收稿日期：2013-08-05）
（修回日期：2014-04-14；编辑：陈静）